和胃安神方治療失眠的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接機制研究

王亮 王鵬 侯曉圓 李晨 張俊修 李紹旦 楊明會

摘要 目的：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接研究和胃安神方（HWASF）治療失眠的作用機制。方法：采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），篩選出HWASF主要有效成分和各中藥靶蛋白;在生物信息綜合數(shù)據(jù)庫（GeneCards）搜索失眠疾病靶點;利用R語言將HWASF-Insomnia靶點取交集并繪制韋恩圖，上傳STRING和Cytoscape構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖;交集靶點投射到Metascape基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析;采用Cytoscape插件構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖;以蛋白自帶配體為中心完成分子對接等可視化操作、構(gòu)象評分和結(jié)合模式分析。結(jié)果：通過TCMSP并結(jié)合文獻，篩選出HWASF中19個有效成分與134個中藥靶點數(shù);GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得 074個失眠靶點，經(jīng)韋恩圖得到49個HWASF-Insomnia共有靶點;GO富集發(fā)現(xiàn)HWASF治療失眠可能參與第二信使介導(dǎo)信號傳輸、凋亡等多項生物過程，體現(xiàn)突觸后膜整體成分、細胞體等多種細胞功能，包括腎上腺素能受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等多類分子功能;篩選其靶點富集于多巴胺能突觸、5-羥色胺能突觸等多條KEGG信號通路，涉及藥物代謝、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞凋亡、免疫等功能。分子對接發(fā)現(xiàn)HWASF可通過山柰酚等有效成分作用于RELA等失眠靶點達到治療失眠作用。結(jié)論：HWASF治療失眠的作用機制可能與其調(diào)控RELA、TNF、FOS等核心基因及其通路的多靶點、多成分、多途徑有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞 和胃安神方;失眠;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;作用機制;中藥藥理;山柰酚

Mechanism of Hewei Anshen Formula in Treating Insomnia based on Network Pharmacology and Molecular Docking

WANG Liang1，2，3，WANG Peng1，2，3，HOU Xiaoyuan1，2，3，LI Chen1，2，3，ZHANG Junxiu2，3，LI Shaodan2，3，YANG Minghui2，3

（ Chinese People′s Liberation Army Medical School，，Beijing 100853，China; 2 Department of Traditional Chinese Medicine，Chinese People′s Liberation Army General Hospital，Beijing 100853，China; 3 Department of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)irst Medical Center of Chinese People′s Liberation Army General Hospital，Beijing 100853，China）

Abstract Objective：To investigate the mechanism of Hewei Anshen Formula（HWASF） in the treatment of insomnia through network pharmacology and molecular docking.Methods：The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） was used to screen the main active ingredients of HWASF and target proteins of each Chinese medicine.The insomnia targets were searched in Genecards.The HWASF-insomnia targets intersected by R language and the Venn diagram was drawn and uploaded into STRING and Cytoscape to construct the protein-protein interaction（PPI） network.The intersection targets were projected to Metascape for Gene Ontology（GO） and Eyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis.The plugin of Cytoscape was adopted to construct regulatory network.By molecular docking，visualization operations，conformational scoring and binding mode analysis were completed with protein self-ligands as the center.Results：Nineteen active ingredients and 134 Chinese medicine targets in HWASF were screened through TCMSP combined with literature.A total of ?074 insomnia targets were obtained from GeneCards，and 49 HWASF-insomnia common targets were obtained by the Venn diagram.GO enrichment analysis found HWASF in the treatment of insomnia may be involved in a number of biological processes such as second messenger-mediated signal transduction and apoptosis，reflecting various cellular functions such as those of the overall composition of postsynaptic membrane and cell body，which include adrenergic receptor activity，neurotransmitter receptors activity and other molecular functions.The screened targets were enriched in multiple KEGG signaling pathways such as dopaminergic and serotonergic synapses，involving drug metabolism，neurotransmitter function，apoptosis，and immunity.Molecular docking indicated that HWASF treated insomnia by acting on insomnia targets such as RELA via active ingredients such as kaempferol.Conclusion：The mechanism of HWASF in the treatment of insomnia may be closely related to its multi-target，multi-component and multi-pathway regulation of core genes such as RELA，TNF，and FOS and their pathways.

Keywords Hewei Anshen Formula; Insomnia; Network pharmacology; Molecular docking; Mechanism; Pharmacology of Chinese medicine; Kaempferol

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.013

失眠（Insomnia）是指睡眠啟動困難、難以維持睡眠或清晨醒來無法恢復(fù)睡眠，導(dǎo)致與日間功能受損相關(guān)的認知能力下降、疲勞或情緒障礙等，表現(xiàn)出對睡眠時間或質(zhì)量的不滿意[1-3]。目前，臨床治療失眠常用如短/中效苯二氮艸卓類受體激動劑、褪黑素受體激動劑、鎮(zhèn)靜藥和抗抑郁藥等藥物，但存在反跳性失眠、日間嗜睡、認知功能損害、依賴成癮等危害[1]。在人群中失眠發(fā)病率較高，特別是隨著現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣的不斷改變，胃腸道負擔(dān)加重，易影響睡眠時間和質(zhì)量[4-5]。

中醫(yī)學(xué)將失眠納入“不寐”范疇，多為飲食不節(jié)、情志所傷、勞逸失調(diào)、久病體虛等因素引起臟腑氣血陰陽失調(diào)、陽不入陰而發(fā)病。早在兩千多年前《素問·逆調(diào)論篇》就提出“胃不和則臥不安”理論，并運用半夏秫米湯治療“胃不和則臥不安”型不寐。既往研究表明，以半夏秫米湯為基礎(chǔ)的和胃安神方由半夏、薏苡仁、白術(shù)、茯神、石菖蒲、遠志、炒酸棗仁、柏子仁等配伍組成，其臨床治療失眠療效顯著，總有效率達90.7%，且隨訪失眠復(fù)發(fā)率低[6-8]。但中藥復(fù)方和胃安神方成分較復(fù)雜，并不能較為全面地反映其治療失眠的藥理作用和通路機制。

作為大數(shù)據(jù)時代系統(tǒng)藥物研究的新興、交叉、前沿學(xué)科，中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)突破傳統(tǒng)“一藥一靶點”研究方法，從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的角度出發(fā)，探析藥物及疾病之間的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律（如挖掘中藥及其復(fù)方的活性化合物、闡明其整體作用機制、解析其藥物組合和方劑配伍規(guī)律等），為中藥及其復(fù)方系統(tǒng)研究提供了新思路，為中藥新藥研發(fā)、臨床合理用藥等提供了新的科技支撐[9-11]。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，系統(tǒng)分析其主要活性成分、核心作用靶點，闡釋和胃安神方治療失眠的藥理作用和分子機制，為進一步探究其臨床、實驗和數(shù)據(jù)挖掘提供參考依據(jù)。

資料與方法

1. 資料與軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），生物信息綜合數(shù)據(jù)庫（GeneCards，http：//www.genecards.org/），在線UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），Venny 2.1在線平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫（STRING 11.0，https：//string-db.org/cgi/input.pl），基因注釋在線平臺（Metascape，https：//metascape.org/gp/index.html），蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PROTEIN DATA BANK，http：//www.wwpdb.org/），ZINC數(shù)據(jù)庫（ZINC，http：//zinc.docking.org），Cytoscape 3.7.2版軟件，AUTODOCK和PYMOL軟件[11-12]。

1.2 篩選HWASF有效成分及其靶點

通過TCMSP查找各中藥有效成分的作用靶點，參照藥代動力學(xué)的吸收、分布、代謝和排泄（Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion，ADME）特性，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為條件進行篩選，并結(jié)合文獻對未查詢到的中藥成分進行補充[13]。借助Uniprot數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)信息對篩選得到的中藥有效成分進行靶點注釋，同時篩去Uniprot數(shù)據(jù)庫中不包含的作用靶點，合并上述靶點刪去重復(fù)值。根據(jù)已經(jīng)獲得的HWASF-Insomnia共同靶點，并結(jié)合文獻反向篩選中藥活性成分[14]。

1.3 檢索失眠疾病靶點

在GeneCards中數(shù)據(jù)庫以“Insomnia”為關(guān)鍵詞，搜索失眠相關(guān)疾病靶點。

1.4 構(gòu)建HWASF-Insomnia的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

利用R語言將HWASF-Insomnia靶點取交集，繪制二者交集靶點韋恩圖，將篩選得到的交集靶點上傳至在線STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，并使用Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建并繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體注釋和京都基因和基因組百科全書信號通路富集分析

將HWASF-Insomnia交集靶基因投射到Metascape數(shù)據(jù)庫進行基因本體（Gene Ontology，GO）注釋和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析，導(dǎo)入數(shù)據(jù)后，設(shè)置P<0.01，對獲得數(shù)據(jù)可視化分析。

1.6 構(gòu)建HWASF-Insomnia的“成分-靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)圖

采用Cytoscape 3.7.2軟件導(dǎo)入交集數(shù)據(jù)庫“成分代碼-靶點基因symbol”數(shù)據(jù)，構(gòu)建以中藥名稱、交集靶基因和藥物有效活性成分為節(jié)點的中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。并應(yīng)用其內(nèi)置插件Network analyzer，分析各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)值，根據(jù)Degree、Betweeness、Closeness等參數(shù)值確定核心成分與核心靶點，并以連接度值大小取其前5位。

1.7 分子對接

通過PROTEIN DATA BANK、ZINC查找受體蛋白和配體小分子，并下載其3D結(jié)構(gòu)，借助于AUTODOCK和PYMOL軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進行去水、加氫及計算電荷處理，再以蛋白自帶配體為中心構(gòu)建分子對接空間結(jié)構(gòu)等可視化操作，進行構(gòu)象評分和結(jié)合模式分析。

2 結(jié)果

2. HWASF有效成分篩選結(jié)果

篩選出HWASF有效成分：白術(shù)23個，柏子仁46個，半夏172個，茯苓30個，石菖蒲75個，酸棗仁32個，薏苡仁76個，遠志55個。對HWASF各成分作用靶點進行靶點注釋結(jié)果如下：白術(shù)18個，柏子仁40個，半夏127個，茯苓21個，石菖蒲103個，酸棗仁46個，薏苡仁62個，遠志46個，合并上述靶點刪去重復(fù)值共有靶點134個。得到HWASF各中藥活性成分19個。見表1。

2.2 獲得Insomnia疾病靶點

在Genecards中以“Insomnia”為關(guān)鍵詞搜索失眠疾病靶點得到2 564個靶點基因，取0.98為“relevance score”中位數(shù)值，并作為卡值，篩選疾病靶點，保留大于中位數(shù)值靶點，最終得到失眠相關(guān)靶點數(shù)為 074個。

2.3 構(gòu)建HWASF-Insomnia的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

使用Venny在線平臺繪制HWASF-Insomnia共同靶點韋恩圖，得到49個共同靶點，藍色代表HWASF有效成分和靶標蛋白，黃色代表Insomnia靶標蛋白，中間代表二者交集靶點。見圖1。圖節(jié)點（node）大小、形狀變化和顏色深淺反映自由度（Degree）值大小，Degree越大，說明節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越處于核心地位。見圖2。

2.4 GO注釋與KEGG富集分析

將49個HWASF-Insomnia交集靶基因輸入到Metascape，對GO注釋和KEGG信號通路分析的結(jié)果進行可視化分析。

GO富集注釋分析結(jié)果顯示，生物過程（Biological Process，BP）中說明HWASF治療失眠與第二信使介導(dǎo)的信號傳輸、對脂多糖的反應(yīng)、對氮化合物的細胞反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、細胞成分運動的正調(diào)控、凋亡信號通路、反應(yīng)性有毒物質(zhì)、RNA聚合酶Ⅰ對pri-miRNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、突觸信號、氧水平的反應(yīng)等調(diào)控有關(guān)。而細胞組分（Cell Component，CC）涉及膜筏、突觸后膜的整體成分、細胞體、軸突、受體復(fù)合物、突觸后特化膜、質(zhì)膜的外部、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細胞質(zhì)的核周區(qū)域、神經(jīng)投射細胞質(zhì)等。分子功能（Molecular Function，MF）包括腎上腺素能受體活性、核心啟動子序列特異性DNA結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚活性、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶2結(jié)合、單胺跨膜轉(zhuǎn)運蛋白激活、肽結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等分子活性調(diào)節(jié)。見圖3。

篩選得到的前20條KEGG信號通路富集，涉及到癌癥、藥物代謝、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞凋亡、免疫等，排名靠前包括癌癥通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、HIF-1信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、非洲錐蟲病、雌激素信號通路、多巴胺能突觸、5-羥色胺能突觸等通路。見表2。

2.5 構(gòu)建HWASF-Insomnia的“成分-靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)圖

構(gòu)建“成分代碼-靶點基因symbol”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖4。分析圖4各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)值，根據(jù)Degree、Betweeness、Closeness等參數(shù)值確定核心成分與核心靶點，并以連接度值大小取其前5位，HWASF主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)見表3。失眠主要作用靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)見表4。

2.6 分子對接

根據(jù)表3網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)發(fā)現(xiàn)山柰酚連接度最高（連接度為16）是HWASF主要成分，RELA等為主要作用靶點（連接度為20），因此以山柰酚作為配體小分子，RELA、TNF、FOS、TNFRSF1A和TP53作為受體蛋白進行分子對接對象。借助于PROTEIN DATA BANK查找受體蛋白的編碼分別為1fos、1k3z、1oqe、7k7a;由ZINC查找配體小分子山柰酚，使用AUTODOCK軟件進行分子對接，運用PYMOL軟件將對接結(jié)果可視化，得到分子對接模式圖;從對接結(jié)果和分子模式圖中發(fā)現(xiàn)山柰酚可以結(jié)合于1fos、1k3z、1oqe、7k7a等受體蛋白，主要通過DT-36/DG-8、ILE-67/ARG-295/GLN-69/HIS-296/ARG-302、ASN-94/MET-95、LEU-232/ARG-235等氨基酸殘基與山柰酚發(fā)生氫鍵作用，氫鍵的結(jié)合能分別為-4.6、-4.54、-4.63和-4.16。見圖5。HWASF可能通過山柰酚等活性成分作用于RELA等靶點，從而達到治療失眠的作用。

3 討論

和胃安神方之立論基礎(chǔ)源于“胃不和”與“臥不安”經(jīng)典論述。在《醫(yī)學(xué)心悟》“不得眠”篇中提到“不得眠……其狂亂不得眠者，陽明胃熱故也”和“胃受熱邪故不和……故不眠”。方中各藥對配伍是其治療失眠的組方基礎(chǔ)，其中半夏與薏苡仁、白術(shù)與茯苓配伍起到益氣健脾、祛濕和胃的作用，石菖蒲與炙遠志配伍側(cè)重于祛痰開竅、化濕和胃;炒棗仁與柏子仁配伍兼有養(yǎng)血安神、寧心益智的作用，共奏調(diào)和脾胃、祛痰化濕、寧心安神的功效[15]。

本研究從HWASF中篩選出山柰酚、花生四烯酸、卡文定堿、黃芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、常春藤皂苷元等19個有效成分，其靶點主要影響AKT1、VEGFA、FOS、PPARG、NOS3等與失眠相關(guān)靶點，其睡眠調(diào)節(jié)主要參與第二信使介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、對脂多糖的反應(yīng)、對氮化合物的細胞反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、細胞成分運動的正調(diào)控、凋亡信號通路、反應(yīng)性有毒物質(zhì)、RNA聚合酶Ⅰ對pri-miRNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、氧水平的反應(yīng)等生物過程;涉及膜筏、突觸后膜的整體成分、細胞體、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細胞質(zhì)的核周區(qū)域、神經(jīng)投射細胞質(zhì)等細胞組分;包括腎上腺素能受體活性、核心啟動子序列特異性DNA結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、蛋白質(zhì)同二聚活性、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶2結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等分子功能。前20條KEGG富集涉及癌癥通路、HIF-1信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、雌激素信號通路、多巴胺能突觸、5-羥色胺能突觸、AMPK信號通路等經(jīng)典信號通路。分子對接發(fā)現(xiàn)以山柰酚為配體小分子與RELA、TNF、FOS、TP53等受體蛋白進行分子對接的氫鍵、結(jié)合能穩(wěn)定，初步驗證了和胃安神方治療失眠可能的分子機制。

研究發(fā)現(xiàn)，睡眠不足會嚴重影響消化系統(tǒng)，體現(xiàn)了睡眠與脾胃功能之間的密切關(guān)系。研究表明，睡眠剝奪與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，自噬作為提高生存率的自衛(wèi)策略可由氧化應(yīng)激觸發(fā)[16]，而AKT/mTOR信號通路是自噬的重要調(diào)節(jié)劑，在很多臟器組織AKT1中廣泛存在，主要調(diào)控細胞增殖和生長。VEGFA，MCH神經(jīng)元活化后的細胞活化評估顯示了內(nèi)皮細胞的MCH神經(jīng)元依賴性調(diào)節(jié)。MCH神經(jīng)元表達VEGFA，而阻斷VEGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)會減弱MCH神經(jīng)元激活的瘦素致敏作用[17]。研究證明，在睡眠-覺醒周期中大腦區(qū)域內(nèi)c-fos參與睡眠調(diào)節(jié)作用[18]。過氧化物酶體增殖物激活受體是一種新型類固醇受體，被其配體激活后可與特異的DNA反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄和表達[19]。在大腦的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞以及腦血管內(nèi)皮細胞都有表達，其中在額葉皮質(zhì)層的所有層神經(jīng)元、海馬和杏仁核有高度表達[20]。NOS3參與精氨酸和脯氨酸代謝，并催化生成一氧化氮（NO），而NO是一種反應(yīng)性自由基，在神經(jīng)傳遞、抗菌和抗氧化等多種生理病理過程中起著生物調(diào)節(jié)劑的作用[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)REM睡眠與大腦海馬體細胞凋亡、成活的分子途徑密切相關(guān)[23]。睡眠時間錯誤會破壞人類轉(zhuǎn)錄組的晝夜節(jié)律[24]，抑制與基因表達和翻譯調(diào)控相關(guān)的基因，并增強與分解代謝過程相關(guān)的基因活性、ATP酶活性和過氧化物酶活性調(diào)控等。間歇性缺氧與睡眠密切相關(guān)，缺氧狀態(tài)可修飾RNA聚合酶Ⅱ（特別在海馬CA1區(qū)和前額葉皮層）調(diào)節(jié)基因表達[25]。多巴胺能突觸[26]、5-HT能突觸[27]在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）特別是睡眠節(jié)律調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用。AMPK途徑可抑制線粒體生物發(fā)生，增加細胞凋亡[28]，而AMPK是維持適當睡眠體系結(jié)構(gòu)和睡眠剝奪后的睡眠恢復(fù)所必需的[29]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，構(gòu)建和胃安神方治療失眠“中藥復(fù)方成分-疾病靶點-作用通路”的生物網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)和胃安神方中有19種有效成分，與失眠共有49個交集靶點，并涉及134條相關(guān)通路;結(jié)合文獻分析和課題組前期基礎(chǔ)實驗，發(fā)現(xiàn)和胃安神方通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）及Bcl-2、Bax等細胞凋亡因子表達，參與治療失眠的細胞凋亡等通路的機制調(diào)控[30-32]，初步驗證了和胃安神方治療失眠可能的藥理、靶點、通路及分子機制，體現(xiàn)了中藥組方多成分、多靶點、多途徑的作用特點。由于和胃安神方組成和成分較復(fù)雜，后期將著重運用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜等現(xiàn)代藥理學(xué)方法分析其主要活性成分的關(guān)鍵作用靶點和作用機制，為進一步實驗驗證、潛在藥理學(xué)機制探索及臨床拓展應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

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（2021-02-15收稿 本文編輯：楊燕）