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    青藤堿調節(jié)胃癌細胞誘發(fā)的巨噬細胞M2 極化的機制

    2022-05-21 09:25:12陳昳菲任牡丹盧新蘭盧桂芳李雅睿和水祥
    關鍵詞:青藤共培養(yǎng)表型

    陳昳菲,任牡丹,盧新蘭,盧桂芳,張 丹,趙 艷,李雅睿,郭 丹,和水祥

    (西安交通大學第一附屬醫(yī)院消化內科,陜西西安 710061)

    胃癌是全球第五大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因[1]。由于內鏡下或外科手術切除等治療方式的發(fā)展,早期胃癌患者的5 年生存率可達95%以上,但我國大多數(shù)患者在診斷時已是中晚期[2]。晚期胃癌的預后較差,姑息性化療是主要的治療方法,臨床仍需要探索更多新的治療辦法來改善生存期,提高生存率[3]。

    越來越多的證據(jù)支持,腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)中的腫瘤相關細胞(TAM)的高密度與胃癌患者預后不良之間存在正相關[4]。TAM通常起源于循環(huán)單核細胞,可以在TME 內通過腫瘤細胞產生的細胞外信號募集,這些信號可能將TAM從抑制腫瘤的M1 表型轉化為促進腫瘤的M2 表型巨噬細胞[5-6],而巨噬細胞反過來影響腫瘤的生長[7-8]。值得注意的是,很多研究都證明,驅動巨噬細胞M2極化可能促進胃癌細胞的增殖或者調節(jié)其活力、侵襲和遷移[9-11]。

    青藤堿(sinomenine, SIN)是一種從中藥植物青藤中提取的生物活性堿化合物,鹽酸青藤堿是其水溶性鹽酸鹽(圖1A)。SIN 具有不同的治療特性,包括抗炎和免疫抑制活性[12],還是一種多靶點抗腫瘤天然物質[13]。已有研究證明了SIN 在胃癌中的關鍵作用[14-15],同時它還可以調節(jié)巨噬細胞亞群的分泌[16],暗示了SIN 通過影響腫瘤微環(huán)境而在胃癌進展中發(fā)揮潛在作用。但是,SIN 在胃癌中的作用仍是不清楚的。本文旨在研究SIN 在胃癌細胞增殖和遷移中的作用,并通過探索其在胃癌細胞誘導的巨噬細胞極化中的作用及機制,闡述SIN 對胃癌腫瘤微環(huán)境的影響,進一步探討其在胃癌治療中的潛在價值。

    1 材料與方法

    1.1 細胞系及試劑

    人胃癌細胞BGC-823 與MKN-45(上海生命科學研究院),SIN(湖南正清藥業(yè)公司),二甲基亞砜(DMSO)(上海碧云天),DMEM 培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清(杭州四季青),胰蛋白酶(Sigma),CCK-8 試劑盒(上海碧云天),SDS-PAGE 凝膠試劑盒(上海碧云天),核蛋白提取試劑盒(上海碧云天),BCA 二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒(上海碧云天),蛋白質多克隆 一 抗Ki67、STAT-6、p-STAT6、C/EBPβ、p-C/EBPβ、Lamin B(Abcam 公司)、辣根過氧化物酶標記的二抗(壯志生物公司),Transwell 共培養(yǎng)室(Corning 公司),PMA 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(Sigma 公司),膠原酶細胞解離液(Invitrogen 公司),巨噬細胞標記物抗人抗體CD14(APC/Cy7,Biolegend)、CD163(BV510,BD Bioscience BD OptiBuild)、CD206(PE-Cy5,BD Biosciences, BD Pharmigen)、LIVE/DEAD ?Viability/Cytotoxicity Kit(Invitrogen公 司),細 胞 總RNA 提 取 試 劑Trizol(Invitrogen 公司),限制性內切酶、凝膠回收試劑盒、TaqDNA 聚合酶(TaKaRa 公司),PCR 反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒及引物(TaKaRa 公司),Human IL-6 ELISA 試劑盒(碧云天)。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)及STAT6 重組載體的構建 人胃癌細胞BGC-823、MKN-45 和單核細胞系THP-1采用含100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)于50 mL/L CO2、濕度95%、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中。重組載體構建:Trizol 試劑用于從胃癌細胞BGC-823中提取總RNA;根據(jù)SuperScript ⅡFirst-Strand Synthesis System(Invitrogen)提供的說明書合成cDNA;通過PCR 合成人類全長信號轉導及轉錄激活蛋白6(STAT6)cDNA;將STAT6 cDNA 回收并插入pCDNA3.1(+)質粒(Invitrogen)以生成STAT6 重組質粒(rSTAT6)。質粒送測序驗證序列。使用0.5 μg rSTAT6 載體或空載體用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染胃癌細胞BGC-823 和MKN-45。通過RTqPCR 法 及Western blotting 評 估rSTAT6 轉 染 的效果。

    1.2.2 CCK-8 法測定細胞活力 對數(shù)期生長的人胃癌細胞BGC-823 和MKN-45 細胞經消化、離心后,以8 000/孔接種至96 孔板,24 h 后,分別加入含有0~1 000 μmol/L SIN 的培養(yǎng)基。大約24 h 后,將10 μL CCK-8 試劑進一步補充到每孔培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.5 h。隨后,測定450 nm 處的A 值來評估細胞活力。

    1.2.3 克隆形成實驗測定細胞增殖能力 對數(shù)期生長的人胃癌細胞BGC-823 和MKN-45 以500/孔接種至6 孔板中,實驗組培養(yǎng)基中含有50 μmol/L SIN,對照組中加入等量DMSO,培養(yǎng)14 d后,用5 g/L結晶紫固定染色。

    1.2.4 共培養(yǎng)和Transwell小室遷移實驗 使用Transwell共培養(yǎng)室進行胃癌細胞BGC-823、MKN-45 和巨噬細胞的共培養(yǎng)。將50 μmol/L SIN、rSTAT6質?;蛲庠葱訧L-6(10 ng/mL)預處理的胃癌細胞接種到下室。在上室鋪板之前,通過用50 nmol/L PMA 孵育24 h 將THP-1 單核細胞誘導為M0 巨噬細胞。48 h后,小室用40 g/L 多聚甲醛固定15 min,結晶紫染色20 min,PBS清洗2次,然后在顯微鏡下拍照計數(shù)。

    1.2.5 流式細胞術評估巨噬細胞極化 在與胃癌細胞BGC-823和MKN-45共培養(yǎng)48 h后,收集THP-1巨噬細胞。將細胞與熒光偶聯(lián)的抗人APC-CD14 抗體和FITC-CD206抗體CD14(APC/Cy7)、CD163(BV510)、CD206(PE-Cy5)、LIVE/DEAD?Viability/Cytotoxicity Kit 一起孵育30 min 后,沖洗細胞并用FACScan流式細胞儀和FlowJo 軟件(Becton, Dickinson &Company)進行分析,以評估巨噬細胞M2 極化。

    1.2.6 RT-qPCR 法檢測基因的相對表達水平 用Trizol 試劑提取樣本總RNA,紫外分光光度計檢測濃度及純度。應用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA,實 時定量PCR 在Bio-Rad C1000 PCR 儀上進行,每樣本設3 個復孔,反應條件:95 ℃30 s,95 ℃10 s,58 ℃5 s,擴增40 個循環(huán)。基因表達情況采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析。所有實驗重復3 次。引物序列見表1。

    表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence

    1.2.7 Western blotting檢測蛋白的相對表達水平 細胞用RIPA 裂解緩沖液裂解,使用核蛋白提取試劑盒制備核蛋白,BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定所提取蛋白濃度。行SDS-PAGE 凝膠電泳,每孔道上樣40 μg,恒壓2 h,濕法轉膜至PVDF 膜上,恒流2 h。用含有50 g/L 脫脂牛奶的Tris 緩沖鹽水(TBS)封閉1 h,分別加入1∶1 000 稀釋的對應一抗4 ℃過夜。用TBST 充分洗滌后,加入1∶2 000 稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育2 h,TBST 充分洗滌。然后使用ECL 檢測試劑顯影,ImageJ 軟件進行灰度分析。Lamin B 用于細胞核中基因表達的內參,β-actin用于其他基因的內參。

    1.3 統(tǒng)計學處理

    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,應用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。生物學實驗均重復3 次。兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗,多組間均數(shù)比較或多組間的兩組比較應用單因素方差分析(one-way ANOVA),事后比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結 果

    2.1 SIN 抑制胃癌細胞增殖

    用0~1 000 μmol/L SIN 處 理 胃 癌 細 胞BGC-823 和MKN-45,SIN 劑量依賴性地抑制了胃癌細胞的活性(圖1B)。經過50 μmol/L SIN 處理后的胃癌細胞中增殖相關蛋白Ki67 的表達下調(圖1C)。與此同時,克隆形成實驗也證明了低劑量SIN(50 μmol/L)處理后的胃癌細胞凋亡增加(DMSO 組vs.SIN 處理組,P<0.05)(圖1D)。

    圖1 青藤堿對胃癌細胞增殖的影響Fig.1 The effect of sinomenine on the proliferation of gastric cancer cells

    2.2 SIN 抑制胃癌細胞募集巨噬細胞并抑制其M2型極化

    首先建立了胃癌細胞與THP-1 巨噬細胞的Transwell 小室共培養(yǎng)(CC,co-culture)系統(tǒng),并在腫瘤作用下評估了SIN 對巨噬細胞的招募和極化作用。胃癌細胞可以募集PMA 誘導的巨噬細胞,而在SIN處理腫瘤細胞后再與THP-1 共培養(yǎng),這種募集能力減弱了(圖2A)。與胃癌細胞的共培養(yǎng)提高了THP-1巨噬細胞中CD14+CD206+細胞的百分比(圖2B),誘導M2 型 極 化,M2 標 志 物CD163、CD206 的 平 均 熒光強度升高,在SIN 處理后胃癌細胞的誘導能力明顯減弱,M2 標志物CD163、CD206 的平均熒光強度也被抑制(圖2C)。用SIN 處理胃癌細胞降低了巨噬細胞抗炎標志物CCL22 和Arg1 的mRNA 表達,促進了免疫抑制性炎癥因子TGF-β 和IL-10 的產生(圖2D)。

    圖2 青藤堿對胃癌細胞誘導巨噬細胞募集和M2 極化能力的影響Fig.2 The effect of sinomenine on the ability of gastric cancer cells in inducing macrophage recruitment and M2 polarization

    2.3 SIN抑制了STAT6的表達及C/EBPβ的表達和入核

    SIN 降 低 了 胃 癌 細 胞 中STAT6 和C/EBPβ 在mRNA 水平的表達(圖3A、圖3B)和在蛋白水平的表達,同時胃癌細胞核中CAAT 增強子結合蛋白β(C/EBPβ)的 蛋 白 表 達 下 調(圖3C)。C/EBPβ 的Ser299磷酸化對其自身的核易位至關重要[17],在SIN 的處理后,降低了C/EBPβ 的總蛋白表達水平,同時也抑制了磷酸化(圖3C、圖3D)。

    圖3 青藤堿對胃癌細胞中STAT6 和C/EBPβ 的影響Fig.3 The effects of sinomenine on STAT6 and C/EBPβ in gastric cancer cells

    2.4 STAT6 過表達可降低SIN 對胃癌細胞募集巨噬細胞和對M2 型極化的抑制作用

    用重組STAT6 質粒轉染后,顯著提高了胃癌細 胞 系 中STAT6 和C/EBPβ 的mRNA 表 達 水 平(圖4A、圖4B),以及蛋白質水平(圖4C)。對于巨噬細胞招募功能的分析,證實了SIN 對胃癌細胞誘導的巨噬細胞募集功能的抑制作用,STAT6 過表達阻斷了SIN 對腫瘤的抑制(圖4D)。同時,STAT6 的過表達還會降低SIN 對腫瘤誘導CD14+、CD206+巨噬細胞的抑制作用(圖4E)。相比較于SIN 處理后的胃癌細胞共培養(yǎng)的巨噬細胞,STAT6 過表達后M2 巨噬細胞標志物表達顯著上調(圖4F)。

    圖4 STAT6 介導了青藤堿對胃癌細胞誘導巨噬細胞募集和M2 型極化的抑制作用Fig. 4 STAT6 mediated the inhibitory effect of sinomenine on gastric cancer cell-induced macrophage recruitment and M2-type polarization

    2.5 STAT6 在胃癌細胞中釋放IL-6 是造成SIN 介導的巨噬細胞募集和M2 極化的原因

    SIN 降低了IL-6 的mRNA 表達水平和在胃癌細胞中的含量,但是當STAT6 過表達后這種影響被逆轉(圖5A、圖5B)。而IL-6 抗體對其自身的抑制,顯著減輕了由SIN 介導的胃癌細胞引發(fā)的對巨噬細胞募集的抑制作用(圖5C)。此外,與IL-6 抗體共同孵育使在與胃癌細胞共培養(yǎng)的巨噬細胞中CD14+、CD206+細胞百分比下降,M2 巨噬細胞標志物表達降低。但加入外源性IL-6 后,逆轉了SIN 對胃癌細胞誘導的巨噬細胞募集和M2 極化的抑制作用(圖5D、圖5E)。

    圖5 STAT6 過表達胃癌細胞中IL-6 對青藤堿介導的巨噬細胞募集和M2 極化的影響Fig.5 The effect of STAT6 overexpression of IL-6 in gastric cancer cells on sinomenine-mediated macrophage recruitment and M2 polarization

    3 討 論

    目前,研究者普遍認為,在實體腫瘤中,免疫微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產生了相當重要的作用,腫瘤細胞和非腫瘤細胞(免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞等)間通過細胞因子或直接作用等方式產生交互,進而重塑腫瘤微環(huán)境和腫瘤自身的變化。本研究專注于SIN 的藥理作用,發(fā)現(xiàn)SIN 通過抑制胃癌細胞的細胞增殖活力和遷移來抑制胃癌的癌變進展。更重要的功能在于,SIN 通過抑制C/EBPβ 調控的IL-6分泌,來抑制胃癌細胞和巨噬細胞共培養(yǎng)條件下誘發(fā)的巨噬細胞招募作用和巨噬細胞M2 型極化。這項研究突出了在相對低劑量的作用下,SIN 并未直接殺死腫瘤細胞,但通過調節(jié)惡性腫瘤、癌細胞介導腫瘤相關巨噬細胞表型,改善腫瘤微環(huán)境,達到輔助免疫治療,調整TME 的作用。

    最近的證據(jù)證明了SIN在體外具有抗腫瘤活性,如抑制炎癥、保護腦損傷、誘導血管舒張等。然而,由于SIN生物利用度較差,SIN的臨床效用較為有限,在腫瘤的局部環(huán)境中,很難維持有效殺傷腫瘤的局部藥物濃度。到目前為止,從自然界尋找有效的腫瘤抑制化合物仍然是研究熱點,研究者也期待能從傳統(tǒng)藥物的寶庫中尋找到解開腫瘤密碼的鑰匙。在乳腺癌中SIN 被證實具有抑制有絲分裂和抵抗缺氧誘導的EMT 的效果[18-19]。SIN 也可以通過調控PI3K/AKT 通路抑制視網膜母細胞瘤的增殖能力和侵襲遷移能力[20]。另外,在非小細胞肺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌等惡性腫瘤的相關研究中,SIN 已被證實具備體外和動物體內抑制腫瘤進展的效果[14,21-23]。本研究首次發(fā)現(xiàn)了SIN 調控腫瘤免疫微環(huán)境的藥理作用,其藥理機制通過CEBE/β/IL-6 軸抑制腫瘤的進展,進一步探索SIN在胃癌中的藥理作用,有利于指導胃癌患者的治療方案,提示新的治療方法。

    作為免疫環(huán)境中的重要成員,骨髓單核細胞來源的巨噬細胞在腫瘤浸潤局部發(fā)揮的功能一直受到爭議。在正常生理條件下和組織損傷后的組織穩(wěn)態(tài)中,巨噬細胞起著積極的關鍵作用[24]。巨噬細胞的許多表型已經根據(jù)它們在細胞培養(yǎng)實驗中的體外特征進行了表征。經典激活的M1 表型和繼發(fā)激活的M2 表型根據(jù)不同的表面受體表達、分泌特征和功能進行區(qū)分[25]。M1 型巨噬細胞表現(xiàn)為促炎細胞,其具備較高的抗原呈遞能力,激活I 型T 細胞免疫應答,具有表達較多IL-12 的特征[26]。M2 型巨噬細胞通常具有抗炎作用,其特點是抗原呈遞能力差;具有低IL-12 和高IL-10、IL-4 和IL-13 分泌特征,同時伴有免疫抑制特征[27]。

    在目前的研究中,C/EBPβ 的入核活化已經被證實對胃癌的細胞干性和化療耐藥起到促進作用,也能促進胃癌的增殖,從多個維度導致了胃癌的進展[28-30]。隨著研究的深入,人們越來越關注C/EBPβ在腫瘤中和巨噬細胞及免疫環(huán)境之間的關系[31]。本研究證明了C/EBPβ 的過表達消除了SIN 對巨噬細胞招募和M2 極化的抑制作用。值得一提的是,C/EBPβ 本身也是重要的調控巨噬細胞表型的調控因子,在C/EBPβ 活化時介導巨噬細胞向M2 型巨噬細胞極化[32]。

    綜上所述,天然藥物SIN 對胃癌具有良好的腫瘤抑制能力,抑制胃癌細胞的生存和遷移,并且通過抑制IL-6 的表達,抑制腫瘤微環(huán)境中的M2 表型,重塑腫瘤環(huán)境,降低M2 型巨噬細胞為胃癌腫瘤帶來免疫抑制環(huán)境的風險。本研究為胃癌的臨床治療提供了新的思路,SIN 抑制腫瘤的同時重塑了免疫微環(huán)境,提示用SIN 治療胃癌患者的同時結合免疫療法可能帶來更大的收益。

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