基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法研究右歸丸治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

劉小沛，譚從娥，沈 霞，王相東，邢文文

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712046）

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)是以膝關(guān)節(jié)軟骨破壞為特性的退行性骨關(guān)節(jié)病，表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)的慢性炎癥伴骨贅形成等病理變化，常以膝痛、關(guān)節(jié)活動障礙為主癥，治療不當(dāng)則導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形或殘疾，長期的活動不便及膝關(guān)節(jié)疼痛嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，并給他們帶來了巨大的心理負(fù)擔(dān)[1]。調(diào)查顯示，我國65 歲以上人群中KOA 的發(fā)病率達(dá)80%，給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。目前非甾體抗炎類和皮質(zhì)類固醇類藥物是KOA 的主要治療藥物[3]，但此類藥物僅能緩解癥狀，并不能有效阻止病情進(jìn)展，且不良反應(yīng)較大[4]。中醫(yī)藥治療KOA 具有療效持久、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢，臨床可根據(jù)辨證分型選擇方藥。右歸丸出自《景岳全書·新方八陣》，全方由熟地黃、附子、肉桂、山藥、山茱萸、菟絲子、鹿角膠、枸杞子、當(dāng)歸、杜仲組成，具有溫補(bǔ)腎陽、填精補(bǔ)血作用。研究證實，采用非甾體抗炎藥美洛昔康聯(lián)合右歸丸治療KOA，其療效優(yōu)于單獨使用非甾體抗炎藥，且能增強(qiáng)膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞保護(hù)作用，并能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)骨代謝水平[5-7]。右歸丸已被廣泛應(yīng)用于KOA 的臨床治療，但其具體作用機(jī)制仍不明確。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探究右歸丸治療KOA 的作用機(jī)制，以期為右歸丸的臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 右歸丸活性成分查詢

利用計算機(jī)系統(tǒng)生物學(xué)實驗室TCMSP 數(shù)據(jù)庫(https://tcmsp-e.com/)檢索右歸丸中植物藥的化合物，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18 為條件篩選右歸丸的活性成分，并通過文獻(xiàn)檢索對雖不滿足上述條件，但卻有明顯藥效作用或中藥含量較多的活性成分予以補(bǔ)充。因方中動物藥鹿角膠的主要成分為蛋白質(zhì)和氨基酸等[8]，故不納入分析。

1.2 右歸丸活性成分靶點預(yù)測

將1.1 項篩選出的活性成分導(dǎo)入TCMSP，Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)、Target Net (http://targetnet.scbdd.com/home/index/)網(wǎng)站進(jìn)行活性成分靶點預(yù)測，為提高結(jié)果的可信度，Swiss Target Prediction 網(wǎng)站選擇結(jié)果的前15 個[9]，TargetNet 網(wǎng) 站 選 擇Prob≥0.9[10]的 結(jié) 果。將預(yù)測的活性成分靶點導(dǎo)入UniProtKB 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)矯正為標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3 KOA 相關(guān)靶點搜集

通過檢索中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（TCMIP）

(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)，CTD(http://ctdbase.org/)，DisGeNET（https://www.disgenet.org/）等數(shù)據(jù)庫，關(guān)鍵詞為“Knee osteoarthritis(KOA)”，為提高結(jié)果的可信度，CTD 數(shù)據(jù)庫選擇帶有“M(marker/mechanism)”或“T(therapeutic)”標(biāo)記的靶點[11]，DisGeNET 數(shù) 據(jù) 庫 選 擇Score_gda≥0.01 的 結(jié)果[12]，GeneCards 選 擇Relevance score≥5 的 結(jié) 果。將每個數(shù)據(jù)庫獲取的靶點匯總并去重，最終篩選出KOA相關(guān)靶點。將1.2項獲取的右歸丸活性成分靶點與KOA相關(guān)靶點取交集，作為右歸丸治療KOA的潛在靶點。

1.4 FDA 批準(zhǔn)的抗KOA 藥物和靶點

通過Drug Bank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)獲取美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的治療KOA 的藥物和靶點，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 構(gòu)建藥物靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用STRING 數(shù)據(jù)庫(https://www. string-db.org/)構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI)，在“multiple proteins”欄目輸入右歸丸治療KOA 的潛在靶點，物種設(shè)定為“Homo sapiens”，置信度選擇“high confidence(0.700)”，獲取右歸丸療效相關(guān)PPI 網(wǎng)絡(luò)，并將此網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 進(jìn)行可視化，采用插件CytoHubba計算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的拓?fù)鋮?shù)。

1.6 功能富集分析

利用R Studio 進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，選用R 包“clusterProfiler”[13]，設(shè) 定“P-value”＜0.01，并 通 過“ggplot2”包對顯著富集結(jié)果進(jìn)行作圖。

1.7 中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點-顯著通路-生物過程網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)1.5項的分析結(jié)合1.1項和1.2項的搜集結(jié)果，構(gòu)建中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點-顯著通路-生物過程網(wǎng)絡(luò)，并定位出右歸丸治療KOA的核心網(wǎng)絡(luò)作用分子功能模塊。

1.8 分子對接

將關(guān)鍵靶點及其對應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對接實驗，驗證其相互作用活性，對接軟件選擇AutoDock Vina。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(https://www1.rcsb.org/)下載，化合物從TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載。利用AutoDock Tools 對蛋白質(zhì)晶體和化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理，包括分離蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和原始配體、去除水分子、為結(jié)構(gòu)加電荷，轉(zhuǎn)換成“PDBQT 格式，利用Vina軟件完成分子對接，提取對接結(jié)果，并對結(jié)合能力較強(qiáng)的結(jié)合模式作圖。

2 結(jié) 果

2.1 右歸丸活性成分的查詢結(jié)果

共獲取右歸丸活性化合物158 個，其中當(dāng)歸2 個、杜仲33 個、附子21 個、枸杞45 個、肉桂8 個、山藥16 個、山茱萸20 個、熟地黃2 個、菟絲子11 個，結(jié)果見表1(每味中藥僅列出OB 排名前5 的化合物)。

表1 右歸丸中藥活性成分表Tab.1 Detailed information of compounds in Yougui Pills

2.2 右歸丸活性成分靶點預(yù)測及KOA 相關(guān)靶點搜集結(jié)果

共獲得右歸丸活性成分靶點490 個，KOA 相關(guān)靶點512 個。將右歸丸活性成分靶點與KOA 相關(guān)靶點取交集，作為右歸丸治療KOA 的潛在作用靶點，共76 個(圖1)。

圖1 右歸丸活性成分靶點-疾病靶點韋恩圖Fig.1 Yougui Pills’active component target-disease target Venn diagram

2.3 FDA 批準(zhǔn)的抗KOA 藥物及其分子靶點

共獲取6 個FDA 批準(zhǔn)的治療KOA 的小分子藥物，對應(yīng)了34 個已經(jīng)驗證的分子靶點，其中13 靶點為右歸丸和FDA 批準(zhǔn)藥物的共有靶點（圖2）；采用Cytoscape 將FDA 批準(zhǔn)的KOA 治療藥物與其對應(yīng)的靶點之間的作用關(guān)系構(gòu)建藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。

圖2 右歸丸活性成分靶點與FDA 批準(zhǔn)藥物靶點韋恩圖Fig. 2 Venn diagram of the target components of Yougui Pills and the drug targets approved by the FDA

圖3 FDA 批準(zhǔn)藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.3 FDA Approved Drug-Target Network

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

潛在治療靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。圖中74 個靶點存在465 條相互作用。我們通過參數(shù)度中心性(degree centrality, DC)、緊密中心性(closeness centrality, CC)和中介中心性(betweenness centrality,BC) 3 個參數(shù)分別篩選出網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點13、37、74 個，其中IL6、VEGFA、IL1B 等18 節(jié)點的DC、CC和BC 超過整個網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)的平均值，說明這18 個靶點可能是右歸丸治療KOA 的關(guān)鍵靶點（表2）。

表2 關(guān)鍵靶點拓?fù)鋮?shù)Tab.2 Topological parameters of key targets

圖4 潛在治療靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Protein interaction network of potential therapeutic targets

2.5 功能富集分析

2.5.1 GO 富集分析結(jié)果 共得到右歸丸潛在治療靶點的GO 條目1 358 條，其中生物學(xué)過程（biological process, BP）1 281 條、分子功能（molecular function,MF）60 條以及細(xì)胞組分（cellular component, CC）17 條，顯著富集結(jié)果如圖5所示。潛在治療靶點涉及的BP 主要為炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)（regulation of inflammatory response）、活性氧代謝過程調(diào)控（regulation of reactive oxygen species metabolic process）、活性氧代謝過程（reactive oxygen species metabolic process）等。

圖5 GO 富集結(jié)果Fig.5 GO enrichment results

2.5.2 KEGG 富集分析結(jié)果 共得到右歸丸潛在治療靶點顯著富集的KEGG 通路50 條，其中白細(xì)胞介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）和腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）位居前兩位（圖6）。50條顯著富集的通路所涉及的生物過程主要包括免疫系統(tǒng)（immune system）、信號傳導(dǎo)（signal transduction）、內(nèi)分泌系統(tǒng)（endocrine system）等（圖7）。選擇具有統(tǒng)計學(xué)差異的前20 條通路的分子靶點，構(gòu)建關(guān)鍵靶點-顯著通路網(wǎng)絡(luò)，并用軟件Cytoscape 進(jìn)行可視化，通過插件ClusterMaker 的community cluster（Glay）算法對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊化，發(fā)現(xiàn)有5 個生物模塊與右歸丸治療KOA 的作用相關(guān)（圖8）。

圖7 KEGG 通路涉及到的生物過程Fig.7 Biological processes involved in the KEGG pathway

圖8 關(guān)鍵靶點-顯著通路的模塊分析Fig.8 Key target-significant pathway module analysis

2.6 中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點-顯著通路-BP 網(wǎng)絡(luò)

右歸丸作用相關(guān)中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點-顯著通路-生物過程網(wǎng)絡(luò)見圖9。右歸丸可通過多個化合物作用于多個靶點和通路調(diào)節(jié)不同的生物過程而發(fā)揮對KOA 的治療作用。

圖9 中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點-顯著通路-生物過程網(wǎng)絡(luò)Fig.9 Traditional Chinese medicine-active components-key targets-significant pathways-biological process network

2.7 分子對接結(jié)果

關(guān)鍵蛋白質(zhì)與其對應(yīng)的化合物的對接結(jié)果見表3。分子對接結(jié)果的平均結(jié)合能為-7.23 kcal/mol，低于-5 kcal/mol 表明靶點蛋白和化合物具有較強(qiáng)的結(jié)合能力[14]。對結(jié)合活性較強(qiáng)的結(jié)果進(jìn)行對接模式分析（圖10）顯示，右歸丸活性成分均深入活性位點，并與活性位點關(guān)鍵氨基酸殘基形成極性或非極性鍵，以穩(wěn)定配體和受體的結(jié)合。右歸丸相互作用力分析結(jié)果顯示，右歸丸的活性成分主要通過氫鍵、疏水作用、pi相互作用及范德華力與關(guān)鍵靶點的活性位點相結(jié)合。

圖10 關(guān)鍵靶點和活性成分結(jié)合模式分析Fig.10 Analysis of binding modes of key targets and active ingredients

表3 分子對接結(jié)果Tab. 3 Results of molecular docking

3 討 論

右歸丸為溫補(bǔ)腎陽的經(jīng)典方劑，具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、修復(fù)受損軟骨、延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程的作用[15]，對KOA 有較好的治療效果[16]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對右歸丸治療KOA 的活性成分、作用靶點、分子通路及其生物學(xué)過程進(jìn)行研究，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫分析及文獻(xiàn)補(bǔ)充，共篩選出右歸丸中植物藥活性成分158 種，對應(yīng)490 個靶點，其中76 個靶點有潛在治療作用。

借助DrugBnak 數(shù)據(jù)庫，搜集了FDA 批準(zhǔn)的治療KOA 的西藥及其靶點，得到6 個西藥所對應(yīng)的34 個靶點，其中右歸丸與藥物雙醋瑞因（diacerein）、度洛西汀（duloxetine）、氨基葡萄糖（glucosamine）的所有靶點一致，與雙氯芬酸（diclofenac）、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid）的作用靶點部分一致，提示右歸丸可能和這些藥物具有相同或類似的藥理作用。PPI 結(jié)果顯示，治療KOA 關(guān)鍵靶點有18 個，其中IL-1β、TNF-α、IL-6 為促炎細(xì)胞因子，在KOA 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[17]。研究顯示，關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6 及TNF-α水平與KOA 病變程度呈正相關(guān)[17-20]，其中IL-6 在疾病發(fā)展過程中能夠激活JAK/STAT 途徑，引起炎癥反應(yīng)和軟骨破壞，可間接反應(yīng)關(guān)節(jié)的損傷程度[21]；IL-1β和TNF-α 可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，抑制軟骨細(xì)胞代謝，誘導(dǎo)其凋亡。有報道稱，右歸丸能抑制IL-1、IL-6 及TNF-α 的表達(dá)，降低其血清水平，減輕炎癥反應(yīng)[22-24]，這與本研究的結(jié)果是一致的。MMP9 是基質(zhì)蛋白酶家族（MMPs）的組成部分，能降解大部分關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)，在KOA 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[23]。本研究也發(fā)現(xiàn)，右歸丸對MMP9、MMP8、MMP13 等均有調(diào)控作用，提示右歸丸可能通過抑制KOA 關(guān)節(jié)軟骨中MMPs 的表達(dá)來發(fā)揮抑制炎癥及修復(fù)受損關(guān)節(jié)的作用[24-26]。研究顯示，由VEGFA 介導(dǎo)的軟骨內(nèi)血管生成而造成的軟骨缺損、炎癥以及骨贅形成是KOA 的重要發(fā)病機(jī)制之一[27]。TP53 與細(xì)胞周期的阻滯、凋亡、衰老、DNA 修復(fù)或代謝改變相關(guān)[28]。

右歸丸療效相關(guān)靶點的GO 分析結(jié)果顯示，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、活性氧代謝等生物學(xué)過程顯著富集，提示右歸丸對KOA 的治療作用可能與抑制局部炎癥反應(yīng)及改善機(jī)體代謝水平相關(guān)。通過KEGG 富集分析，共篩選出50 條顯著富集的分子通路，其中最具顯著性的是IL-17 信號通路和TNF 信號通路。研究顯示，IL-17 的異常表達(dá)與OA 的發(fā)病及疼痛程度密切相關(guān)，阻斷IL-17 信號傳導(dǎo)途徑可能會緩解KOA 相關(guān)的疼痛[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17 信號通路在右歸丸治療后顯著富集，提示該分子通路可能是右歸丸緩解KOA 疼痛的主要分子途徑。TNF 屬于促炎細(xì)胞因子，可激活I(lǐng)L-1β、IL-6 和TNF-α 等 炎癥細(xì)胞因子，還可激活MMP3、MMP9、MMP13 等MMP 類基因，調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)及軟骨組織重塑。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF 信號通路顯著表達(dá)，提示右歸丸不僅可以調(diào)控炎癥反應(yīng)，還可抑制關(guān)節(jié)軟骨的降解而發(fā)揮對KOA 的治療作用。

右歸丸治療KOA 的活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)模塊顯示，有5個關(guān)鍵生物模塊與右歸丸調(diào)控效應(yīng)關(guān)系最為密切，其中模塊1 包括IL-17 信號通路、TNF 信號通路、Toll樣受體信號通路等炎癥反應(yīng)通路，模塊2 包括PI3K-Akt信號通路、HIF-1 信號通路等自噬與凋亡相關(guān)通路，模塊3 為破骨細(xì)胞分化通路，模塊4 為MMPs相關(guān)通路，模塊5 包括MAPK 信號通路、p53 信號通路和Sphingolipid 信號通路，提示右歸丸對KOA 的調(diào)節(jié)作用具有廣泛性和多系統(tǒng)性，其作用機(jī)制與炎癥反應(yīng)抑制、細(xì)胞自噬和凋亡調(diào)控環(huán)節(jié)更為密切，說明右歸丸可以通過調(diào)節(jié)一系列炎癥分子的相互作用，并誘導(dǎo)KOA 滑膜細(xì)胞自噬，減少關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡，從而起到緩解關(guān)節(jié)內(nèi)炎性浸潤和軟骨破壞的作用。

分子對接結(jié)果顯示，槲皮素（Quercetin)(MOL ID:MOL000098；來源：杜仲、枸杞、肉桂、菟絲子)、Doradexanthin（MOL ID：MOL005461；來源：山藥）、苦參堿（Matrine）(MOL ID：MOL005944；來源：菟絲子)、去氫雙丁香酚(Dehydrodieugenol) (MOL ID:MOL009030；來源:杜仲)等與關(guān)鍵靶點IL-1β、IL-6、TNF-α 和MMP9 具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，說明這些化合物可能是右歸丸發(fā)揮藥效的關(guān)鍵組分。研究顯示，槲皮素能夠通過減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解來減緩KOA 的發(fā)展[30]；苦參堿能夠通過下調(diào)吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和受損組織細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子，如IL-6 及其受體、TNF、趨化因子、炎性蛋白-3 等的表達(dá)產(chǎn)生抗炎作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，右歸丸關(guān)鍵組分與IL-1β、IL-6、TNF 等炎癥因子對接具有較強(qiáng)的結(jié)合力，提示槲皮素、苦參堿等是右歸丸抑制KOA 慢性炎癥的主要化合物。目前針對化合物皮黃素(Doradexanthin)的研究較少，可以作為未來的研究方向。

綜上所述，化合物槲皮素、苦參堿、皮黃素和去氫雙丁香酚為右歸丸治療KOA 的關(guān)鍵化合物，這些化合物可通過IL-17 信號通路、TNF 信號通路等炎癥信號通路，調(diào)控IL-1、TNF-α 和IL-6 等促炎細(xì)胞因子和MMP9、MMP8、MMP13 等基質(zhì)蛋白酶家族基因的表達(dá)，而發(fā)揮抑制KOA 患者關(guān)節(jié)局部的炎癥反應(yīng)、減弱氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡等作用。本研究對右歸丸治療KOA 的作用機(jī)制有一定的借鑒作用，但所得結(jié)果還需進(jìn)一步實驗驗證。