短鏈脂肪酸對(duì)THP-1 細(xì)胞和COPD 小鼠炎癥反應(yīng)的影響

張 桐，汪澎濤，康宇婷，楊寧愛(ài)，趙志軍，賈 偉

（1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院寧夏病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750004）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以慢性氣道炎癥、持續(xù)呼吸道癥狀和慢性氣流受限為特征的慢性肺部疾病[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球人口有4%～5%（3.28 億）人患有COPD[3]。慢性炎癥在COPD的發(fā)病機(jī)制中處于核心地位。在一項(xiàng)109例COPD 患者的橫斷面研究中，患者血漿炎癥因子含量升高，其中白介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白介素6（interleukin-6, IL-6）最能反映個(gè)體的嚴(yán)重情況[4]。一項(xiàng)動(dòng)物研究中，給COPD 小鼠喂食高纖維飲食小鼠的糞便后，其肺泡灌洗液和血漿中的炎癥因子干擾素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、IL-6 水平降低[5]。目前治療COPD 的抗炎藥物主要是糖皮質(zhì)激素，但長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致代謝紊亂、感染等不良反應(yīng)，因此尋找新的靶向抗炎藥物對(duì)于COPD 患者的治療顯得尤為重要。短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）作為一種腸道菌群發(fā)酵膳食纖維形成的內(nèi)源性產(chǎn)物，包括乙酸（acetate）、丙酸（propionate）、丁酸（buty rate），可以起到保護(hù)腸道穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)腸道pH 的作用[6]，越來(lái)越引起研究者的重視。研究發(fā)現(xiàn)，喂養(yǎng)高纖維飲食的小鼠可以增加SCFAs 循環(huán)水平，并防止肺部過(guò)敏性炎癥，而低纖維飲食則降低SCFAs 的循環(huán)水平，加重小鼠的肺部過(guò)敏性炎癥[5]，但SCFAs 在COPD 中的作用機(jī)制仍然不甚清楚。本研究擬通過(guò)SCFAs 干預(yù)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞白血?。═HP）細(xì)胞和COPD 小鼠模型，通過(guò)檢測(cè)炎性相關(guān)因子表達(dá)情況，探討SCFAs 在THP-1 細(xì)胞和COPD 小鼠中的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

本研究中的10 名正常人和10 名COPD 患者均來(lái)自寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，所有診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)修訂的《慢性阻塞性肺疾病防治指南（2013年修訂版）》，排除合并有其他肺部疾病及感染者，以及其他系統(tǒng)疾病如心、肝、腦、腎等嚴(yán)重功能障礙者。COPD 小鼠模型購(gòu)買自武漢云克隆公司，LPS（L4391）、乙酸鈉（S2889，NaA）、丙酸鈉（P1880,NaP）、丁酸鈉（B5887,NaB）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich，胎牛 血 清（16140043）購(gòu) 自 美 國(guó)GIBCO 公 司，iNOS（39898）、NF-κB（3039）抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司，TB Green premix Ex TaqⅡ（RR420Q）購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

THP-1 細(xì)胞購(gòu)買于武漢普諾賽生命科技有限公司，在含有100 mL/L 胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1 mmol/L 丙酮酸、1% 青霉素和鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，37℃、50 mL/L 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞接種在12 孔板上，并用20 ng/mL 佛波酯（PMA）處理48 h 誘導(dǎo)成巨噬樣細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中所有細(xì)胞類型均為巨噬樣THP-1 細(xì)胞系。根據(jù)LPS 刺激不同時(shí)間以及不同的SCFAs干預(yù)，將細(xì)胞分為9 組：對(duì)照組(Control)、脂多糖刺激細(xì)胞6 h組(LPS 6 h 組)、LPS 6 h+乙酸鈉組(NaA 6 h 組)、LPS 6 h+丙酸鈉組(NaP 6 h 組)、LPS 6 h+丁酸鈉組(NaB 6 h 組)、脂多糖刺激細(xì)胞12 h 組(LPS 12 h 組)、LPS 12 h+乙酸鈉組(NaA 12 h 組)、LPS 12 h+丙酸鈉組(NaP 12 h 組)、LPS 12 h+丁酸鈉組（NaB 12 h 組）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 COPD 小鼠模型的構(gòu)建

SPF 級(jí)Balb/c 小鼠購(gòu)自武漢云克隆公司。主要試劑包括紅金龍香煙（湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，烤煙型，每支含焦油量9 mg）、LPS（美國(guó)Sigma 公司）。建模方式：SPF 級(jí)Blab/c 小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，采用鼻腔滴入LPS加熏香煙的方法建立COPD 小鼠模型。分別于第1、29 天經(jīng)鼻腔滴入LPS（30 μg/6 μL），第2～30 天（除第29 天）將小鼠放入自制玻璃熏箱，10 支/次，30 min/次，5 d/周，共4 周。

1.4 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)條件

將小鼠分為3 組：野生型組（WT 組）、慢性阻塞性肺疾病組（COPD 組）、慢性阻塞性肺疾病+丁酸鈉組（COPD+NaB 組）。每組8 只，分籠飼養(yǎng)共21 d，溫度（24±2）℃，自由進(jìn)食飲水。

1.5 qRT-PCR 檢測(cè)外周血細(xì)胞、THP-1 細(xì)胞和小鼠肺組織炎癥因子表達(dá)

Trizol法提取細(xì)胞和組織的總RNA，用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，qRT-PCR測(cè)定細(xì)胞樣品及組織樣品中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)。以GAPDH作為內(nèi)參，引物為上海生工合成,所用引物見表1。

表1 本研究中用到的引物序列Tab. 1 Primer sequences used in this study

1.6 ELISA 檢測(cè)外周血血漿、THP-1 細(xì)胞上清液和小鼠血漿中炎癥因子濃度

用300 μL 的洗液浸泡酶標(biāo)板30 s，標(biāo)準(zhǔn)孔加入100 μL 的2 倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔加入100 μL 樣本稀釋液；加入樣本（90 μL 緩沖液和10 μL 血漿，100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液）；加入抗體50 μL，封板膜封板，300 r/min 震蕩，室溫孵育1.5 h；加入300 μL 洗滌液洗滌6 次，之后每孔加入100 μL 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶親和素；300 r/min 震蕩，室溫孵育30 min，洗滌6 次；每孔加入100 μL TMB 避光孵育20 min；每孔加入100 μL 終止液，測(cè)定在450 nm 的吸光度值。

1.7 小鼠肺組織病理染色

肺組織用40 g/L 多聚甲醛固定24 h，包埋后切片，切片厚度4 μm。HE 染色：依次放入Histo-clearⅠ5 min、Histo-clearⅡ5 min、無(wú)水乙醇2 min、950 mL/L乙 醇2 min、900 mL/L 乙 醇2 min、800 mL/L 乙 醇2 min、700 mL/L 乙醇2 min 脫蠟至水。蘇木素染核5 min，鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗3 min。伊紅染細(xì)胞質(zhì)5 min，脫水封片。天狼星染色：切片脫蠟至水后，加入天狼星紅染液，滴染1 h，沖洗10 min，蘇木素染色10 min。

1.8 Western blotting 檢測(cè)THP-1 細(xì)胞和小鼠肺組織炎癥因子表達(dá)

細(xì)胞：每孔加入500 μL 裂解液（含5 μL 磷酸酶抑制劑、0.5 μL 蛋白酶抑制劑、2.5 μL PMSF）冰上裂解30 min，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液；動(dòng)物組織：將組織剪碎洗凈后，每孔加入500 μL 裂解液（含5 μL 磷酸酶抑制劑、0.5 μL 蛋白酶抑制劑、5 μL PMSF）勻漿90 s，冰上裂解30 min，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液得到蛋白懸液。BCA 法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量。100 V 恒壓電泳120 min，300 mA恒流90 min轉(zhuǎn)印至PVDF膜。100 g/L脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（1∶2 000稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜。次日用TBST 洗滌3 次，每次10 min。加入二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗滌3次，用ECL曝光液顯色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用Graphpad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Tukey test for multiple comparisons 檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 COPD 患者外周血炎癥因子的變化

臨床基本特征統(tǒng)計(jì)分析顯示，COPD 患者1 s 內(nèi)用力呼氣量（FEV1%）和1 s 內(nèi)用力呼氣量/用力肺活量比率（FEV1/FVC）均低于正常人，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.000 1，P＜0.000 1），如表2 和圖1 所示。收集正常人和COPD 患者的外周血，qRT-PCR 檢測(cè)兩組人群IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 表達(dá)量，ELISA 檢測(cè)炎癥因子的濃度，結(jié)果如圖2 所示。與正常人相比，COPD 患者外周血炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.000 1，P＜0.000 1，P＜0.001），其濃度也均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），表明COPD 患者存在全身性慢性炎癥。

圖2 COPD 患者和正常人外周血炎癥因子表達(dá)Fig. 2 Expressions of inflammatory factors in peripheral blood of COPD and normal people

表2 COPD 患者與正常人基本特征Tab. 2 Basic characteristics of COPD patients and normal people

****P＜0.000 1。

2.2 短鏈脂肪酸對(duì)LPS 誘導(dǎo)的THP-1 炎癥反應(yīng)的影響

為了探究SCFAs 對(duì)LPS 誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞炎癥的影響，本研究分別用2 mmol/L NaA、NaP、NaB 提前孵育細(xì)胞12 h，然后加入100 ng/mL LPS 刺激6 h和12 h，通過(guò)qRT-PCR 和ELISA 檢測(cè)各組的炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6 的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平和濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。與Control 相比，LPS 刺激THP-1 細(xì)胞后各炎癥因子mRNA 表達(dá)量均升高，在SCFAs干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)NaP 和NaB 能明顯降低炎癥因子的表達(dá)。其中NaB 6 h、NaB 12 h 組均能降低TNF-α（P＜0.05，P＜0.05）和IL-6（P＜0.001，P＜0.01）的mRNA 表達(dá)量。NaP 6 h、NaP 12 h 組IL-6 mRNA 表達(dá)量降低（P＜0.05，P＜0.05），而NaA 對(duì)這3 種炎癥因子mRNA 表達(dá)無(wú)影響。ELISA 結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果基本一致，這3 種炎癥因子含量在LPS 刺激后均升高，TNF-α 和IL-6 含量在NaB 6 h、NaB 12 h 組均降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.001）。IL-6含量在NaP 12 h 組降低(P＜0.05)，而NaA 6 h 和12 h組的IL-1β 濃度升高（P＜0.05，P＜0.05），說(shuō)明NaA對(duì)THP-1 細(xì)胞具有一定的促炎功能。其中以NaB降低LPS 誘導(dǎo)的THP-1 炎癥反應(yīng)最明顯。

A：qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子mRNA 表達(dá)；B：ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清炎癥因子含量。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

2.3 構(gòu)建COPD 模型小鼠

為了進(jìn)一步探究SCFAs 體內(nèi)的抗炎作用，本研究使用COPD 小鼠模型進(jìn)行后續(xù)研究。通過(guò)鼻腔滴入LPS 加熏香煙的方法建立的COPD 小鼠，HE 染色顯示W(wǎng)T 組肺組織支氣管壁光滑，COPD 組支氣管狹窄（圖4A、圖4B）。圖4D 中箭頭所示肺泡壁斷裂，肺大皰形成。天狼星染色如圖4E、圖4F 所示，圖4F 中箭頭所示COPD 組支氣管周圍出現(xiàn)大量粉紅色纖維化組織。與WT 組相比，COPD 組肺泡破壞增加，用兩條隨機(jī)通過(guò)圖片的線段長(zhǎng)度除以線段經(jīng)過(guò)的肺泡隔數(shù)計(jì)算平均內(nèi)襯間隔（MLI），COPD 組平均肺泡間隔明顯增加（P＜0.001，圖4G）。

A、B：HE 染色（肺部氣管）；C、D：HE 染色（肺部肺泡）；E、F：天狼星染色（肺部氣管）；G：MLI 統(tǒng)計(jì)結(jié)果。***P＜0.001

2.4 丁酸鹽對(duì)小鼠炎癥相關(guān)因子的影響

體外實(shí)驗(yàn)表明，NaB 能很好地抑制THP-1細(xì)胞的炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)，因此本研究繼續(xù)探究NaB 在小鼠體內(nèi)的抗炎作用。在COPD小鼠的飲用水中加入濃度為60 mmol/L的NaB，取小鼠外周血血漿，通過(guò)ELISA 法檢測(cè)各組的IL-1β、IL-6、TNF-α濃度，結(jié)果如圖5A 所示：與WT 組相比，COPD 組小鼠血漿炎癥因子濃度升高，NaB 能降低COPD 小鼠血漿中IL-1β、IL-6 的濃度（P＜0.05，P＜0.05），但不影響TNF-α 的表達(dá)。各組小鼠肺組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)結(jié)果如圖5B 所示：COPD組小鼠肺組織中高表達(dá)的炎癥因子在COPD+NaB組均降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）。研究結(jié)果表明，NaB 不僅能降低小鼠肺組織的炎癥反應(yīng),還能對(duì)小鼠循環(huán)外周血的炎癥反應(yīng)起到很好的抑制作用。

圖5 丁酸鹽對(duì)小鼠炎癥相關(guān)因子的影響Fig.5 Effects of butyrate on inflammation-related factors in mice

2.5 丁酸鹽對(duì)小鼠肺組織炎癥蛋白表達(dá)的影響

核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B（NF-κB）的活化是COPD 發(fā)病的重要炎癥通路之一，NF-κB 調(diào)控TNF-α、IL-6、IL-8 等炎癥因子產(chǎn)生，NF-κB 蛋白的磷酸化水平升高是該通路活化的重要標(biāo)志。因此，本研究檢測(cè)小鼠肺組織中NF-κB 和P-NF-κB 的蛋白表達(dá)水平。取小鼠肺組織，勻漿后提取蛋白，用Western blotting 檢測(cè)P-NF-κB、NF-κB，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。與WT 組相比，COPD 組P-NF-κB 表達(dá)量升高，COPD+NaB組P-NF-κB 表達(dá)量降低，表明NaB 能抑制COPD 小鼠肺組織NF-κB 通路的激活。

圖6 丁酸鹽對(duì)小鼠肺組織NF-κB 蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effects of butyrate on the expression of NF-κB protein in the mice’s lung tissue

3 討 論

SCFAS 由未消化吸收的碳水化合物在結(jié)腸被厭氧菌發(fā)酵而成，為1～6 個(gè)碳原子的有機(jī)脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸。SCFAS 在腸道中處于高濃度，并且很容易被吸收到血流中，通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)影響外周組織的免疫和炎癥反應(yīng)[5]。在炎癥部位，SCFAs 可以通過(guò)減少炎癥因子和趨化因子的釋放，增強(qiáng)細(xì)胞吞噬能力，激活T 細(xì)胞生成等方式發(fā)揮抗炎作用，通過(guò)腸-肺軸對(duì)哮喘、肺炎、COPD 等多種肺部疾病產(chǎn)生影響，但其中的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[7]。

慢性炎癥一直被認(rèn)為是COPD 發(fā)病的重要原因之一[8]。在慢性炎癥中，肺的不同部位有巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增加和炎癥因子的產(chǎn)生。其中巨噬細(xì)胞過(guò)度活化導(dǎo)致功能紊亂，釋放高水平的炎癥因子和趨化因子促進(jìn)COPD 疾病進(jìn)展，因此，抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)、調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路的活性是治療COPD 慢性炎癥的有效方法[9]。

THP-1 細(xì)胞具有人原代單核細(xì)胞相似的形態(tài)和功能，常被用于免疫和炎癥的研究，同時(shí)THP-1 細(xì)胞被作為COPD 的全身細(xì)胞模型，用于LPS 刺激的病原體相關(guān)分子模式（PAMP）研究[10]。在本研究中，COPD 患者外周血炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 高表達(dá)會(huì)誘發(fā)炎癥反應(yīng)，LPS 會(huì)誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞產(chǎn)生這3 種細(xì)胞因子，3 種SCFAs 干預(yù)后對(duì)這些炎癥因子表達(dá)產(chǎn)生了不同的影響。研究結(jié)果表明，NaB 同時(shí)降低了IL-6、TNF-α 的mRNA 表達(dá)和上清濃度，這與CHEN 等[11]發(fā)現(xiàn)的NaB 調(diào)節(jié)LPS 誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW246.7）炎癥反應(yīng)的研究結(jié)果一致。NaP 降 低 了THP-1 細(xì) 胞IL-6 mRNA 表 達(dá)，IL-6 能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的增生和分化，參與免疫調(diào)節(jié)，影響代謝等[12]，表明NaP 在THP-1 細(xì)胞系中有一定的抗炎作用。而NaA 促進(jìn)IL-1β 的表達(dá)，提示NaA 可能對(duì)THP-1 細(xì)胞炎癥反應(yīng)起到促進(jìn)作 用，SCFAs 中，NaB 在THP-1 細(xì) 胞 中 的 抗 炎 作 用效果最為顯著。

SCFAs 通過(guò)結(jié)合GPCR 受體（GPR41、GPR43、GPR109a）調(diào)控下游的炎癥基因，但3 種SCFAS 對(duì)相同受體親和力并不相同，其中GPR41 對(duì)乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽具有相似的親和力，而GPR43 對(duì)丙酸鹽的親和力大于丁酸鹽，而對(duì)乙酸鹽的親和力低，只有丁酸鹽以低親和力與GPR109A 結(jié)合[13]。3 種SCFAs與GPCR 受體不同的結(jié)合程度可能是造成它們對(duì)THP-1 細(xì)胞炎癥反應(yīng)產(chǎn)生不同影響的原因。

為了進(jìn)一步探究NaB 在COPD 小鼠體內(nèi)的抗炎作用，本研究用60 mmol/L 的NaB 對(duì)COPD 小鼠進(jìn)行喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NaB 降低了COPD 小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 表達(dá)和血漿中IL-1β、IL-6 含量，說(shuō)明NaB 對(duì)COPD 小鼠全身和肺部的慢性炎癥均有一定程度的抑制作用。在COPD 病程中，NF-κB 能夠誘導(dǎo)多種炎性因子表達(dá)，如IL-6、IL-8、趨化因子、TNF-α 等，參與了氣道慢性炎癥反應(yīng)的眾多環(huán)節(jié)，并在一定程度上促進(jìn)了炎癥的發(fā)生發(fā)展。Western blotting 結(jié) 果 顯 示，NaB 降 低 了 肺 組 織NF-κB 磷 酸 化 水平，提示NaB 可能通過(guò)抑制NF-κB 通路來(lái)降低炎癥因子表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。該分子機(jī)制還需要在肺泡巨噬細(xì)胞上進(jìn)一步驗(yàn)證，NaB 如何調(diào)節(jié)NF-κB 蛋白表達(dá)也還需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，SCFAS 之一的丁酸鹽能顯著降低THP-1 細(xì)胞和COPD 小鼠中的炎癥反應(yīng)，可能的分子機(jī)制是通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路降低炎癥因子的表達(dá)，作為COPD 的抗炎候選藥物，丁酸鹽有望能成為治療COPD 慢性炎癥的新選擇。