N-乙酰-L-半胱氨酸通過AMPK/mTOR 途徑激活保護(hù)性自噬降低青蒿琥酯誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞死亡

任自敬，徐紅霞，李星閱，王 越，馬佳佳，周佩洋

（1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院；湖北襄陽 441000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北十堰 442000）

胰腺癌(pancreatic carcinoma, PC)是一種高度惡性腫瘤，早期診斷困難，發(fā)展迅速，對(duì)多種放化療藥物不敏感，預(yù)后極差，5 年生存率不足10%[1]。目前PC是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的第三大主要原因，如果沒有取得任何治療進(jìn)展，PC 預(yù)計(jì)到2030 年將位于第二位[1-3]，因此迫切需要新的有效治療策略。

青蒿琥酯(artesunate, ART)是從黃花蒿中提取的有效抗瘧疾成分青蒿素的衍生物，廣泛用于治療嚴(yán)重瘧疾，在推薦劑量下無明顯不良反應(yīng)。研究報(bào)道，除抗瘧性外，青蒿素類物質(zhì)還具有廣譜抗腫瘤效應(yīng)的潛能[4-7]。已有研究顯示，ART 可在體內(nèi)、外顯著抑制PC 的增殖，是一種有希望的PC 治療藥物[8-9]。ART結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)內(nèi)過氧化橋鍵，斷裂后可促進(jìn)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species, ROS）的產(chǎn)生。ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是ART 發(fā)揮效應(yīng)的機(jī)制之一，但是，目前明確ART 抑制PC 的方式是非凋亡依賴性的[8,10]，其他效應(yīng)機(jī)制尚不明確。

自噬是在各種壓力環(huán)境下對(duì)受損細(xì)胞器和細(xì)胞成分的分解代謝過程。自噬的激活水平對(duì)細(xì)胞的存活或死亡至關(guān)重要，不足或過量的自噬水平會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡，促進(jìn)細(xì)胞死亡。CORDANI 等[11]報(bào)道，ROS 可以作為細(xì)胞信號(hào)分子啟動(dòng)自噬小體的形成和降解，反過來，自噬通過清除蛋白質(zhì)聚集物和受損的細(xì)胞器降低氧化損傷和ROS 水平。如上所述，ROS可以參與自噬過程，同時(shí)也受到自噬的調(diào)控。前期研究發(fā)現(xiàn)，ART 誘導(dǎo)的PC 細(xì)胞死亡在NAC 的存在下受到抑制，但在PC 細(xì)胞中ART 誘導(dǎo)的ROS 與細(xì)胞自噬之間的關(guān)系尚不明確，需要做進(jìn)一步檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 胰腺癌細(xì)胞CFPAC-1、Capan-2 及BxPC3 購自武漢普諾賽生命科技有限公司，用10%胎牛血清（FBS）+1%青/鏈霉素（P/S），在飽和濕度的50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 ART 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，NAC（N-Acetyl-L-cysteine）、3-Methyladenine（3-MA）購自Selleck 公司，胎牛血清和高糖DMEM 購自GIBCO 公司，CCK8 購自Biosharp，ROS檢測(cè)試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，Hoechst 33342 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗體E-cadherin、N-cadherin及Vimentin、LC3、GAPDH購自Proteintech Group 公司，腺苷酸活化蛋白激酶α（adenosine monophosphate activated protein kinase α,AMPKα）、p-AMPKα、哺 乳 動(dòng) 物 雷 帕 霉 素 靶 蛋 白（mammalian target rapamycin，mTOR）、p-mTOR、p62購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)購自Thermo 公司，倒置顯微鏡購自O(shè)lympus 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞活力 收集對(duì)數(shù)期生長的CFPAC-1、Capan-2 及BxPC3 細(xì) 胞，以3 000 個(gè)/100 μL/孔接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用不同濃度的ART 單獨(dú)或聯(lián)合NAC、3-MA 干預(yù)48 h，每孔加入10 μL CCK8 溶 液，2 h 后 酶 標(biāo) 儀 檢 測(cè)450 nm 波 長 處每孔的吸光度值（A 值）。

1.2.2 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 收集血清饑餓12 h的CFPAC-1、Capan-2細(xì)胞，以50 000個(gè)/100 μL/孔接種到Transwell（8 μm,Corning）上室，下室是600 μL含20% FBS 的培養(yǎng)基，24 h 后取出上室進(jìn)行固定及結(jié)晶紫染色，用棉簽去除未遷移細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 DCFH-DA 探針檢測(cè)胞內(nèi) ROS 水平 經(jīng)干預(yù)后的各組細(xì)胞依據(jù)ROS 檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)。首先更換各組培養(yǎng)液為無血清DMEM，之后加入胞內(nèi)ROS 檢測(cè)探針DCFH-DA (dichlorofluorescin diacetate)和Hoechst 33342 共 同 孵 育15 min，最 后PBS 清洗3 次后，熒光顯微鏡檢測(cè)拍照。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)胞內(nèi)LC3 表達(dá) 經(jīng)干預(yù)后的各組細(xì)胞用40 g/L 多聚甲醛固定0.5 h，用免疫染色封閉液（碧云天）封閉2 h，然后將細(xì)胞和抗-LC3抗體（1∶500）4 ℃孵育過夜，PBS 清洗3 次，后給予熒光二抗Dylight549（1∶1 000）室溫避光孵育2 h，PBS 清洗3 次，用DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)拍照。

1.2.5 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá) 經(jīng)干預(yù)后的各組細(xì)胞用RIPA 蛋白裂解液進(jìn)行冰上裂解，后經(jīng)超聲破碎及12 000 r/min 離心15 min 獲得細(xì)胞總蛋白，用蛋白濃度檢測(cè)試劑盒進(jìn)行濃度檢測(cè)，各組均按30 μg 蛋白總量進(jìn)行Western blotting上樣電泳→封閉→一抗（1∶1 000）4 ℃孵育→二抗（1∶2 000）室溫孵育→ECL 顯影拍照，ImageJ 進(jìn)行結(jié)果定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism 7 作圖及統(tǒng)計(jì)分析。多組間采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，通過t檢驗(yàn)分析組間差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ART 抑 制PC 細(xì) 胞 的 生 長

為了評(píng)估ART 對(duì)PC 細(xì)胞的生長抑制作用，用6.25～400 μmol/L ART處理3種PC細(xì)胞株CFPAC-1、Capan-2及BxPC3。CCK8法檢測(cè),結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞相比，ART以劑量和時(shí)間依賴性方式抑制CFPAC-1、Capan-2 細(xì)胞生長（圖1A）。ART 處理CFPAC-1、Capan-2 及BxPC3 細(xì)胞72 h 半數(shù)最大抑制濃度（IC50）值分別為199 μmol/L、277 μmol/L、478 μmol/L（圖1B）。與BxPC3 細(xì) 胞 相 比，CFPAC-1、Capan-2 對(duì)ART 的敏感度更高。選擇200 μmol/L ART 干預(yù)PC 細(xì)胞48 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 ART 抑 制PC 細(xì) 胞 遷 移

Transwell 法檢測(cè)，結(jié)果顯示到ART 可以抑制CFPAC-1、Capan-2的遷移（圖2A）。Western blotting檢結(jié)果顯示到ART 可以明顯上調(diào)E-cadherin 的表達(dá)，下調(diào)N-cadherin及Vimentin的表達(dá)（圖2B、圖2C）。

2.3 ART 依 賴ROS 抗PC

DCFH-DA 探針測(cè)定胞內(nèi)ROS 水平，通過熒光顯微鏡觀察到ART 處理明顯增加了CFPAC-1、Capan-2 細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量，并且NAC 可以逆轉(zhuǎn)胞內(nèi)ROS 的含量，但ART 處理BxPC3 細(xì)胞未能引起胞內(nèi)ROS 明顯變化(圖3A、圖3B、圖3C)。為進(jìn)一步分析ART 誘導(dǎo)的ROS 在其抗腫瘤過程中的作用，用NAC 聯(lián)合200 μmol/L ART 處理CFPAC-1、Capan-2及BxPC3 細(xì) 胞，結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn)，NAC 明 顯 削 弱 了ART 對(duì)CFPAC-1、Capan-2 細(xì)胞活力的抑制(圖3D)。因此，認(rèn) 為ART 抑 制CFPAC-1、Capan-2 細(xì) 胞 呈ROS 依賴性。

圖3 ART 通過ROS 依賴性抑制胰腺癌細(xì)胞生長Fig.3 ART inhibited the growth of pancreatic cancer cells in a ROS-dependent manner

A：CFPAC-1、Capan-2 及BxPC3 細(xì)胞用0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L ART 分別處理24、48、72 h，用CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活力，以3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。B：ART 干預(yù)72 h 后各細(xì)胞系的IC50值。

2.4 NAC 增加ART 誘導(dǎo)的PC 胞內(nèi)自噬水平

過量的ROS會(huì)損傷細(xì)胞，增加胞內(nèi)的自噬水平。通過細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)到ART 可以促進(jìn)CFPAC-1、Capan-2胞內(nèi)自噬小體的形成，但意外的是在NAC聯(lián)合ART的干預(yù)組中觀察到更多的自噬小體（圖4A、圖4B）。為進(jìn)一步分析ART誘導(dǎo)的自噬在其抗腫瘤過程中的作用，本研究使用自噬抑制劑3-MA 預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)抑制自噬并不影響ART 對(duì)CFPAC-1 及Capan-2 細(xì)胞活力的抑制（圖4C），結(jié)果提示，ART 單獨(dú)處理誘導(dǎo)的自噬并非其抑制CFPAC-1及Capan-2細(xì)胞生長的機(jī)制。

A：Transwell 檢測(cè)200 μmol/L ART 處理抑制CFPAC-1、Capan-2 細(xì)胞的遷移；B：Western blotting 檢 測(cè)CFPAC-1、Capan-2 細(xì) 胞 中E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin 的表達(dá)；C：CFPAC-1 和Capan-2 細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 蛋 白表達(dá)的比較。*P＜0.05，**P＜0.01。

A、B：細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)CFPAC-1、Capan-2 細(xì)胞中LC3 的表達(dá)；C：給予3-MA 預(yù)處理2 h，之后ART 干預(yù)CFPAC-1、Capan-2 細(xì)胞48 h，通過CCK8 檢測(cè)細(xì)胞活力變化，以3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組比較，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.5 NAC 通過激活A(yù)MPK/mTOR 信號(hào)通路增強(qiáng)胞內(nèi)自噬水平

ART 可能誘導(dǎo)PC 細(xì)胞發(fā)生自噬，經(jīng)Western blotting 檢測(cè)，結(jié)果顯示，ART可以明顯升高CFPAC-1、Capan-2 細(xì) 胞p62、LC3II/I，下 調(diào)p-mTOR/mTOR的表達(dá)，證實(shí)PC 細(xì)胞中自噬效應(yīng)的激活，但對(duì)p-AMPKα/AMPKα 的表達(dá)無明顯影響。而NAC 可以 通 過 升 高p-AMPK α/AMPK α，進(jìn) 一 步 下 調(diào)p-mTOR/mTOR 的表達(dá)，升高p62、LC3II/I，增強(qiáng)細(xì)胞的自噬水平（圖5）。

3 討 論

胰腺癌對(duì)多種放化療藥物不敏感，迫切需要新的有效治療方案。ART 對(duì)多種腫瘤具有顯著抑制作用，且不良反應(yīng)小。已有研究證明，ART 抑制胰腺癌[8]，并呈現(xiàn)非caspase 依賴的凋亡途徑，其抗癌機(jī)制需要進(jìn)一步探究，以便了解ART 細(xì)胞毒性效應(yīng)的性質(zhì)和特征。與之前研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)，ART可抑制PC 細(xì)胞增殖，但不同的PC 細(xì)胞敏感性差異較大。相對(duì)而言，ART 對(duì)CFPAC-1、Capan-2 抑制效應(yīng)明顯高于BxPC3 細(xì)胞。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件，其特征是上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin 下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin 及Vimentin 上調(diào)。我們通過Transwell 及Western blotting 檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的變化發(fā)現(xiàn)，ART 通過抑制CFPAC-1、Capan-2細(xì)胞的遷移，上調(diào)E-cadherin 的表達(dá)，下調(diào)N-cadherin及Vimentin 的表達(dá)發(fā)揮抑制遷移的效應(yīng)。

裂解內(nèi)過氧化橋鍵產(chǎn)生ROS 是ART 發(fā)揮抗癌或抗瘧功能的關(guān)鍵[12-13]。氧化應(yīng)激是ROS 產(chǎn)生與細(xì)胞抗氧化劑防御之間不平衡的結(jié)果。當(dāng)ROS 過量產(chǎn)生，細(xì)胞抗氧化緩沖能力降低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。本研究使用ROS 熒光探針染料DCFDA 檢測(cè)到ART處理后CFPAC-1、Capan-2 胞內(nèi)ROS 的含量明顯增高，而BxPC3 胞內(nèi)ROS 的變化不明顯，這可能是BxPC3 細(xì)胞對(duì)ART 不敏感的原因。NAC 可以逆轉(zhuǎn)CFPAC-1、Capan-2胞內(nèi)ROS的含量，且削弱了ART對(duì)CFPAC-1、Capan-2 細(xì)胞活力的抑制效果?；谏鲜鼋Y(jié)果，確認(rèn)ART 依賴ROS 發(fā)揮抗胰腺癌的效應(yīng)。

ROS 是誘導(dǎo)自噬的主要激活信號(hào)之一，而自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要降解途徑[14]。ROS 與自噬之間相互作用的后果可能表現(xiàn)在兩個(gè)方面：細(xì)胞損傷或細(xì)胞存活。有研究報(bào)道，ART 通過下調(diào)HeLa 細(xì)胞的線粒體膜電位，改變細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，激活了依賴pink 的保護(hù)性自噬[15]。也有研究報(bào)道，ART 通過上調(diào)ROS，通過激活A(yù)MPK-mTORULK1 軸，誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞自噬依賴性凋亡[16]。然而，ART 處理PC 細(xì)胞后細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和自噬之間的作用結(jié)果尚未清楚闡明。我們通過LC3 細(xì)胞免疫熒光及自噬相關(guān)蛋白的檢測(cè)，證實(shí)ART 可以激活細(xì)胞自噬，而且自噬抑制劑3-MA 并不能削弱ART對(duì)PC 細(xì)胞的抑制效應(yīng)，推測(cè)ART 誘導(dǎo)的自噬是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的一種適應(yīng)性反應(yīng)。有趣的是，ART 聯(lián)合NAC 處理可以促進(jìn)PC 細(xì)胞形成更多的自噬小體。通過Western blotting 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NAC 聯(lián)合ART處理可以激活A(yù)MPK，下調(diào)mTOR 的磷酸化，上調(diào)p62、LC3II/I、Beclin1，加劇細(xì)胞自噬水平，恢復(fù)細(xì)胞活力。AMPK 是細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，在能量缺乏時(shí)被激活，通過促進(jìn)受損細(xì)胞的回收再利用維持能量穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡。鑒于ART 的作用靶標(biāo)及ROS 主要來源都是線粒體[15]，我們推測(cè)，ART 誘導(dǎo)ROS 可能導(dǎo)致PC 細(xì)胞線粒體受損，能量供給不足，進(jìn)而激活A(yù)MPK，激活胞內(nèi)的保護(hù)性自噬。因此，線粒體結(jié)構(gòu)、功能及胞內(nèi)抗氧化分子的變化后期需要做進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究檢測(cè)到ART 依賴ROS 而非自噬發(fā)揮抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的效果，是一種有希望的胰腺癌治療藥物。NAC 通過激活A(yù)MPK/mTOR 信號(hào)通路提高胞內(nèi)保護(hù)性自噬，削弱ART 抗胰腺癌作用。

A：Western blotting 檢測(cè)ART 聯(lián)合NAC 處理48 h 后CFPAC-1、Capan-2 細(xì)胞中p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p62 及LC3 的表達(dá)；B：CFPAC-1和Capan-2細(xì)胞中p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p62和LC3II/I蛋白表達(dá)的定量結(jié)果。兩組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。