雜萘聯(lián)苯聚芳醚酮的表面化學(xué)改性及成骨活性

柳承德，張楊陽，程習(xí)彤，蹇錫高

(1.大連理工大學(xué)化工學(xué)院高分子材料系，遼寧大連 116024； 2.大連理工大學(xué)遼寧省高性能樹脂工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116024)

骨植入材料作為生物醫(yī)用材料的一個重要分支，在骨修復(fù)、填充骨缺損和其他骨科手術(shù)中發(fā)揮著重要作用。聚醚醚酮(PEEK)是一種高性能工程塑料，由于其具有與人骨匹配的力學(xué)性能和化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在骨植入材料領(lǐng)域[1–4]。然而PEEK作為一種結(jié)晶性聚合物，溶解性很差，因此在成型加工方面受到一定的限制。本課題組開發(fā)的雜萘聯(lián)苯聚芳醚酮(PPEK)是一種新型聚芳醚酮熱塑性樹脂，通過引入扭曲非共平面的分子結(jié)構(gòu)，賦予了聚合物良好的溶解性和更高的耐熱性能。與PEEK相比，PPEK不僅加工性能更加優(yōu)異，并且其成本僅為PEEK的一半，因此其在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用具有相當(dāng)?shù)臐摿?。然而PPEK的表面為生物惰性，如何得到具有更好生物活性的PPEK仍是需要攻克的問題[5]。

植入體與體內(nèi)環(huán)境接觸后，細胞并不會與植入體材料表面發(fā)生直接相互作用。存在于生物體血液或其它體液中的蛋白質(zhì)將率先到達植入體材料表面并與之發(fā)生相互作用。植入物材料的表面理化性質(zhì)與其表面的蛋白吸附行為直接相關(guān)，而吸附在材料表面的蛋白又會進一步引發(fā)各種各樣的細胞行為和生物化學(xué)反應(yīng)[6]。通過改變材料表面的性質(zhì)，改善材料表面對蛋白質(zhì)的相互作用，從而解決PPEK的表面惰性問題具有重大的研究意義。有研究表明，羥基(—OH)[7]、磺酸基(—SO3H)[8–9]等化學(xué)基團的引入能增加材料表面蛋白質(zhì)的吸附，并且能促進成骨細胞的分化，改善骨再生性能[10]。筆者采用強還原劑將PPEK分子鏈中的羰基還原成為羥基，使用硫酸(H2SO4)和氯磺酸(HClO3S)在PPEK分子鏈上引入磺酸基團，并通過溶液涂覆的方法將含有羥基、磺酸基的PPEK涂覆于可溶性的PPEK表面，形成牢固結(jié)合的表面層，期望改善PPEK材料的表面惰性以及材料與蛋白質(zhì)的相互作用，進而改善其表面的成骨活性。

1 實驗部分

1．1 主要原料

PPEK：0539，大連寶力摩新材料有限公司；

二甲基亞砜(DMSO) (99%)、硼氫化鈉(NaBH4)(98%)及HClO3S (99%)：阿拉丁試劑(上海)有限公司；

α-最低必需培養(yǎng)基(α-MEM)、胎牛血清(FBS)、鏈霉素-青霉素：美國Hyclone公司；

人體纖連蛋白(Fn)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、96孔細胞培養(yǎng)板(無菌)、6孔細胞培養(yǎng)板(無菌)：索萊寶生物科技有限公司；

TRIZOL試劑、DAPI染色液、TRITC染色液：北京酷萊博科技有限公司；

細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)、全蛋白提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)試劑盒、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、改良的聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白檢測試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)蛋白檢測試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1．2 主要設(shè)備及儀器

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀：IS50型，美國Thermo Nicolet公司；

X射線光電子能譜(XPS)儀：ESCALAB 250Xi型，英國Thermo Fisher Scientific公司；

接觸角測量儀：DSA30S型，德國KRUSS公司；

耗散型石英晶體微天平(QCM-D)分析儀：Q-SENSE ANALYZER型，瑞典Biolin Scientific AB公司；

單光子激光共聚焦顯微鏡：FV1000型，日本Olympus公司；

酶標儀：Epoch2T型，美國Bio Tek 公司；

熒光定量PCR儀：LightCycler480II-96well型，瑞士Roche公司。

1．3 PPEK表面改性

將PPEK粉料通過高溫模壓得到厚度為1 mm的PPEK薄板，并裁剪成1 cm×1 cm小片，打磨拋光后用丙酮、乙醇、去離子水依次超聲清洗10 min，在真空烘箱中烘干備用。

表面羥基化PPEK樣品(PPEK-OH)的制備：根據(jù)文獻[11]報道的方法將PPEK主鏈的羰基還原為羥基。在帶有回流冷凝裝置的三口燒瓶中加入200 mL DMSO和0.45 g NaBH4，加熱至120℃，待NaBH4完全溶解，將5 g PPEK粉料浸入反應(yīng)溶液中。在氮氣保護條件下120℃反應(yīng)24 h，把反應(yīng)溶液沉降在冰水混合物中，析出絮狀的產(chǎn)物。用去離子水洗滌數(shù)次后在80℃鼓風(fēng)烘箱中烘干備用。用上述烘干的產(chǎn)物配置成10 mg/mL的氯仿溶液，旋涂在1 cm×1 cm PPEK片的表面(1 000 r/min)，每個樣品重復(fù)旋涂5次，最后置于60℃鼓風(fēng)烘箱中放置6 h烘干溶劑，標記為PPEK-OH。

表面磺化PPEK樣品(PPEK-SO3H)的制備：根據(jù)文獻[12]報道的方法對PPEK材料進行磺化改性。在帶有冷凝回流裝置的三口燒瓶中加入5.0 g的PPEK和70 mL的H2SO4，劇烈攪拌至聚合物完全溶解。用恒壓滴液漏斗緩慢滴加10 mL的HClO3S，在90℃條件下反應(yīng)8 h后，將反應(yīng)溶液沉降在冰水混合物中，析出絮狀的產(chǎn)物。用去離子水洗滌數(shù)次后在80℃鼓風(fēng)烘箱中烘干備用。用上述烘干的產(chǎn)物配置成10 mg/mL的氯仿溶液，旋涂在1 cm×1 cm PPEK片的表面(1 000 r/min)，每個樣品重復(fù)旋涂5次，最后置于60℃鼓風(fēng)烘箱中放置6 h烘干溶劑，標記為PPEK-SO3H。

PPEK兩種化學(xué)改性(羥基化和磺化)流程如圖1所示。

圖1 PPEK的化學(xué)改性流程

1．4 細胞相容性和成骨分化活性測定

細胞培養(yǎng)：用α-MEM培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細胞，培養(yǎng)基中含10%的FBS和1%的鏈霉素-青霉素。細胞每三天傳代一次，每天更新一次細胞培養(yǎng)基。

細胞毒性測定：采用培養(yǎng)細胞所用的培養(yǎng)基在37℃條件下對樣品分別浸提24 h。將細胞懸液以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)4 h。然后，用不同濃度的浸提液更換培養(yǎng)基。孵育1，3 d后，每孔加10 μL 3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)的PBS溶液(5 mg/mL)。在37°C孵育4 h后，移出溶液，加入100 μL DMSO溶解甲醛晶體。用酶標儀在570 nm波長下測吸光度，細胞活力與所測吸光度的值呈正比。

細胞增殖：將細胞懸液以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，并與樣品一起培養(yǎng)。在預(yù)定的時間點，移出樣品，向培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8溶液。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度。

細胞貼附：將1×104個細胞接種在樣品表面，置于6孔細胞培養(yǎng)板中共培養(yǎng)24 h。經(jīng)過4%多聚甲醛溶液固定20 min后，室溫下TRITC染色30 min，DAPI染色2 min，用單光子激光共聚焦顯微鏡觀察樣品表面的細胞形態(tài)。

ALP活性測定：將1×104個細胞與樣品共培養(yǎng)于6孔細胞培養(yǎng)板中，測定ALP活性以評估成骨分化的情況。在培養(yǎng)7，14 d后，取出樣品，用1%的Triton X-100在4℃下裂解細胞。以14 000 r/min的速度離心之后，用改良的BCA蛋白檢測試劑盒計算上清液總蛋白含量。ALP活性的測定是通過量化對硝基苯酚來確定的，對硝基苯酚是磷酸對硝基苯的最終產(chǎn)物，用ALP蛋白檢測試劑盒對其進行定量。最后，對ALP活性與總蛋白的相應(yīng)含量進行歸一化。

實時熒光檢測PCR (RT-PCR)檢測成骨基因相關(guān)表達：MC3T3-E1細胞的成骨基因表達是通過RT-PCR測定的。將1×104個細胞接種在6孔細胞培養(yǎng)板中與樣品共培養(yǎng)3，7，14 d，提取細胞的信使核糖核酸(mRNA)。此后，在金屬浴中將其逆轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸(cDNA)。所選基因的正向和反向引物見表1。通過RT-PCR進行定量分析成骨相關(guān)基因[包括ALP，轉(zhuǎn)錄因子(Runx2)和I型膠原蛋白(COL-I)]的表達結(jié)果。每個基因的相對mRNA表達水平通過循環(huán)閾值與管家基因3-磷酸甘油酯脫氫酶(GAPDH)進行歸一化確定。

表1 成骨相關(guān)基因引物序列[13]

1．5 性能測試與表征

FTIR測試：采用全反射的方法對樣品表面進行測試，波數(shù)范圍是400～4 000 cm-1。

XPS測試：激發(fā)源為Cu Kα，起飛角為20°，結(jié)合能用烷基碳C(1s)峰(284.8 eV)進行校正。

水接觸角測試：以去離子水為檢測液體，每次注射5 μL在樣品表面，用接觸角測量儀測試材料表面的接觸角。

QCM-D測試：將樣品用氯仿配置成10 mg/mL的溶液，旋涂在QCM-D金芯片表面(轉(zhuǎn)速1 000 r/min)，每個芯片重復(fù)旋涂五次，然后在80℃真空烘箱中烘干溶劑。QCM-D測試前先通入PBS溶液沖洗至少10 min，再通入20 μg/mL的Fn溶液，待吸附穩(wěn)定后分別用PBS溶液和1%的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液沖洗，進液流速為100 μL/min。

1．6 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差，使用Student′s t-test檢測兩個樣品組之間有無顯著性差異，P<0.05視為和PPEK相比有統(tǒng)計學(xué)差異，在后續(xù)柱狀圖中用＊表示。

2 結(jié)果與討論

2．1 PPEK化學(xué)改性分析

圖2為PPEK，PPEK-OH和PPEK-SO3H的FTIR譜圖。由圖2可以看出，PPEK的紅外吸收峰與本課題組[14]之前的研究結(jié)果一致，PPEK-OH在3 400 cm–1處出現(xiàn)羥基的特征吸收峰，而PPEKSO3H在1 500 cm–1和1 474 cm–1處出現(xiàn)了芳香取代吸收峰，結(jié)合1 020 cm–1和1 075 cm–1處磺酸基的對稱和不對稱伸縮振動峰，說明磺酸基已經(jīng)成功引入到PPEK主鏈上[14]。

圖2 PPEK，PPEK-OH和PPEK-SO3H的FTIR譜圖

圖3是PPEK，PPEK-OH和PPEK-SO3H的XPS全譜圖。由圖3可以看到，對比PPEK和PPEK-OH樣品，PPEK-SO3H的表面除了C，N，O元素之外還檢測到了S元素的信號。表2為根據(jù)XPS數(shù)據(jù)計算出的PPEK，PPEK-OH和PPEKSO3H表面各元素相對含量。表2顯示，PPEKSO3H表面S元素的相對含量為1.2%。

圖3 PPEK，PPEK-OH和PPEK-SO3H的XPS譜圖

表2 不同樣品表面各元素相對含量 %

圖4是PPEK，PPEK-OH和PPEK-SO3H的XPS高分辨O1s譜圖。表3為不同試樣表面O1s譜圖中各成鍵相對含量。由圖4可以看出PPEK的高分辨O1s譜圖主要歸為529.8 eV和531.8 eV處的C=O和C—O，伴隨著PPEK表面的還原反應(yīng)，一部分C=O轉(zhuǎn)化為C—O，在高分辨O1s譜圖這兩處的強度也有相應(yīng)的變化，并且在530.9 eV出現(xiàn)了歸屬于O—H的峰，同時表3顯示O—H在PPEK-OH的O1s譜圖中的成鍵相對含量達到9.2%。在PPEK-SO3H的高分辨O1s譜圖中除了C=O和C—O之外，在530.7 eV處出現(xiàn)了歸屬于S=O和S—O的信號峰，同時表3顯示S=O和S—O在PPEK-SO3H的O1s譜圖中的成鍵相對含量達到26.2%。

圖4 PPEK，PPEK-OH和PPEK-SO3H的XPS高分辨O1s譜圖

表3 不同樣品表面O1s譜圖中各成鍵相對含量%

為了對官能化改性的PPEK的表面性能進一步研究，對三種樣品的表面水接觸角進行了測試，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，對比未改性的PPEK，PPEK-OH的表面水接觸角從86°下降到79°，PPEK-SO3H的表面水接觸角下降到了61°。FTIR和XPS均證明了PPEK-OH和PPEK-SO3H的成功制備，并且接觸角數(shù)據(jù)表面改性后材料的親水性變好。

圖5 PPEK，PPEK-OH和PPEK-SO3H的表面水接觸角

2．2 表面蛋白吸附能力評價

植入體材料表面吸附的蛋白是組織細胞與植入體材料之間聯(lián)系的紐帶。通過QCM-D測定了不同樣品表面的Fn吸附密度。根據(jù)式(1)[9]計算得到的三種樣品表面最大Fn吸附密度如圖6所示。圖6顯示，PPEK樣品表面的Fn吸附密度為302 ng/cm2，PPEK-OH和PPEK-SO3H樣品表面的Fn吸附密度分別達到364，404 ng/cm2，相較PPEK樣品提高了20.5%和33.8%。

圖6 PPEK，PPEK-OH和PPEK-SO3H樣品表面Fn吸附密度

式中：?m——Fn吸附密度，ng/cm2；

C——晶體的質(zhì)量靈敏度常數(shù)，取C=17.7 ng/cm2；

n——頻率倍數(shù)，取n=3；

Δfn——QCM-D芯片的頻率變化。

QCM-D芯片振動頻率下降的絕對值與吸附在芯片表面的蛋白質(zhì)質(zhì)量呈正比。圖7分別是三種樣品的QCM-D芯片的振動頻率曲線(圖7中縱坐標的標值負號表示頻率下降)。由圖7可以看到，在蛋白吸附穩(wěn)定后通入PBS溶液，芯片振動頻率曲線均沒有明顯的變化，說明其表面吸附的蛋白沒有脫落。在通入SDS溶液后，三個樣品的芯片振動頻率曲線都經(jīng)歷了先下降又上升的過程，并且最終穩(wěn)定。然而PPEK-OH和PPEK-SO3H樣品振動頻率相對于通入PBS前變化不大，而未經(jīng)修飾的PPEK樣品振動頻率相對于通入PBS前明顯上升。這說明PPEK-OH和PPEK-SO3H表面吸附的蛋白與基體材料之間的相互作用更強。

圖7 不同樣品表面吸附蛋白后QCM-D芯片頻率變化

2．3 MC3T3-E1成骨細胞相容性及成骨活性評價

采用MTT法測定樣品浸提液的細胞毒性。培養(yǎng)在PPEK，PPEK-OH和PPEK-SO3H樣品上的MC3T3-E1成骨細胞孵育1，3 d后的細胞活力如圖8所示。由圖8可以看出，樣品提取物對MC3T3-E1成骨細胞沒有明顯的細胞毒性，細胞存活率均大于85%。結(jié)果表明，三種樣品都不會在浸提液中釋放影響細胞生長的物質(zhì)，不具有細胞毒性。

圖8 培養(yǎng)在不同樣品上的MC3T3-E1成骨細胞的細胞活力

通過CCK-8法定量分析可以快速、準確地檢測細胞在不同樣品表面的增殖活性情況，在固定波長(450 nm)處的吸光度與活細胞數(shù)量呈正比。圖9展示了不同培養(yǎng)時間點MC3T3-E1成骨細胞在PPEK，PPEK-OH和PPEK-SO3H表面的增殖活性結(jié)果。從圖9可以看出，MC3T3-E1成骨細胞在PPEK-OH和PPEK-SO3H表面的增殖情況顯著優(yōu)于其在未改性PPEK表面的增殖情況，并且PPEKSO3H表面的成骨細胞增殖活性最高。這說明PPEK-OH樣品表面的羥基和PPEK-SO3H樣品表面的磺酸基均促進了MC3T3-E1成骨細胞在材料表面的增殖生長，其中磺酸基的促進效果更好。

圖9 培養(yǎng)在不同樣品表面的MC3T3-E1成骨細胞在不同時期的增殖結(jié)果(*代表有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05)

良好的生物相容性對細胞的貼附生長至關(guān)重要[15]。通過單光子激光共聚焦顯微鏡觀察MC3T3-E1成骨細胞在PPEK，PPEK-OH和PPEKSO3H表面的生長貼附情況，結(jié)果如圖10所示。由圖10可以看出，細胞在三種樣品表面貼附狀態(tài)良好，細胞核呈球形或橢球型，細胞膜的鋪展狀態(tài)良好。PPEK樣品表面貼附的細胞數(shù)量較少，PPEKSO3H樣品表面的細胞數(shù)量最多，幾乎鋪滿了整個表面。說明PPEK-SO3H樣品為成骨細胞的貼附提供了更好的表面微環(huán)境，促進了細胞的鋪展和生長。

圖10 MC3T3-E1成骨細胞貼附在不同樣品表面的熒光共聚焦顯微鏡圖像

ALP活性是衡量骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞分化程度和成骨細胞功能狀態(tài)的重要指標，也是評價機體成骨活性和組織鈣化能力的具體指標[16]。用MC3T3-E1成骨細胞的相對ALP活性作為衡量成骨活性的指標。圖11是MC3T3-E1成骨細胞在PPEK，PPEK-OH和PPEK-SO3H表面生長7 d和14 d的相對ALP活性測試結(jié)果。由圖11可以看出，成骨細胞在PPEK-OH和PPEK-SO3H表面生長7 d和14 d后，都表現(xiàn)出比PPEK更高的ALP活性，表明化學(xué)改性后的PPEK，尤其是PPEK-SO3H具有明顯的促成骨效果。

圖11 MC3T3-E1成骨細胞在不同樣品表面培養(yǎng)7，14 d的相對ALP活性(*代表有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05)

圖12是MC3T3-E1成骨細胞在PPEK，PPEKOH和PPEK-SO3H樣 品 表 面 生 長3，7，14 d后ALP，COL-I和RUNx2基因的表達結(jié)果。由圖12可以看出，與未改性的PPEK樣品相比，PPEK-OH和PPEK-SO3H表面生長的細胞的成骨分化相關(guān)基因ALP，COL-I和RUNx2的表達水平顯著提高。以上數(shù)據(jù)結(jié)果表明，PPEK-OH和PPEK-SO3H都可以促進MC3T3-E1細胞的成骨分化，其中PPEKSO3H的效果更好。

圖12 MC3T3-E1成骨細胞在不同樣品表面培養(yǎng)不同時間的成骨相關(guān)基因表達結(jié)果(*代表有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05)

3 結(jié)論

(1)采用化學(xué)方法在PPEK主鏈上分別引入了羥基和磺酸基，通過模壓和溶液涂覆的方法獲得了表面羥基修飾的PPEK樣品PPEK-OH和表面磺酸基修飾的PPEK樣品PPEK-SO3H。研究了不同PPEK樣品對Fn的吸附作用，發(fā)現(xiàn)PPEK-OH和PPEK-SO3H表面對Fn有較強的相互作用，其中PPEK-SO3H表面吸附量更多也更穩(wěn)定。

(2)細胞實驗結(jié)果表明，與未改性的PPEK相比，PPEK-OH和PPEK-SO3H表面能改善成骨細胞的增殖、貼附與成骨分化活性，并且PPEK-SO3H表面表現(xiàn)出更好的促成骨作用。