萱草葉片響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

黃東梅 陳 穎 白 露 倪迪安 徐奕揚(yáng) 張志國(guó) 秦巧平

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)生態(tài)技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

萱草（）為阿福花科（Aspho?delaceae）萱草屬（）的多年生宿根草本植物，是一種深受大眾喜愛(ài)的植物，被廣泛種植用于藥用和觀賞等方面。近年來(lái)，萱草成為研究者的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象之一，萱草花發(fā)育、衰老和遺傳機(jī)理研究也成為熱點(diǎn)。低溫脅迫是植物生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遭遇的一種災(zāi)害，是限制農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育、生產(chǎn)力及地理分布的重要非生物脅迫之一，影響植株的生長(zhǎng)和發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量的損失。但是也有部分植物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)自身生理和生化的反應(yīng)來(lái)提高對(duì)低溫的耐受力，從而減輕甚至消除低溫脅迫所帶來(lái)的傷害，包括細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定、低溫保護(hù)性多肽的合成及可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸的積累。但事實(shí)上，植物從接受低溫信號(hào)到引起生理生化的響應(yīng)，再到產(chǎn)生抗寒能力，這整個(gè)過(guò)程存在著復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，需要調(diào)節(jié)大量相關(guān)基因的表達(dá)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）可以高通量、快速地檢測(cè)基因差異表達(dá)、基因特異性表達(dá)，全面地揭示逆境脅迫下整個(gè)基因組水平的表達(dá)情況，從而探明植物在逆境脅迫下的相關(guān)應(yīng)答途徑，目前在許多物種上已經(jīng)有了相關(guān)的報(bào)道，如擬南芥（）、狗牙根（）、玉米（）等。Niu 等通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定出了24 個(gè)基因家族與桃（）冷應(yīng)答相關(guān)，其中相關(guān)程度最高的基因家族是/，其次是和基因家族。Hao 等通過(guò)模擬自然氣候變化建立冷適應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)（）轉(zhuǎn)錄組在冷馴化的初始階段就開(kāi)始變化發(fā)生，而與細(xì)胞壁相關(guān)基因的變化貫穿了整個(gè)冷馴化過(guò)程。擬南芥轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明CBF2 和ZAT12 轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫下冷應(yīng)答途徑中發(fā)揮著重要作用，且除常見(jiàn)的基因誘導(dǎo)外，基因的抑制在植物冷馴化中也發(fā)揮不可或缺的作用。Hong等通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了水稻（）參與冷應(yīng)激反應(yīng)和晝夜節(jié)律模式基因在體內(nèi)差異表達(dá)所產(chǎn)生串?dāng)_的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)參與光合作用的光捕獲復(fù)雜蛋白與串?dāng)_關(guān)系緊密。

目前，萱草轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究雖有報(bào)道，本課題組李昊通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出了萱草抗旱品種‘猛子花’在干旱條件下較敏感品種‘害羞老虎’高表達(dá)水平的140個(gè)基因，Li等通過(guò)將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與EST-SSR 標(biāo)記結(jié)合，探討了萱草黃花菜的遺傳多樣性及在群體結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用。但低溫條件下萱草葉片轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)萱草低溫處理組和對(duì)照組葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，探索萱草低溫脅迫分子響應(yīng)機(jī)理，以期為耐寒萱草種質(zhì)開(kāi)發(fā)、分子育種提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

以 萱 草‘阿 斯 隆’（‘Ath?lone’）為材料，根據(jù)多年的觀察，萱草‘阿斯隆’是長(zhǎng)三角地區(qū)栽培萱草中耐寒性較強(qiáng)的品種之一，可作為研究常綠萱草潛力品種。采集長(zhǎng)勢(shì)良好且生長(zhǎng)狀況一致的萱草葉片（15 ℃，設(shè)為對(duì)照組T），用蒸餾水洗凈晾干，液氮速凍并于?80 ℃下儲(chǔ)存用于后續(xù)試驗(yàn)。后將萱草移至室內(nèi)恒溫培養(yǎng)箱，在10、5、0 ℃下培養(yǎng)24 h 后采集樣品，分別命名為低溫處理組T、T、T組。取樣部位為完全展開(kāi)的功能葉片，每組設(shè)置了3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 RNA的提取及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

使用改良的CTAB 法提取葉片總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解及污染程度，NanoDrop 檢測(cè)RNA 的純度、濃度、核酸吸收峰，安捷倫2100 RNA Nano 6000 Assay Kit 精確檢測(cè)總RNA 的完整性和濃度，?80 ℃保存?zhèn)溆?。用帶有Oligo（dT）的磁珠富集萱草mRNA，加入fragmenta?tion buffer 將mRNA 進(jìn)行隨機(jī)打斷，再以片段化的mRNA 為模板，采用M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒合成cDNA。利用AMPure XP beads 純化cD?NA，選擇合適大小的片段進(jìn)行PCR富集得到cDNA文庫(kù)，再用Agilent 2100對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)控。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及組裝

將檢測(cè)合格的樣品提交Illumina HiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海中科新生命生物科技有限公司）。對(duì)測(cè)序得到的原始測(cè)序數(shù)據(jù)（Raw Reads）通過(guò)去低質(zhì)量序列、接頭污染及N 比例大于5%的reads等過(guò)程完成數(shù)據(jù)處理得到高質(zhì)量的有效測(cè)序數(shù)據(jù)（Clean Reads）。再采用Trinity 對(duì)clean reads 進(jìn)行組裝成Unique序列。

1.4 基因功能注釋

將測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了五大數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能注釋。利用NCBI BLAST2.6.0+（Evalue<10）在NCBI 的NR（non-redundant protein data?base）數(shù) 據(jù) 庫(kù)、Swiss-port（swissprot protein se?quenced database）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因功能進(jìn)行注釋?zhuān)坏鞍准易澹≒fam）使用HMMER3.0（Evalue<10）分類(lèi)；基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and ge?nome，KEGG）注釋分別使用Blast2Gov2（Evalue<10）和KAAS（Evalue<10）軟件結(jié)合BLASTX 對(duì)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋進(jìn)行。

1.5 差異表達(dá)基因的篩選及相關(guān)分析

將低溫處理組T、T、T分別與對(duì)照組T進(jìn)行比較，以|logfold-change|≥2，-value≤0.05 為閾值進(jìn)行差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs）的篩選。隨后在1.4 中篩選出差異表達(dá)基因的GO 和KEGG 注釋?zhuān)⑦M(jìn)行分類(lèi)。再用jvenn（http：//www. bioinformatics. com. cn/static/others/jvenn/example.html）繪制DEGs 韋恩圖，用heatmap?per（http：//www.heatmapper.ca/expression/）繪制3 個(gè)低溫處理組共有DEGs 在低溫脅迫過(guò)程中的表達(dá)變化，用String（https：//string-db.org/）和Cytoscape進(jìn)行基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。

1.6 基因表達(dá)的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證萱草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從差異表達(dá)基因中隨機(jī)選擇12 條基因進(jìn)行qRT-PCR。利用Prim?er5（https：//sg. idtdna. com/pages/tools/primerquest）網(wǎng)站根據(jù)所選12 條基因的cDNA 序列設(shè)計(jì)定量表達(dá)分析所用引物?；诒菊n題組前期對(duì)6 個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 內(nèi)參基因的篩選分析，UBQ 在萱草‘阿斯隆’中穩(wěn)定性較好，用作本研究的內(nèi)參（見(jiàn)表1）。提取葉片總RNA，檢測(cè)合格后采用MMuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。qRT-PCR 檢測(cè)在熒光PCR 定量?jī)x中進(jìn)行，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40 次；熔解曲線采集程序?yàn)?5 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。采用2法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

表1 差異表達(dá)基因qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers for 12 DEGs

2 結(jié)果與分析

2.1 萱草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝與數(shù)據(jù)評(píng)估

構(gòu)建了低溫處理組（10、5、0 ℃）和對(duì)照組（15 ℃）萱草葉片cDNA文庫(kù)，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，四組分別平均獲得46 376 031、42 120 296、41 392 792、44 378 448 條Clean Reads，6.44GB、5.86GB、5.74GB、6.16GB 的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，平均GC 含量分別為45.47%、45.17%、45.35%、45.88%，Q20平均值分別為98.24%、98.18%、98.29%、98.30%，Q30平均值分別為94.57%、94.45%、94.68%、94.73%（見(jiàn)表2），表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

表2 萱草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估Table 2 Evaluation of transcriptome sequencing data in H.fulva

低溫處理組和對(duì)照組萱草葉片樣本轉(zhuǎn)錄組Clean Reads 經(jīng)Trinity 軟件組裝后共獲得≥200 bp的Unigene 143 636 條，其中最大轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為9 494 bp，最小轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為201 bp，平均長(zhǎng)度為602 bp，N50 值為936 bp。圖1 為組裝轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度分布，其中長(zhǎng)度≥1 kB 的轉(zhuǎn)錄本共計(jì)22 326 條，占總轉(zhuǎn)錄本數(shù)的15.54%。Unigenes 注釋同源基因的物種分布顯示，相似序列較高的物種中占比例最高的為蘆筍（），其次為油棕（）、栓皮櫟（）和海棗（）。

圖1 3個(gè)低溫處理組和對(duì)照組萱草轉(zhuǎn)錄組unigenes平均長(zhǎng)度分布Fig.1 Average unigenes length distribution of transcriptome in three low temperature treatment groups and control group

2.2 差異表達(dá)基因的篩選及分類(lèi)

將3個(gè)低溫處理組（T、T、T）樣品中表達(dá)的基因與對(duì)照組T的基因進(jìn)行比較顯示，隨著溫度的下降，上調(diào)差異表達(dá)基因減少，下調(diào)差異表達(dá)基因增多。以FDR<0.001，|logfold-change|≥2，≤0.001為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出差異表達(dá)基因2 457個(gè)，其中上 調(diào) 基 因1 253 個(gè)，T、T、T低 溫 處 理 組 分 別 為1 038、385、112個(gè)；下調(diào)基因1 204個(gè)，T、T、T冷處理分別為697、532、315個(gè)（見(jiàn)圖2）。

圖2 DEGs韋恩圖Fig.2 Venn diagrams of DEGs

對(duì)DEGs 進(jìn)行GO 富集分析，將差異表達(dá)基因分為生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3 大類(lèi)（見(jiàn)圖3）。結(jié)果顯示，上下調(diào)差異基因的GO Terms 基本一致。差異表達(dá)基因涉及生物學(xué)過(guò)程21 種，其中占比最大的為細(xì)胞過(guò)程（cellular process，上調(diào)29.46%、下調(diào)33.49%），其次是代謝過(guò)程（metabolic process，上調(diào)26.95%、下調(diào)30.72%）和單組織過(guò)程（single-organism process，上調(diào)22.63%、下調(diào)24.58%），不同的是光合作用（photosynthesis）僅有上調(diào)基因涉及，而內(nèi)膜系統(tǒng)（endomembrane system）為下調(diào)基因特有。在該分類(lèi)中有對(duì)刺激的反應(yīng)（response to stimulus）、對(duì)非生物刺激的反應(yīng)（response to abiotic stimulus）、細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)（cellular response to stimulus）、對(duì)溫度刺激的反應(yīng)（response to temperature stimulus）以及對(duì)寒冷的反應(yīng)（response to cold）等冷應(yīng)激相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。在細(xì)胞成分方面，上調(diào)差異基因涉及11 種，下調(diào)10 種，相差的Term 為捕光復(fù)合物（light-harvesting complex）。富集中細(xì)胞部分（cell part）和 細(xì) 胞（cell）占 比 最 大，均 為 上 調(diào)45.62%、下調(diào)46.14%；其次是細(xì)胞器（organelle，上調(diào)29.58%、下調(diào)27.95%）。上調(diào)差異基因涉及分子功能17 種，下調(diào)15 種，相差的2 個(gè)Term 為過(guò)氧化物酶活性（peroxidase activity）和天冬氨酸型內(nèi)肽酶活性（aspartic-type endopeptidase activity）。細(xì)胞成分占比較大的前3 項(xiàng)為催化活性（catalytic ac?tivity，上調(diào)27.71%，下調(diào)35.90%）、結(jié)合（binding，上調(diào)27.30%，下調(diào)23.86%）和轉(zhuǎn)移酶活性（transfer?ase activity，上調(diào)15.21%，下調(diào)15.54%）。

圖3 DEGS的GO富集分析Fig.3 GO term enrichment analysis of DEGs

KEGG代謝通路分析結(jié)果表明，上調(diào)基因共富集到41 條代謝途徑，下調(diào)基因39 條（見(jiàn)圖4）。這些代謝途徑可分為5大類(lèi)：代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程以及有機(jī)系統(tǒng)?；驍?shù)較多的幾條為代謝途徑（metabolic pathways）、次生代謝產(chǎn)物的生物合成（biosynthesis of secondary me?tabolites）、光合作用—觸角蛋白（photosynthesis-an?tenna proteins）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）和苯丙素生物合成（phenylpro?panoid biosynthesis）。從整體來(lái)看，下調(diào)基因的富集程度較上調(diào)基因更高，如在代謝途徑（metabolic pathways）、生物合成（biosynthesis of secondary me?tabolites）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工（protein processing in endoplasmic reticulum）和-亞麻酸代謝（alpha-Linolenic acid metabolism）等下調(diào)基因均比上調(diào)基因占比高。

圖4 DEGS的KEGG代謝通路分析1.代謝；2.遺傳信息處理；3.環(huán)境信息處理；4.細(xì)胞過(guò)程；5.有機(jī)體系統(tǒng)Fig.4 KEGG analysis of DEGs 1.Metabolism；2.Genetic information processing；3.Environmental information processing；4.Cellular processes；5.Organismal systems

2.3 與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的DEGs

對(duì)KEGG 富集通路“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”相關(guān)差異基因表達(dá)模式進(jìn)一步分析。發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)素（Auxin，IAA）信號(hào)通路中，Aux/IAA 編碼的等3 個(gè)DEGs 在T和T階段表達(dá)量均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，而后在T階段略有回升；SAUR 編碼的3 個(gè)DEGs呈現(xiàn)相反表達(dá)模式，在T階段表達(dá)量上升，為T(mén)階段的5.894 倍，表達(dá)量下調(diào)，為T(mén)階段的0.227 倍；SAUR 編碼的在T階段表達(dá)量高至T階段的13.623 倍（見(jiàn)圖5）。在細(xì)胞分裂素（cytokinine，CTK）信號(hào)通路中，A-ARR 編碼的2 個(gè)DEGs 中，在T階段表達(dá)量下調(diào)，T和T階段表達(dá)量相對(duì)T階段上調(diào)，甚至T階段時(shí)表達(dá)量超過(guò)T階段；另一個(gè)基因T階段表達(dá)量上調(diào)，T和T階段表達(dá)量下調(diào)至T階段與T階段持平。在茉莉酸（Jasmonic acid，JA）信號(hào)通路中，JAZ編碼的等4 個(gè)DEGs 中，4 個(gè)在T階段基因表達(dá)均顯著下調(diào)趨勢(shì)，而后等3個(gè)基因在T和T階段表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。

圖5 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其DEGs的表達(dá)模式Fig.5 Expression patterns of DEGs in plant hormone signal transduction pathway

2.4 與可溶性糖合成相關(guān)的DEGs

萱草低溫脅迫下可溶性糖代謝通路相關(guān)差異基因表達(dá)模式分析表明，基因在半乳糖代謝通路、淀粉和蔗糖代謝通路中均有參與（見(jiàn)圖6）。參與“半乳糖代謝”通路中的等5 個(gè)DEGs 表達(dá)量隨著溫度的下降均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，其中在T階段比T階段高28.114 倍（見(jiàn)圖6A）?！暗矸酆驼崽谴x”通路中，基因表達(dá)量隨著溫度的下降呈現(xiàn)出先下后上的趨勢(shì)，和基因表達(dá)量持續(xù)下降，而另外等6 個(gè)DEGs 表達(dá)量則先上升后下降（見(jiàn)圖6B）?！肮呛透事短谴x”通路中，4 個(gè)DEGs（?3、、、）表達(dá)量均在T階段達(dá)到頂峰（分別為T(mén)階段的6.135、4.900、4.215、5.013 倍），而后在T和T階段呈下降趨勢(shì)；另4 個(gè)DEGs（、-2 個(gè)）則在T階段表達(dá)量最低（分別為T(mén)階段的0.315、0.223、0.076、0.224 倍），而在T和T階段呈上升趨勢(shì)（見(jiàn)圖6C）。整體來(lái)說(shuō)，在低溫脅迫下，參與可溶性糖代謝的DEGs中，大多數(shù)基因的表達(dá)量較對(duì)照組高。

圖6 可溶性糖代謝通路及其DEGs的表達(dá)模式A.半乳糖代謝通路；B.淀粉和蔗糖代謝通路；C.果糖和甘露糖代謝通路Fig.6 Expression patterns of DEGs in soluble sugar metabolic pathways A.Galactose metabolism pathway；B.Starch and sucrose metabolism pathway；C.Fructose and mannose metabolism pathway

2.5 低溫誘導(dǎo)后共有的DEGs

韋恩圖（見(jiàn)圖2）表明，在2 457個(gè)差異基因中，T、T、T低溫處理組與對(duì)照組T相比共有的差異基因有29個(gè)，其中上調(diào)基因16個(gè)，下調(diào)13個(gè)（見(jiàn)圖7）。平均表達(dá)值熱圖分析結(jié)果表明，29 個(gè)基因的表達(dá)模式聚集為4 個(gè)分支。分支A 和B 具有相似的表達(dá)模式，這些分支里含有-（）、-（）、/-（）、-等基因，這些基因在低溫條件下表達(dá)量受抑制。分支C 和分支D 的表達(dá)模式相反，隨著溫度的下降，位于分支C 的（）、（）、-（）等基因的表達(dá)量表現(xiàn)為先上升后下調(diào)，而分支D 內(nèi)的-（）、-（）、（）等基因表現(xiàn)為先上升后下調(diào)再有所上調(diào)。-（）基因在受到低溫脅迫時(shí)表達(dá)量下調(diào)，被聚類(lèi)為A 分支，而另一個(gè)UDP 糖基轉(zhuǎn)移酶基因-（）卻表現(xiàn)為上調(diào)，聚類(lèi)位于C分支。

圖7 3個(gè)低溫處理組共有DEGs在低溫脅迫下的熱圖Fig.7 Heat map of the DEGs shared by three cold treatment groups

對(duì)這29 個(gè)基因進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)這些基因之間存在著許多調(diào)控關(guān)系，根據(jù)相關(guān)程度可劃分為4 個(gè)相對(duì)獨(dú)立的類(lèi)群（見(jiàn)圖8），/-，（）、，（）基因以及家族基因在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)主導(dǎo)地位。

圖8 3個(gè)低溫處理組共有DEGs在低溫脅迫下的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖圓的直徑與基因調(diào)控的相關(guān)程度成反比；形狀大小與基因調(diào)控的相關(guān)程度成正比；顏色從灰色到黑色表示基因調(diào)控的相關(guān)程度值從小到大Fig.8 Gene regulation networks among the 29 DEGs shared by three cold treatment groups The diameter of the circle is inversely proportional to the correlation degree of gene regulation.Shape size is proportional to the degree of correlation of gene regulation；The color range from gray to black indicates the degree of correlation of gene regulation from small to large

2.6 基因表達(dá)的qPCR分析

為驗(yàn)證萱草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，從DEGs中隨機(jī)選擇了12 個(gè)差異顯著的基因進(jìn)行qRT-PCR，該12 個(gè)差異表達(dá)基因中6 個(gè)基因表現(xiàn)為上調(diào)（見(jiàn)圖9：A～F），另6個(gè)基因表現(xiàn)為下調(diào)（見(jiàn)圖9：G～L）。其中有功能基因，如鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 酶基因（，見(jiàn)圖9A）；也有調(diào)節(jié)基因，如含蛋白質(zhì)MRL7L的硫氧還蛋白基因（--，見(jiàn)圖9G）。qRT-PCR結(jié)果表明，8個(gè)基因的qRT-PCR結(jié)果與在轉(zhuǎn)錄組內(nèi)的表達(dá)模式基本一致。

圖9 12個(gè)差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析柱形表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，折線表示轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；不同字母表示差異顯著，P<0.05Fig.9 Validation of the RNA-Seq results by qRT-PCR of 12 DEGs Column denotes mean±standard error，broken line denotes transcriptome data；Different letters denotes significant difference，P<0.05

3 討論

低溫脅迫對(duì)植物的危害眾多，主要包括酶活性降低、膜系統(tǒng)遭到破壞、光合作用效率降低、細(xì)胞失水等，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，生理生化反應(yīng)受抑制。在植物遭受低溫脅迫帶來(lái)的危害時(shí)，植物也會(huì)通過(guò)激活與冷應(yīng)答相關(guān)的基因，刺激各種信號(hào)分子、蛋白質(zhì)、初級(jí)和次級(jí)代謝物的變化，從而調(diào)節(jié)自身的生理生化反應(yīng)達(dá)到降低危害的效果。轉(zhuǎn)錄組能夠揭示逆境脅迫下整個(gè)基因組水平的表達(dá)情況，是研究細(xì)胞表型和功能的一個(gè)重要手段。通過(guò)分析植物材料在不同低溫處理?xiàng)l件下與對(duì)照相比基因表達(dá)的差異情況，明確差異基因所位于的代謝途徑及生物功能，有助于探索植物低溫脅迫分子響應(yīng)機(jī)理。

本研究以萱草‘阿斯隆’為材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法研究了‘阿斯隆’在10、5、0 ℃（分別為T(mén)、T、T組）條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與對(duì)照（15 ℃，T組）的差異。共篩選出差異表達(dá)基因2 457 個(gè)，其中上調(diào)基因1 253個(gè)，下調(diào)基因1 204 個(gè)。GO 功能富集分析結(jié)果表明，DEGs 主要富集在代謝過(guò)程、細(xì)胞器、催化活性、轉(zhuǎn)移酶活性等過(guò)程，且內(nèi)膜系統(tǒng)、過(guò)氧化物酶活性及天冬氨酸型內(nèi)肽酶活性等過(guò)程為下調(diào)基因特有。KEGG 代謝通路分析結(jié)果表明，DEGs 在代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路的富集程度尤為明顯，說(shuō)明低溫對(duì)萱草的代謝途徑影響較大。低溫脅迫下，細(xì)胞膜感測(cè)到了低溫，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞膜出現(xiàn)損傷，電解質(zhì)外滲。此時(shí)，植物會(huì)通過(guò)調(diào)整碳水化合物代謝，降低呼吸作用，減少糖分消耗來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定。

植物激素是植物防御的主要調(diào)節(jié)劑之一，復(fù)雜的激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)及其控制廣泛生理過(guò)程的能力使其在幫助植物適應(yīng)不利環(huán)境條件方面起著至關(guān)重要的作用。在本研究中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也是DEGs 富集的一個(gè)代謝通路，其中與IAA、CTK和JA 信號(hào)通路有關(guān)。生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄激活是生長(zhǎng)素在細(xì)胞核中的一項(xiàng)快速反應(yīng)，在IAA 信號(hào)通路中，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一步是生長(zhǎng)素受體與Aux/IAA 的相互作用，從而導(dǎo)致Aux/IAA 降解。在本研究中，Aux/IAA 蛋白編碼的DEGs、顯著下調(diào)，可能參與了萱草葉片響應(yīng)低溫反應(yīng)。細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑由磷酸化機(jī)制組成，該機(jī)制由細(xì)胞分裂素與組氨酸激酶受體結(jié)合而開(kāi)始，并隨著細(xì)胞分裂素反應(yīng)性基因在細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄而達(dá)到頂峰。應(yīng)答調(diào)節(jié)器（ARR）編碼在細(xì)胞分裂素應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄激活中起主要作用。本研究中ARR 編碼的2 個(gè)基因在低溫脅迫下表達(dá)量一個(gè)上調(diào)，一個(gè)下調(diào)，可能與萱草葉片低溫響應(yīng)有關(guān)。在JA 信號(hào)通路中，JAZ 蛋白是JA 信號(hào)的阻遏物，JA-Ile 通過(guò)促進(jìn)JAZ 蛋白與F-box 蛋白COI1 的結(jié)合以及隨后通過(guò)泛素蛋白連接酶的降解來(lái)緩解抑制作用。在本研究中，JAZ 蛋白編碼的等4 個(gè)DEGS 表達(dá)量均表現(xiàn)為下調(diào)，且E3 泛素蛋白連接酶（-）為3 個(gè)低溫處理組共有的差異基因，表達(dá)量也顯著下調(diào)（圖7），故推測(cè)這些基因在萱草葉片冷應(yīng)答中起重要作用。

糖在植物發(fā)育過(guò)程中既具有營(yíng)養(yǎng)作用，又有信號(hào)傳導(dǎo)作用。作為信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)體，糖可以影響植物生命周期的多種生理過(guò)程，并在轉(zhuǎn)錄和翻譯上起調(diào)節(jié)作用。糖代謝是整個(gè)生物體代謝的中心，連通蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、核酸及次生物質(zhì)等代謝。在本研究中，半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝和淀粉和蔗糖代謝通路也是DEGs 富集的幾個(gè)代謝通路。蔗糖代謝主要包括3 個(gè)代謝途徑，即Suc分解、己糖磷酸化以及磷酸化己糖的生物合成反應(yīng)。胞壁轉(zhuǎn)化酶（CWINV4）主要參與韌皮部質(zhì)外體卸載時(shí)蔗糖的分解，保持源—庫(kù)之間蔗糖的濃度梯度，促使蔗糖順利卸載。在本研究中，參與Suc 分解的、2 個(gè)基因以及參與己糖磷酸化的、-基因均顯著上調(diào)，且為3 個(gè)低溫處理組共有的上調(diào)差異基因，推測(cè)這些基因有極大可能性參與了萱草葉片冷應(yīng)答過(guò)程。參與磷酸化己糖生物合成的基因表達(dá)量有所下調(diào)，但并不顯著，可能參與了萱草葉片低溫響應(yīng)。

將T、T、T中的DEGS 相比較，確定了3 個(gè)低溫處理組均涉及的29個(gè)關(guān)鍵基因。基于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，在此著重研究在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)程度較高并且在上文中未涉及的、以及基因在冷應(yīng)答中的作用。ABCF5 是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一員，是依賴ATP 的膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠通過(guò)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外膜轉(zhuǎn)運(yùn)各種分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、化學(xué)治療藥物等，對(duì)植物響應(yīng)低溫脅迫反應(yīng)有積極作用。卵形家族蛋白（OFPs）為植物特有，是一類(lèi)在植物發(fā)育中具有重要作用的負(fù)調(diào)控蛋白，被廣泛應(yīng)用與植物果實(shí)形狀、根形態(tài)等方面的研究，在調(diào)節(jié)植物生理并賦予其對(duì)干旱和寒冷脅迫的抵抗力方面也發(fā)揮著重要作用。SWEETs 是一類(lèi)具有7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白有著雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，可調(diào)節(jié)葡萄糖跨膜吸收，作為糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體參與糖的運(yùn)輸?；虻恼{(diào)控對(duì)生物和非生物脅迫有著多種影響，在擬南芥、茶樹(shù)以及甘藍(lán)等多種植物上均有基因參與低溫響應(yīng)的相關(guān)報(bào)道。本研究中，萱草基因在低溫脅迫下表達(dá)量顯著上升，與在番茄（）、擬南芥等研究中的結(jié)果一致。故推測(cè)這些基因極有可能在萱草葉片響應(yīng)低溫脅迫中起重要的調(diào)控作用。