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    構(gòu)樹轉(zhuǎn)錄因子BpbZIP1的鑒定及鎘脅迫響應(yīng)分析

    2022-05-19 07:21:50陳思思謝牧洪崔茂凱李文凱徐正剛賈彩霞楊桂燕
    植物研究 2022年3期
    關(guān)鍵詞:構(gòu)樹擬南芥酵母

    陳思思 謝牧洪 崔茂凱 李文凱 徐正剛 賈彩霞 楊桂燕

    (西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院,陜西省經(jīng)濟(jì)植物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,楊凌 712100)

    近些年,由采礦、廢氣排放、污水灌溉、重金屬超標(biāo)制品濫用等人為因素致使含有重金屬的污水或者廢料排放到土壤里,導(dǎo)致土壤受到嚴(yán)重的重金屬污染。重金屬在土壤中能引起土壤成分、結(jié)構(gòu)和功能的改變,重金屬離子通過抑制作物根系生長(zhǎng)和光合作用,使作物減產(chǎn),糧食的生產(chǎn)面積縮小。更為嚴(yán)重的是,重金屬可以通過食物鏈轉(zhuǎn)移到動(dòng)物和人體內(nèi),嚴(yán)重危害動(dòng)物和人的健康。隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程加快,我國(guó)土壤重金屬污染問題日益加劇,在眾多重金屬污染中,鎘(Cd)被確認(rèn)為我國(guó)土壤的首要污染物。鎘在自然環(huán)境中具有化學(xué)活性強(qiáng)、移動(dòng)性大、毒性持久、易富集等特點(diǎn),因此受鎘污染土壤的治理難度很大。植物修復(fù)利用自然生長(zhǎng)或遺傳工程培育的植物來修復(fù)重金屬污染土壤,是目前治理土壤污染的重要方法,具有較高的環(huán)保和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

    構(gòu)樹()是重要的扶貧攻堅(jiān)樹種,具有生長(zhǎng)迅速、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣泛、易于繁殖等優(yōu)良特性,也是尾礦區(qū)和重金屬污染地區(qū)的先鋒樹種和本土樹種,對(duì)多種重金屬元素具有良好的吸收和耐受力。但構(gòu)樹優(yōu)良品系的開發(fā)不夠,構(gòu)樹適應(yīng)重金屬的機(jī)理尚不清楚,這對(duì)發(fā)展構(gòu)樹生物修復(fù)不利。要充分發(fā)揮構(gòu)樹在重金屬土壤修復(fù)中的功能,其前提是掌握構(gòu)樹重金屬適應(yīng)機(jī)制,通過常規(guī)或分子育種培育Cd高抗高耐受型構(gòu)樹新品種。因此,本研究旨在鑒定構(gòu)樹重要的Cd響應(yīng)基因,為開展構(gòu)樹抗Cd分子育種提供候選基因。

    轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors,TFs)是真核生物中重要的調(diào)控蛋白。在植物中,轉(zhuǎn)錄因子是許多信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)控因子,如植物生長(zhǎng)、生物或非生物脅迫等。堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)是轉(zhuǎn)錄因子中重要的蛋白質(zhì)家族之一。植物中的bZIP 一般由60~80 個(gè)氨基酸殘基組成,含有1 個(gè)堿性結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu),氨基酸殘基組成的堿性結(jié)構(gòu)域與特異DNA 序列相結(jié)合,起核定位信號(hào)作用,亮氨酸拉鏈形成兩親性的α 螺旋結(jié)構(gòu),參與bZIP 蛋白與DNA 結(jié)合之前的二聚體化。在前期對(duì)構(gòu)樹響應(yīng)Cd 脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中,我們獲得了受Cd 脅迫上調(diào)表達(dá)的眾多基因,其中包括堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zip?per,bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族中的若干成員。

    現(xiàn)代分子生物研究顯示,bZIP 是植物生長(zhǎng)過程的重要調(diào)節(jié)劑,如組織分化、細(xì)胞伸長(zhǎng)、病原體防御、激素信號(hào)傳導(dǎo)、光反應(yīng)以及滲透控制。針對(duì)bZIP 調(diào)控植物抗逆的研究顯示,bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可參與抗病、抗寒、抗旱、耐鹽和抗重金屬離子等多種逆境脅迫調(diào)控。如,水稻()中過表達(dá)顯著提高了植株對(duì)干旱、鹽和PEG 滲透脅迫的耐受性,鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和參與水稻Zn和CdCl的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn);大豆()參與大豆耐藥性、耐鹽性、干旱耐受性的調(diào)控;苧麻()在響應(yīng)高鹽脅迫時(shí)起正向調(diào)控作用,在植物響應(yīng)干旱和重金屬Cd 脅迫時(shí)起負(fù)向調(diào)控作用。因此,本研究對(duì)響應(yīng)Cd脅迫表達(dá)較為突出的1個(gè)bZIP成員(命名為)進(jìn)行Cd脅迫下的表達(dá)和轉(zhuǎn)基因酵母的抗Cd分析,以期為揭示構(gòu)樹Cd適應(yīng)分子機(jī)制和抗逆分子育種提供候選基因。

    1 材料與方法

    1.1 材料與處理

    植物材料:同批次構(gòu)樹組培苗轉(zhuǎn)移至土壤生長(zhǎng)至2年。

    處理方法:使用分析純的CdCl配置150 μmol·L的CdCl溶液,對(duì)構(gòu)樹進(jìn)行脅迫處理,在處理后0、3、12、24、48、72 h 等時(shí)間點(diǎn)分別取根、莖、葉,將根、莖、葉用液氮速凍后,于冰箱中-80℃保存?zhèn)溆茫總€(gè)處理包含5棵植株。

    1.2 BpbZIP1基因的克隆與分析

    在以構(gòu)樹Cd 脅迫下的轉(zhuǎn)錄組篩選出的上調(diào)表達(dá)基因中,篩選bZIP 家族成員,選擇其中1 條表達(dá)值較高的基因(命名為)進(jìn)行分析?;虻拈_放讀碼框(ORF)用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定。根據(jù)基因ORF 兩端序列設(shè)計(jì)引物-和-(見表1),進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與pMD-18T 載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證,對(duì)可獲得目的片段的克隆測(cè)序。

    表1 本研究涉及引物Table 1 The primers used in the study

    利用Expasy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)確認(rèn)的基因序列特征進(jìn)行分析。利用BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)進(jìn)行序列同源性搜索。利用MEGA7 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用ClustalX 進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對(duì)。使用CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc?ture/cdd/wrpsb. cgi)和MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)進(jìn)行BpbZIP1 的保守結(jié)構(gòu)域分析。利用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)推 測(cè)BpbZIP1 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),利用Swiss Model(https://swissmod?el.expasy.org/)推測(cè)BpbZIP1 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。利用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bio?inf/Cell-PLoc-2/)進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

    1.3 BpbZIP1基因的表達(dá)分析

    對(duì)1.1 中收集樣品進(jìn)行基因表達(dá)量分析。RNA 提取采用CTAB 法進(jìn)行,RNA 經(jīng)DNA 消化酶處理后采用PrimeScriptRT reagent Kit(CWBIO,康為世紀(jì),中國(guó))反轉(zhuǎn)錄為cDNA,稀釋10倍后用作qRT-PCR 的模板。qRT-PCR使用SYBR Green Real time PCR Master mix(CWBIO)進(jìn)行,內(nèi)參基因?yàn)椤K靡锶绫?所示,定量引物為DL-F和DL-R。定量反應(yīng)所用儀器為Applied Biosystems生產(chǎn)的StepOneReal Time PCR System。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性12 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,45個(gè)循環(huán);81 ℃讀板1 s,每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用2法對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行相對(duì)分析,表示為相對(duì)于內(nèi)參基因相對(duì)于對(duì)照的表達(dá)值。數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件包(SPSS,Chicago,Illinois,USA)分析。樣品變異性用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。不同時(shí)間點(diǎn)與0 h之間的表達(dá)差異用檢驗(yàn)分析(<0.05)。

    1.4 酵母表達(dá)載體構(gòu)建及脅迫分析

    根據(jù)基因序列特征及pYES2 酶切位點(diǎn)特性設(shè)計(jì)酵母表達(dá)載體引物BpbZIP1-JM-F 和BpbZIP1-JM-R(見表1)。通過PCR 反應(yīng)獲得含有酶切位點(diǎn)的序列,經(jīng)酶切純化后與pYES2連接獲得重組載體pYES2-BpbZIP1。將pYES2-BpbZIP1 和空pYES2 載體分別轉(zhuǎn)入酵母INVSC1中,分別記為INVSC1(pYES2-BpbZIP1)和INVSC1(pYES2),后者為對(duì)照。本研究所用工具酶均為寶生物(Takara)公司產(chǎn)品。

    分 別 挑 取INVSC1(pYES2-BpbZIP1)和IN?VSC1(pYES2)單克隆置于含2%葡萄糖的SC-Ura液體培養(yǎng)基中,30℃震蕩培養(yǎng)16 h,收集酵母菌體重懸于含2%半乳糖的SC-Ura液體培養(yǎng)基中,且調(diào)整OD=0.5,30℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD=1.8,分別收集菌體進(jìn)行Cd 脅迫處理。即,取相同量的上述INVSC1(pYES2-BpbZIP1)和INVSC1(pYES2)菌體,分別在含有0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% CdCl的SC-Ura 液體培養(yǎng)基(含2%葡萄糖)中震蕩培養(yǎng)30 h,測(cè)定酵母生長(zhǎng)活性(OD)。數(shù)據(jù)使用SPSS軟件包分析。樣品變異性用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。相同處理下INVSC1(pYES2-BpbZIP1)和INVSC1(pYES2)之間的差異顯著性用檢驗(yàn)分析(<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 BpbZIP1基因基本生物信息

    通過對(duì)構(gòu)樹轉(zhuǎn)錄組篩查鑒定獲得基因(GeneBank 登錄號(hào):MW567468),根據(jù)獲得的cDNA 序列設(shè)計(jì)引物BpbZIP1-F/R 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證,確定該基因序列ORF長(zhǎng)1 713 bp,編碼的蛋白包含570 個(gè)氨基酸,分子量為62 902.38 Da,等電點(diǎn)為4.62。保守域分析發(fā)現(xiàn)該蛋白有bZIP 結(jié)構(gòu)域(見圖1)。Swiss Model 同源建模預(yù)測(cè)的BpbZIP1 蛋白三維結(jié)構(gòu)是典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(見圖2:A~B),BpbZIP1 二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件為無規(guī)則卷曲和螺旋,占總氨基酸的48.95% 和39.12%,其余延伸鏈和轉(zhuǎn)角分別占8.25%、3.68%(見圖2C)。經(jīng)同源搜索并進(jìn)行進(jìn)化分析,顯示BpbZIP1蛋白與擬南芥()ZIP同源,且與AtbZIP1 的進(jìn)化關(guān)系較近(見圖3)。將BpbZIP1蛋白與擬南芥同源蛋白進(jìn)行多序列對(duì)比,顯示出高度的相似性(見圖4A),同時(shí)BpbZIP1 蛋白與擬南芥同源蛋白都具有相同的保守結(jié)構(gòu)域(見圖4B)。對(duì)BpbZIP1 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),顯示BpbZIP1蛋白為核蛋白。

    圖1 BpbZIP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 The conserved domain of BpbZIP1 protein

    圖2 BpbZIP1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A.與非冗余PDB(Protein Data Bank)結(jié)構(gòu)集比較;B.三維結(jié)構(gòu)模型;C.二級(jí)結(jié)構(gòu);h.α螺旋;e.延伸鏈;t.β轉(zhuǎn)角;c.無規(guī)則卷曲Fig.2 Predicted structure of BpbZIP1 protein A.Comparison with non-redundant set of PDB(Protein Data Bank)structures;B.3D structure model;C.Secondary structure;h. α helix;e.Extended strand;t.Beta turn;c.Random coil

    圖3 BpbZIP1與擬南芥相似蛋白的進(jìn)化樹括號(hào)內(nèi)為登錄號(hào);Bb.構(gòu)樹;At.擬南芥Fig.3 Phylogenetic tree of BpbZIP1 protein GeneBank accession number in brackets;Bb.B.papyrifera;At.A.thaliana

    2.2 BpbZIP1基因在Cd脅迫下的表達(dá)

    提取CdCl脅迫不同時(shí)間點(diǎn)的根、莖、葉的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 用作qRT-PCR 分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因能被Cd 脅迫誘導(dǎo)表達(dá),且在根、莖、葉中具有一定差異(見圖4)。在根中,基因受脅迫后迅速被誘導(dǎo),在3 h 達(dá)到最高水平,為對(duì)照組的17.4 倍;之后表達(dá)水平逐漸下降,但72 h 仍處于上調(diào)表達(dá)。在莖中,基因隨時(shí)間延長(zhǎng)的表達(dá)變化趨勢(shì)同根中表現(xiàn)相似,均為倒‘V’字形,但整體上根中的表達(dá)要高于莖中的表達(dá),且莖中出現(xiàn)的峰值在12 h,為對(duì)照的5.6 倍。在葉中,基因的轉(zhuǎn)錄水平隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)不斷升高,在72 h為對(duì)照的5.1倍(見圖5)。

    圖4 BpbZIP1與擬南芥同源蛋白多序列對(duì)比(A)及其motif(B)Fig.4 Multiple sequence alignment of BpbZIP1 and A.thaliana homologous proteins(A)and its motif logos(B)

    圖5 BpbZIP1基因在Cd處理下的表達(dá)水平**,*分別表示同一組織在不同時(shí)間點(diǎn)與0 h 之間的差異極顯著(P<0.001)和顯著(P<0.05)Fig.5 The expression level of BpbZIP1 gene under different time of CdCl2 treatment**,* mean that the difference between the same tissue at different time points and 0 h was extremely significan(tP<0.001)and signifi?can(tP<0.05)

    2.3 BpbZIP1基因表達(dá)對(duì)酵母抗Cd性的影響

    分 別 挑 取INVSC1(pYES2-BpbZIP1)和IN?VSC1(pYES2)單克隆在相同條件下培養(yǎng)并進(jìn)行不同CdCl濃度處理,比較二者在Cd 脅迫下的生長(zhǎng)活性。結(jié)果顯示,在非脅迫條件下,INVSC1(pY?ES2-BpbZIP1)和INVSC1(pYES2)的生長(zhǎng)沒有明顯區(qū)別,但在CdCl脅迫處理后,INVSC1(pYES2-Bp?bZIP1)和INVSC1(pYES2)的OD明顯下降,且隨著CdCl濃度增加,INVSC1(pYES2-BpbZIP1)和INVSC1(pYES2)的OD逐漸變小,但I(xiàn)NVSC1(pY?ES2-BpbZIP1)一直高于INVSC1(pYES2),且差異顯著(見圖6)。表明基因的表達(dá)顯著改善了酵母的CdCl脅迫性能。

    圖6 轉(zhuǎn)BpbZIP1基因酵母在鎘脅迫下的OD600**表示相同處理?xiàng)l件下INVSC1(pYES2-BpbZIP1)和INVSC1(pYES2)之間的差異性顯著性(P<0.01)Fig.6 The OD600 of BpbZIP1 transgenic yeasts under different CdCl2 concentrations** indicates the significant difference between INVSC1(pYES2-BpbZIP1)and INVSC1(pYES2)under the same treatment conditions(P<0.01)

    3 討論

    植物修復(fù)(Phytoremediation)是一種利用自然生長(zhǎng)植物或者遺傳工程培育植物修復(fù)金屬污染土壤環(huán)境的技術(shù),是一種經(jīng)濟(jì)、高效的方法。超級(jí)積累植物可以從土壤中吸取金屬污染物以達(dá)到降低或去除土壤重金屬污染的目的。目前發(fā)現(xiàn)的重金屬超積累植物已經(jīng)多達(dá)700 多種,如,我國(guó)東南景天()為Cd 和Zn 超級(jí)積累植物;土荊芥()為Pb 超級(jí)積累植物;商陸()能大量富集Cd;蕁麻()對(duì)Zn有較強(qiáng)富集能力。可見,植物在重金屬治理過程中可以發(fā)揮重要作用,發(fā)展植物修復(fù)方法可行性強(qiáng)。構(gòu)樹以其突出的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和優(yōu)良的生態(tài)適應(yīng)性受到廣泛關(guān)注。商侃侃等分析了54 種木本植物對(duì)土壤Cu、Pb、Zn 的提取能力,結(jié)果表明構(gòu)樹具有較強(qiáng)的金屬離子綜合提取能力。金裕華等研究表明構(gòu)樹在重金屬污染土壤中適應(yīng)性較強(qiáng)、生長(zhǎng)良好。曾鵬等研究顯示蘆竹()與構(gòu)樹、桑樹()間種可有效用于重金屬污染土壤修復(fù)??梢?,充分掌握構(gòu)樹的重金屬響應(yīng)分子機(jī)制,能為更好地應(yīng)用構(gòu)樹于重金屬污染修復(fù)提供依據(jù)。

    本研究鑒定獲得的基因與擬南芥bZIP的較多成員具有較近的親緣關(guān)系(見圖3),其中與的進(jìn)化關(guān)系較近;是一個(gè)糖調(diào)控基因,介導(dǎo)糖信號(hào),影響基因的表達(dá)和植物的生長(zhǎng)發(fā)育。且Sun 等研究證明參與植物生物調(diào)控,發(fā)現(xiàn)其為植物耐鹽、耐滲透和耐鹽性的正向調(diào)節(jié)因子。參與植物中活性氧(ROS)的產(chǎn)生,而ROS 作為信號(hào)分子調(diào)控植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)。是葡萄糖-ABA 相互作用網(wǎng)絡(luò)的重要節(jié)點(diǎn),根據(jù)糖的供應(yīng)情況參與ABA介導(dǎo)的非生物脅迫響應(yīng)調(diào)節(jié)。所以,我們初步認(rèn)為基因可能與植物非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)。

    為進(jìn)一步明確基因是否能響應(yīng)Cd脅迫,對(duì)構(gòu)樹進(jìn)行Cd 處理,分析不同處理時(shí)間點(diǎn)該基因在根、莖、葉中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),基因在構(gòu)樹根、莖、葉中都表現(xiàn)出對(duì)Cd 脅迫的積極響應(yīng),且具有一定的組織特異性(見圖5),這與其他基因在逆境中的表達(dá)具有相似性。如,耿芳等通過實(shí)時(shí)RT-PCR 分析a 基因在煙草中的表達(dá),在干旱、高鹽的誘導(dǎo)下煙草()中基因表達(dá)量明顯上調(diào),后證明基因參與轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱和耐鹽的調(diào)控。同樣,才華等發(fā)現(xiàn)在大豆的根和葉中基因的表達(dá)均受鹽脅迫誘導(dǎo),過表達(dá)基因的擬南芥對(duì)鹽脅迫的敏感性提高。王榮凱使用NaCl 脅迫嘎啦生根組培苗,組培苗根中表達(dá)受到明顯誘導(dǎo),蘋果()轉(zhuǎn)基因研究表明是蘋果抗逆的正調(diào)控因子。由此可見,基因可以響應(yīng)鎘脅迫,具有鎘脅迫耐受調(diào)控潛力。

    為進(jìn)一步快速確定基因?qū)d的響應(yīng)功能,本研究將轉(zhuǎn)入酵母,通過與對(duì)照酵母比較,分析其抗Cd 能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)入基因的酵母INVSC1(pYES2-BpbZIP1)在CdCl脅迫下的生長(zhǎng)活性顯著高于對(duì)照INVSC1(pYES2)(見圖6)。由于酵母表達(dá)系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于快速檢測(cè)基因的抗逆功能,如通過轉(zhuǎn)入和基因提高酵母對(duì)鹽、滲透及熱脅迫的耐受性,證明和能夠積極響應(yīng)非生物脅迫;用同樣的方法驗(yàn)證了和在非生物脅迫反應(yīng)中的積極作用;Yang等通過將檉柳()金屬硫蛋白在酵母中過表達(dá),發(fā)現(xiàn)其能增強(qiáng)酵母的抗Cd、Zn、Cu和NaCl 能力,證明具有增強(qiáng)重金屬耐受性的作用;Jiang 等研究表明基因?qū)虢湍负螅D(zhuǎn)基因酵母在熱、鹽和氧化應(yīng)激條件下顯示出更高的生存力,證明基因的抗逆能力。本研究Cd 脅迫下的酵母生活力被基因的表達(dá)而顯著提高,表明的表達(dá)能有效改善轉(zhuǎn)基因酵母的抗Cd性,可以作為Cd 響應(yīng)的候選基因。在后續(xù)研究中,我們將通過植物表達(dá)系統(tǒng)對(duì)基因調(diào)控Cd脅迫的分子機(jī)制進(jìn)行全面解析。

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