凱里米酸湯揮發(fā)性成分HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS分析

嚴紅光，張建煬，林莉，袁華偉

1(宜賓學(xué)院 質(zhì)量管理與檢驗檢測學(xué)部，四川 宜賓，644001)2(黔東南苗族侗族自治州食品藥品檢驗檢測中心， 貴州 凱里，556011)3(凱里學(xué)院 大健康學(xué)院，貴州 凱里，556011)

凱里酸湯源于貴州黔東南苗族傳統(tǒng)食品，包括糯米米湯為主要發(fā)酵原料的米酸湯(又稱為白酸湯)和西紅柿、辣椒為主要發(fā)酵原料的紅酸湯[1]。凱里酸湯主要的發(fā)酵菌為乳桿菌以及明串珠菌、醋酸桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、畢赤酵母[1-2]。凱里酸湯具有調(diào)控血脂代謝，降低血甘油三脂、血膽固醇及升高高密度脂蛋白的作用[3]。米酸湯發(fā)酵后富含有機酸、氨基酸、礦物質(zhì)元素、維生素等，具有較好的抗氧化能力[1-2]。用于米酸湯發(fā)酵的乳酸菌也具有緩解和預(yù)防腹瀉、高血壓、糖尿病和便秘[2-3]等生理功效。

揮發(fā)性成分是構(gòu)成食品風(fēng)味品質(zhì)的重要物質(zhì)，也是消費者喜好的決定因素之一。食品中的揮發(fā)性成分可以采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[4]、電子鼻法[5]、氣相色譜離子遷移譜法(gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS)[6]、氣相色譜嗅覺測量法[7]等研究。米酸湯風(fēng)味獨特，王思婷等[4]、田亞等[8]采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)分別分析出米酸湯40種和109種揮發(fā)性物質(zhì)成分。LIU等[9]分析了凱里周邊地區(qū)10家企業(yè)和作坊的米酸湯產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)，共鑒定出42種揮發(fā)性物質(zhì)。WANG等[10]研究后發(fā)現(xiàn)不同白酸湯產(chǎn)品受工藝影響，風(fēng)味物質(zhì)差異顯著。由于GC-MS存在檢測時間長、前處理程序影響大、離子峰解譜較困難[11]，GC-IMS具有樣品前處理簡單、較好保留自身風(fēng)味物質(zhì)、小分子物質(zhì)分辨率高等特點[12]，因此有必要采用多種揮發(fā)性物質(zhì)檢測方法協(xié)同分析凱里米酸湯揮發(fā)性物質(zhì)成分。

本文采用HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS協(xié)同分析代表性凱里米酸湯產(chǎn)品揮發(fā)性物質(zhì)成分。研究結(jié)果有利于加深對米酸湯揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分認識，拓展GC-IMS技術(shù)應(yīng)用范圍，為最終改進凱里米酸湯風(fēng)味品質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

凱里地區(qū)3家著名企業(yè)各自剛結(jié)束乳酸發(fā)酵階段的1個米酸湯批次。這3家企業(yè)分別是貴州省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)傳承人創(chuàng)辦企業(yè)、市場規(guī)模暫居最大的企業(yè)和具有三十余年創(chuàng)辦歷史的企業(yè)。隨機選擇每家企業(yè)9個發(fā)酵壇，在每個壇子中部50 cm處各自取樣50 mL。每3個壇子取的樣混勻為1個待測樣品。每家企業(yè)制備出3個待測樣品，-20 ℃貯存。3家企業(yè)樣品依次編為MC、NH、YM。

標(biāo)準品：乙酸乙酯(99.9%)、丙酸乙酯(99.5%)、丙酸丙酯(99.5%)、乙醇(99.8%)、正丙醇(99.9%)、異戊醇(99.8%)、仲辛醇(99.5%)、乙酸(99.8%)、丙酸(99.5%)、己酸(99.5%)、辛酸(99.5%)、壬酸(99%)，上海阿拉丁生化科技股份公司；C7-C40正構(gòu)烷烴標(biāo)樣，美國o2si公司。

1.2 主要儀器

配置全自動頂空進樣裝置的FlavourSpec?風(fēng)味分析儀，德國G.A.S.公司；PR124ZH電子天平，美國OHAUS公司；Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；配置磁力加熱攪拌裝置的固相微萃取操作平臺、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭及聯(lián)用手柄57356U，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HS-SPME-GC-MS測定揮發(fā)性成分

準確量取8 mL米酸湯樣品置于15 mL頂空瓶中，加入磁性轉(zhuǎn)子、1.5 g NaCl、8 μL 4.095 g/L的仲辛醇內(nèi)標(biāo)溶液，立即用聚四氟乙烯墊封口。樣品在固相微萃取操作平臺上40 ℃平衡15 min，再用老化后的萃取頭頂空萃取25 min，隨后手動進樣，250 ℃解析8 min。

GC-MS條件：HP-INNOWax氣相色譜柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm, 美國J&W公司)。前進樣口溫度250 ℃，載氣(He) 流速1.0 mL/min，不分流進樣。程序升溫：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至150 ℃，以10 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃，EI電離源，離子源溫度230 ℃、電壓70 eV；掃描范圍m/z35-500。

1.3.2 HS-GC-IMS測定揮發(fā)性成分

準確量取1 mL米酸湯樣品置于20 mL頂空瓶，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min，45 ℃下孵育15 min后進樣。

GC-IMS分析條件：色譜柱WAX 30 m ID 0.53 mm，柱溫60 ℃，載氣/漂移氣均為≥99.999%氮氣，IMS溫度45 ℃，分析時間30 min。自動進樣體積100 μL，進樣針溫度50 ℃。

氣相色譜條件：0～2 min：漂移氣150 mL/min，載氣2 mL/min；2～20 min：漂移氣150 mL/min，載氣2 mL/min提升至100 mL/min；20～30 min：漂移氣150 mL/min，載氣100 mL/min。

1.4 米酸湯揮發(fā)性成分定性定量分析

HS-SPME-GC-MS定性分析方法:在標(biāo)準信息庫NIST 17.0中檢索比對物質(zhì)峰質(zhì)譜信息，在匹配度≥70%條件下，結(jié)合RI值、標(biāo)準品比對進行定性。

HS-SPME-GC-MS定量分析方法:采用內(nèi)標(biāo)半定量方法。根據(jù)各揮發(fā)性成分及仲辛醇峰面積的比值，按公式(1)計算出揮發(fā)性成分質(zhì)量濃度：

(1)

式中:Ci，揮發(fā)性成分質(zhì)量濃度，mg/L;Ai，揮發(fā)性成分峰面積;Ais，內(nèi)標(biāo)物峰面積;Vi，樣品體積，L;mis，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量，mg。

氣味活度值(odor activity value, OAV) 計算方法:查閱出揮發(fā)性成分閾值，利用揮發(fā)性成分濃度與閾值的比值，按公式(2)計算：

(2)

式中:Ci，揮發(fā)性成分質(zhì)量濃度，mg/L;Ti，該揮發(fā)性成分閾值，mg/L。

HS-GC-IMS定性分析方法:通過GC-IMS數(shù)據(jù)分析軟件LAV查看分析圖譜，利用Reporter插件比較二維和三維圖譜差異，利用Library Search軟件和儀器內(nèi)置NIST、IMS數(shù)據(jù)庫進行揮發(fā)性物質(zhì)成分定性分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用GC-IMS的Gallery Plot插件進行不同米酸湯樣品間揮發(fā)性成分含量差異比較，Dynamic PCA插件進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凱里米酸湯HS-SPME-GC-MS分析結(jié)果

凱里米酸湯樣品揮發(fā)性成分HS-SPME-GC-MS定性和半定量分析結(jié)果見表1。3種米酸湯樣品一共鑒定出28種揮發(fā)性物質(zhì)，包括10種醇類、10種酯類、3種酸類、1種酮類、1種呋喃類、2種醚類、1種酚類。3種米酸湯樣品揮發(fā)性成分組成均以醇類、酯類和酸類化合物為主，這與前人對米酸湯揮發(fā)性成分研究結(jié)論較吻合[9]。3個代表性廠家米酸湯樣品揮發(fā)性物質(zhì)組成不一致。其中MC樣品鑒定出23種揮發(fā)性物質(zhì)、NH樣品檢測出21種、YM樣品分析出18種。3個生產(chǎn)廠家產(chǎn)品中，只有乙酸乙酯、丁酸乙酯這2種揮發(fā)性物質(zhì)成分的濃度差異不顯著，且8種揮發(fā)性物質(zhì)成分只出現(xiàn)在其中一家產(chǎn)品中，為正丙醇、正己醇、2-壬醇、苯乙醇、乙酸丁酯、丁酸丁酯、2-甲基呋喃、乙二醇乙醚。3家企業(yè)生產(chǎn)用發(fā)酵容器材質(zhì)和規(guī)格、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、老水來源及配比、釀造用水和糯米等原輔料組成比例都有一定差異，可能是造成產(chǎn)品揮發(fā)性物質(zhì)組成不同的原因[8,13]。

表1 不同米酸湯樣品揮發(fā)性物質(zhì)成分含量Table 1 Content of volatile component in different rice sour soup samples

表2的OAV可用于分析揮發(fā)性成分對風(fēng)味貢獻程度。OAV<1表示該成分質(zhì)量分數(shù)低于閾值，具有修飾米酸湯風(fēng)味作用；OAV≥1時，該成分對米酸湯整體風(fēng)味特征具有較大貢獻。由表2可見，YM樣品中OAV≥1的特征香氣成分有乙醇(2.43)、仲丁醇(1.82)、異戊醇(328.37)、正己醇(1.38)、2-壬醇(16.67)、乙酸乙酯(3136.85)、丙酸乙酯(28.35)、乙酸丙酯(30.59)、丁酸乙酯(444.93)、丙酸丙酯(218.57)、丁酸丙酯(19.92)、乙酸(3.26)、丙酸(15.98)、仲辛酮(7.29) 和2,4-二叔丁基苯酚(109.79)。NH樣品中OAV最大的是乙酸乙酯(2 958.89)，其次是丁酸乙酯(351.06)、異戊醇(99.31)、2，4-二叔丁基苯酚(69.93)、丁酸丙酯(49.56)、二烯丙基硫醚(33.48)、正丁醇(25.51) 和仲丁醇(19.46)，這些物質(zhì)對香氣輪廓形成起決定性作用。MC樣品中OAV最大的是乙酸乙酯(2 694.08)，其次是丁酸乙酯(411.64)、異戊醇(164.74)、丁酸丙酯(98.87)、2，4-二叔丁基苯酚(86.86)、正丁醇(44.31)、丁酸(29.24)和異辛醇(27.87)。

表2 不同米酸湯樣品揮發(fā)性物質(zhì)成分閾值及OAVTable 2 Threshold and OAV of volatile component in different rice sour soup samples

由于醇類和酯類物質(zhì)揮發(fā)性較強，閾值較低，OAV較大，因此其對3種米酸湯樣品風(fēng)味都具有很大貢獻，同時也是凱里米酸湯中重要的風(fēng)味化合物。米酸湯中酯類物質(zhì)可以給整體風(fēng)味特征帶來花果香，有助于改善香味復(fù)雜性[14]。其中乳酸乙酯具有水果和黃油的味道[14]；乙酸乙酯具有果香和洗甲水風(fēng)味特征[15-16]，且在濃度低于150 mg/L時具有增強香氣吸引力的作用[16]；丁酸乙酯具有香蕉和青蘋果氣味[16]。正丁醇具有酚類香氣特征[16]；異戊醇具有動物皮毛和洗甲水風(fēng)味特征[16-17]；正己醇具有青草香[16]；正丙醇會帶來辛辣香味[16]。樣品中還分析出少量酸類、醚類、酮類和酚類化合物，它們對凱里米酸湯風(fēng)味形成具有一定的修飾作用。如乙酸具有醋味[16]，丁酸能增強酸敗的氣味[18]。

從表2還可以看出，米酸湯YM樣品中，丁酸、乙酸丁酯、丁酸丙酯和丁酸丁酯含量比MC樣品低，而丙酸、丙酸乙酯和丙酸丙酯含量比MC樣品高。這些物質(zhì)對香氣輪廓形成起重要作用，且可能提示不同米酸湯樣品中發(fā)酵微生物代謝產(chǎn)酸類型不相同。前人研究發(fā)現(xiàn)，米酸湯發(fā)酵過程中存在乳酸菌、醋酸菌、畢赤酵母菌等觸發(fā)的多種發(fā)酵形式，影響了酸湯有機酸代謝和風(fēng)味特征[1-2]。

2.2 凱里米酸湯HS-GC-IMS分析結(jié)果

2.2.1 不同米酸湯樣品揮發(fā)性成分差異

利用HS-GC-IMS分析3個具有代表性米酸湯企業(yè)產(chǎn)品揮發(fā)性成分，根據(jù)揮發(fā)性成分的物質(zhì)峰保留時間、遷移時間及物質(zhì)峰強度可以生成三維圖譜。三維圖譜經(jīng)投影后獲得的二維俯視圖如圖1所示。選取米酸湯MC樣品氣味指紋圖譜作為參比，其他兩種樣品圖譜扣除參比。圖1中白色部位表示揮發(fā)性成分濃度與參比樣品相同，紅色代表該成分濃度高于參比樣品，藍色代表該成分濃度低于參比樣品。每個樣品的圖譜代表其頂空中所有揮發(fā)性成分。由圖1及方框指示位置可知，從左至右依次顯示的MC、NH和YM米酸湯樣品揮發(fā)性成分差異明顯。

圖1 不同米酸湯樣品揮發(fā)性物質(zhì)成分二維氣相 離子遷移圖譜Fig.1 Two-dimensional GC-IMS image of different rice sour soup samples 注:縱坐標(biāo)為保留時間，橫坐標(biāo)為遷移時間，紅色豎線為反應(yīng)離子峰

2.2.2 不同米酸湯樣品揮發(fā)性成分HS-GC-IMS定性分析

利用外標(biāo)正酮C4～C9計算揮發(fā)性物質(zhì)保留指數(shù)，與GC-IMS內(nèi)置NIST、IMS數(shù)據(jù)庫信息進行定性比對，結(jié)果見表3。3種米酸湯樣品中共定性識別出33種揮發(fā)性物質(zhì)成分，包括6種醇類、14種酯類、5種醛類、4種酮類、3種酸類、1種呋喃類。由于內(nèi)置數(shù)據(jù)庫正在完善中，因此圖1中部分揮發(fā)性物質(zhì)成分未能識別。

表3 米酸湯樣品GC-IMS圖譜揮發(fā)性物質(zhì)成分定性結(jié)果Table 3 Qualitative result of volatile component in the GC-IMS image of rice sour soup samples

2.2.3 不同米酸湯樣品揮發(fā)性成分指紋圖譜分析

利用GC-IMS的Gallery Plot插件比對不同米酸湯樣品揮發(fā)性成分物質(zhì)含量差異，利用所有樣品二維圖譜待分析峰構(gòu)建指紋圖譜(圖2)。從圖中可以直觀識別每種樣品完整揮發(fā)性成分信息以及樣品間揮發(fā)性成分物質(zhì)含量差異。

從指紋圖譜中可知，不同米酸湯樣品有共同的揮發(fā)性物質(zhì)成分和各自的特征物質(zhì)峰。凱里米酸湯樣品共同含有的揮發(fā)性物質(zhì)成分主要包括乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸乙酯、乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁酮等7種。米酸湯MC樣品的主要特征物質(zhì)包括乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸丙酯、己酸甲酯、異丙醇、正戊醇、3-戊酮等10種;米酸湯NH樣品的主要特征物質(zhì)包括異辛醇、2-乙基呋喃、丁酸乙酯、乙酸異丙酯、甲酸乙酯、乳酸乙酯、E-2-己烯醛、2,3-戊二酮、丙酮等9種，米酸湯YM樣品的主要特征物質(zhì)包括異丁酸、丙酸、正丁醛、乙酸丁酯等4種。從指紋圖譜中還發(fā)現(xiàn)3種未能定性的揮發(fā)性物質(zhì)成分，這是由于GC-IMS內(nèi)置NIST數(shù)據(jù)庫信息限制導(dǎo)致。凱里米酸湯主要釀造原料為本地產(chǎn)禾糯米，含有淀粉、氨基酸、B族維生素、脂肪酸等，發(fā)酵前需要將原料進行高溫蒸煮[20]。前人研究認為：脂肪酸酶解之后可以產(chǎn)生揮發(fā)酸，帶來水果、脂肪、奶酪和酸敗的味道，而醋酸酯可以由乙酰輔酶A和醇通過一系列反應(yīng)代謝產(chǎn)生[18]。醇類物質(zhì)代謝產(chǎn)生途徑包括氨基酸的降解、不飽和脂肪的降解或醛類物質(zhì)還原反應(yīng)[16]，而酯類揮發(fā)性物質(zhì)一般通過酸和醇的脫水-縮合反應(yīng)形成[21]。樣品中檢測到的2-乙基呋喃屬雜環(huán)化合物，可以通過糖裂解、硫胺素降解及美拉德反應(yīng)產(chǎn)生[12]。

圖2 不同米酸湯樣品揮發(fā)性物質(zhì)成分指紋圖譜Fig.2 Volatile component fingerprint of different rice sour soup samples 注：Y軸為樣品編號；X軸為米酸湯樣品全部揮發(fā)性成分物質(zhì)信號峰；已定性物質(zhì)用名稱表示；未定性物質(zhì)用編號表示； 物質(zhì)峰顏色越深代表相對含量越大

2.2.4 不同米酸湯樣品揮發(fā)性成分主成分分析

為直觀比較3種代表性凱里米酸湯產(chǎn)品揮發(fā)性成分差異，使用Dynamic PCA插件程序制作主成分分析圖，結(jié)果見圖3。PC1和PC2的貢獻解釋了總變異的98%，且3種米酸湯樣品能很好分離，證明了樣品特征性風(fēng)味物質(zhì)具有一定差異。選取所有樣品的揮發(fā)性成分物質(zhì)峰進行主成分分析，其中分布在主成分分析圖右下角黑色圓點為MC樣品，樣本間聚集度較高；左下角藍色圓點為NH樣品，樣本間聚集度一般；上方中間位置紅色圓點為YM樣品，樣本間聚集度較均勻。GC-IMS技術(shù)可對不同凱里米酸湯產(chǎn)品進行有效區(qū)分。

圖3 不同米酸湯樣品主成分分析結(jié)果Fig.3 Principal component analysis of different rice sour soup samples

2.3 米酸湯樣品揮發(fā)性成分HS-SPME-GC-MS和GC-IMS分析差異

表1和表3分別列出HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS鑒定出的3種代表性米酸湯產(chǎn)品主要揮發(fā)性物質(zhì)成分28種和33種。通過比對發(fā)現(xiàn)，2種分析技術(shù)共同檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)成分為13種，多為醇、酯、酸類等化合物。3種米酸湯樣品在2種檢測方法中都檢出乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、乳酸乙酯、乙醇和丙酸8種風(fēng)味物質(zhì)；MC和NH米酸湯樣品在2種檢測方法中都檢出正丁醇、異丙醇、異辛醇3種風(fēng)味物質(zhì)；MC米酸湯樣品在2種檢測方法中都檢出乙酸丁酯、正丙醇2種風(fēng)味物質(zhì)。通過對比還可以發(fā)現(xiàn)，米酸湯樣品中只被HS-GC-IMS鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)為己酸甲酯、乙酸異戊酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異丁酯、2-甲基丁酸甲酯、乙酸異丙酯、甲酸乙酯、正戊醇、2-甲基丁醛、丙醛、2-己烯醛、正丁醛、糠醛、異丁酮、2,3-戊二酮、丙酮、3-戊酮、2-乙基呋喃、異丁酸和2-甲基丁酸。只被HS-SPME-GC-MS鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)為丙酸丙酯、領(lǐng)苯二甲酸二丁酯、仲丁醇、異戊醇、正己醇、2-壬醇、苯乙醇、仲辛酮、2-甲基呋喃、二烯丙基硫醚、乙二醇乙醚、乙酸、丁酸、2,4-二叔丁基苯酚。2種分析方法中，GC-IMS鑒定出相對更豐富的酯類、醛類、酮類化合物。這可能是由于其前處理條件以及GC-IMS的2次分離效果，導(dǎo)致GC-IMS結(jié)果中特異性揮發(fā)物質(zhì)總數(shù)增加[12]。采用2種技術(shù)手段協(xié)同分析，可以獲得3種凱里米酸湯中更加全面的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分信息。

3 結(jié)論

為研究凱里米酸湯3個代表性產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)特征，采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用和頂空氣相色譜-離子遷移譜兩種技術(shù)方法對其進行分離鑒定。采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析出28種揮發(fā)性物質(zhì)。與米酸湯MC樣品比較，YM樣品中，丁酸、乙酸丁酯、丁酸丙酯和丁酸丁酯含量較低，而丙酸、丙酸乙酯和丙酸丙酯含量較高。不同廠家米酸湯產(chǎn)品有機酸及其衍生揮發(fā)性物質(zhì)組成差異顯著。下一步可以研究凱里米酸湯發(fā)酵微生態(tài)環(huán)境條件參數(shù)對優(yōu)勢菌株及其代謝產(chǎn)生主要揮發(fā)性物質(zhì)動力學(xué)規(guī)律影響，以提升產(chǎn)品品質(zhì)特征。采用HS-GC-IMS技術(shù)分析出33種揮發(fā)性成分，其中13種揮發(fā)性成分與GC-IMS鑒定結(jié)果一致。由于GC-IMS對揮發(fā)性物質(zhì)的高分離特性，同時應(yīng)用HS-GC-IMS和HS-SPME-GC-MS技術(shù)可以獲得米酸湯揮發(fā)性成分更完整的信息。GC-IMS指紋圖譜表明：樣品揮發(fā)性成分特征明顯；主成分分析表明3種凱里米酸湯樣品間風(fēng)味差異大，并能分別聚成一類。GC-IMS技術(shù)可以有效識別不同來源米酸湯產(chǎn)品，但該分析結(jié)果中部分揮發(fā)性物質(zhì)成分尚未能夠被定性。因此，下一步有必要將HS-GC-IMS應(yīng)用于SPME技術(shù)并繼續(xù)完善NIST和IMS數(shù)據(jù)庫信息，以提高其利用價值與應(yīng)用范圍。