全二維與一維氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)解析蘇派黃酒揮發(fā)性組分

劉少璞，周志磊，姬中偉，曹杰，毛健,3,4*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 3(國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興，312000)4(江南大學(xué)(紹興)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，浙江 紹興，312000) 5(江蘇張家港釀酒有限公司，江蘇 蘇州，215637)

中國黃酒與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒，是一種以稻米等為原料、以曲為發(fā)酵劑釀造而成的低度發(fā)酵酒，采用“用曲制酒、雙邊發(fā)酵”的釀造工藝[1]，組分復(fù)雜且風(fēng)味獨(dú)特。黃酒產(chǎn)區(qū)分布廣泛，由于原料曲種、生產(chǎn)工藝和釀造環(huán)境等因素的影響，各產(chǎn)區(qū)的黃酒均有其獨(dú)特的風(fēng)味特征。蘇派黃酒產(chǎn)自江蘇南部地區(qū)，是黃酒的主要產(chǎn)區(qū)之一，產(chǎn)品風(fēng)格以清爽型為主，具有“酒色橙黃，清澈透明，醇香清雅，柔和清爽”的風(fēng)格特點(diǎn)，與其他產(chǎn)區(qū)黃酒差異明顯。目前針對(duì)不同產(chǎn)區(qū)黃酒的風(fēng)味研究已逐步展開[2]，利用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)解析黃酒中的揮發(fā)性組分種類及含量，有助于明晰不同產(chǎn)區(qū)黃酒的香氣組成及風(fēng)味特征。

傳統(tǒng)的一維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)是黃酒香氣分析最常用的工具，近年來研究人員常采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)結(jié)合GC-MS技術(shù)對(duì)黃酒揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析，然而受到一維GC-MS峰容量和分辨率的限制，檢測(cè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)化合物共流出現(xiàn)象，這導(dǎo)致其鑒定的黃酒揮發(fā)性化合物往往低于100種[3-5]。全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS)相對(duì)于一維GC-MS具有高分辨率、高靈敏度和高峰容量等優(yōu)勢(shì)[6-7]，第一維色譜柱的所有組分都在第二維色譜柱上進(jìn)行了正交分離，能夠解決一維GC-MS檢測(cè)時(shí)化合物共流出導(dǎo)致的峰掩蓋問題。近年來采用GC×GC-TOFMS技術(shù)對(duì)酒類進(jìn)行風(fēng)味解析逐漸成為研究熱點(diǎn)，而目前其在黃酒領(lǐng)域應(yīng)用較少，陳雙[8]首次采用GC×GC-TOFMS技術(shù)對(duì)黃酒揮發(fā)性組分進(jìn)行解析，共檢測(cè)出975個(gè)色譜峰；ZHOU等[9]對(duì)黃酒GC×GC-TOFMS檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并在浙派黃酒中鑒定出267種揮發(fā)性化合物。

GC×GC-TOFMS在揮發(fā)性組分的定性分析時(shí)展現(xiàn)了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，然而一維GC-MS在進(jìn)行已知化合物的外標(biāo)法定量分析時(shí)仍是簡(jiǎn)便而有效的工具[2,10-12]。為探明揮發(fā)性組分中的關(guān)鍵呈香物質(zhì)，GC-MS定量分析結(jié)合香氣活度值(odor activity value，OAV)法是風(fēng)味化學(xué)領(lǐng)域中鑒定關(guān)鍵香氣物質(zhì)的常用手段，OAV的含義為待測(cè)香氣化合物與其香氣閾值的比值，其值大小可一定程度上反映該化合物對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)程度，常以O(shè)AV>1作為關(guān)鍵香氣物質(zhì)的判定標(biāo)準(zhǔn)[13-15]。

因此，本研究采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS技術(shù)對(duì)蘇派黃酒的揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析，并結(jié)合HS-SPME-GC-MS定量分析及OAV法鑒定蘇派黃酒中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。本研究通過解析蘇派黃酒的揮發(fā)性組分特征，為中國黃酒風(fēng)味化學(xué)理論體系提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為風(fēng)味導(dǎo)向的蘇派黃酒品質(zhì)控制提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本研究所用蘇派黃酒樣品由中國江蘇地區(qū)某公司提供，包括4款半干型和2款半甜型商品酒，樣品具體信息如表1所示。

表1 蘇派黃酒樣品信息Table 1 Information of Jiangsu Huangjiu samples

1.1.2 主要試劑

C7～C30正構(gòu)烷烴、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、2-羥基-4-甲基-戊酸乙酯、丁二酸二乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯丙酸乙酯、異戊醛、苯甲醛、己醛、癸醛、苯乙醛、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇、正己醇、苯甲醇、1-辛烯-3-醇、β-苯乙醇、2-辛醇、丁酸、異戊酸、己酸、辛酸、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚、糠醛、5-甲基呋喃醛、丙位壬內(nèi)酯、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、二甲基三硫(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；氯化鈉、乳酸、乙醇(分析純)，中國國藥上海化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pegasus GC-HRT 4D+全二維氣相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國LECO公司；PAL RTC自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)及孵化爐和加熱攪拌模塊，瑞士CTC analytics AG公司；Thermo Trace1300-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、TR-FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm ID，0.25 μm)、TG-WAXMS色譜柱(30 m×0.25 mm ID，0.25 μm)，美國Thermo Fisher公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS三項(xiàng)萃取頭，美國Supelco公司；Rxi-17 sil MS色譜柱(1 m×0.25 mm ID，0.25 μm)，美國Restek公司；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器，德國Gerstel公司；Mili-Q型超純水儀，美國Millipore公司；DF-101S型恒溫?cái)嚢杷″?，鄭州科泰?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ME204TE型分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS技術(shù)解析黃酒揮發(fā)性組分

1.3.1.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS前處理方法

參照文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行。取3 mL黃酒樣品與3 mL超純水于15 mL頂空瓶中，加入3 g NaCl后迅速蓋上瓶蓋。樣品平衡15 min，吸附30 min，萃取溫度50 ℃，不分流進(jìn)樣，解析時(shí)間5 min。由PAL RTC系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)樣，每個(gè)樣品相同條件下進(jìn)樣3次。

1.3.1.2 GC×GC-TOFMS儀器條件

GC×GC條件：一維色譜柱TR-FFAP，二維色譜柱Rxi-17 sil MS。進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣。起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速率升溫至230 ℃保持7 min。調(diào)制器調(diào)制時(shí)間4 s，熱脈沖時(shí)間1.2 s。二維柱溫箱的溫度全程比一維柱溫箱高5 ℃。以高純氦氣作為載氣，恒流模式。流量：1 mL/min。

TOFMS條件：采用EI離子源，溫度280 ℃，電離能量70 eV，傳輸線溫度240 ℃，檢測(cè)器電壓1 400 eV，采集質(zhì)量數(shù)范圍(m/z)為33～400 amu，采集頻率100 spectrum/s。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS技術(shù)定量分析黃酒香氣化合物

1.3.2.1 HS-SPME-GC-MS前處理方法

取2 mL黃酒樣品與4 mL超純水于15 mL頂空瓶中，加入2 g NaCl充分搖勻，加入10 μL 2-辛醇溶液(101.8 mg/L)，放入轉(zhuǎn)子并蓋上瓶蓋。將老化好的SPME萃取頭通過瓶蓋隔墊插入樣品萃取瓶的頂空，推出纖維頭，使其暴露于萃取瓶的頂空中，放入50 ℃恒溫水浴中萃取50 min，磁力攪拌速度200 r/min，每次萃取要使纖維頭與提取液液面保持相同的高度。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的各香氣化合物標(biāo)準(zhǔn)品，并用黃酒模擬液(pH 4.0，酒精度15%vol)稀釋得到一系列不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，與樣品相同進(jìn)樣，根據(jù)目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 HS-SPME-GC-MS儀器條件

GC條件：毛細(xì)管色譜柱TG-WAXMS。載氣為高純氦氣(>99.999%)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃。升溫程序：初始溫度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至230 ℃，并保持10 min。

MS條件：EI離子源，溫度280 ℃，電離能量70 eV，傳輸線溫度240 ℃。質(zhì)量掃描范圍33～350 amu。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 GC×GC-TOFMS數(shù)據(jù)分析

由LECO公司Pegasus 4D工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，在ChormaTOF軟件平臺(tái)上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，自動(dòng)識(shí)別相似度>700的色譜峰后進(jìn)行自動(dòng)積分解卷積和譜庫比對(duì)。使用Microsoft Excel篩選信噪比(S/N)≥50與不含鹵素及硅元素的化合物后通過保留指數(shù)(由相同條件下C7～C30計(jì)算得出)定性。

1.4.2 GC-MS數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)由Thermo TraceFinder GC軟件進(jìn)行采集及定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS解析蘇派黃酒揮發(fā)性組分

黃酒作為一種發(fā)酵酒，使用傳統(tǒng)一維氣相色譜質(zhì)譜分析其揮發(fā)性組分時(shí)容易出現(xiàn)化合物共流出現(xiàn)象，分辨率低、靈敏度低和峰容量低等缺點(diǎn)影響了黃酒揮發(fā)性化合物的鑒定效果，無法滿足科研工作者對(duì)黃酒風(fēng)味解析的需求。而全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在一維氣相色譜分離的基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用不同性質(zhì)色譜柱進(jìn)行第二次分離，大大減少了一維色譜峰掩映的問題，同時(shí)結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)可以有效提高分析的分辨率和靈敏度，適用于諸多復(fù)雜酒精飲料體系的揮發(fā)性組分鑒定[17-19]。

a-一維；b-二維圖1 蘇派黃酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析 總離子流色譜圖Fig.1 Analytical total ion chromatogram contour obtained from the HS-SPME-GC×GC-TOFMS analysis of Jiangsu Huangjiu

使用HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析蘇派黃酒揮發(fā)性組分，以其中一款蘇派黃酒全二維色譜圖為例，圖1-a與圖1-b分別為蘇派黃酒一維與二維總離子流圖，在圖1-b中每一個(gè)黑點(diǎn)代表儀器識(shí)別出的一個(gè)色譜峰，在該樣品中共識(shí)別出了818個(gè)色譜峰，表明蘇派黃酒揮發(fā)性組分復(fù)雜，由圖1-b可以看出存在許多一維保留時(shí)間相同、二維保留時(shí)間不同的化合物，說明蘇派黃酒在一維總離子流圖中存在化合物共流出現(xiàn)象(圖1-a)。各蘇派黃酒樣品在一維氣相色譜中均出現(xiàn)化合物共流出現(xiàn)象，而通過二維短色譜柱進(jìn)一步分離，在一維長(zhǎng)色譜柱上共流出的物質(zhì)分離效果良好，說明GC×GC-TOFMS適用于黃酒體系揮發(fā)性組分的鑒定。

GC×GC-TOFMS在蘇派黃酒中共鑒定出了432種揮發(fā)性化合物(表2)，其中酯類、醇類、醛類和芳香族化合物占總數(shù)的50%以上，分別鑒定出87、47、47和45種。酯類物質(zhì)數(shù)目最多，占揮發(fā)性化合物總數(shù)量的20.1%，這與浙派黃酒研究報(bào)道一致，而與即墨黃酒不同，說明不同產(chǎn)區(qū)黃酒的揮發(fā)性組分有一定差異。

醇類物質(zhì)是酒精飲料中重要的揮發(fā)性化合物，對(duì)黃酒風(fēng)味輪廓和舒適度等具有重要影響。碳原子數(shù)大于2的醇類在飲料酒行業(yè)通常被稱為高級(jí)醇，有研究認(rèn)為其含量高容易造成頭疼和深醉，生產(chǎn)過程中應(yīng)注意其含量控制。黃酒高級(jí)醇主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇等[9]。蘇派黃酒中醇類物質(zhì)占總揮發(fā)性化合物數(shù)量的10.9%，β-苯乙醇呈玫瑰花香[8]，1-辛烯-3-醇具有蘑菇香氣[8]，正己醇具有植物生青的香氣特征[16]等，它們對(duì)黃酒的香氣具有一定貢獻(xiàn)，同時(shí)也是黃酒中酯類化合物的重要前體。

表2 蘇派黃酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS鑒定出的揮發(fā)性化合物Table 2 Qualitative volatile compounds of Jiangsu Huangjiu by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

醛、酮類物質(zhì)通常感官閾值較低，可能對(duì)黃酒的香氣具有一定的貢獻(xiàn)。蘇派黃酒中共鑒定出80個(gè)醛、酮類物質(zhì)，占總量的18.5%。鑒定出的醛類化合物以脂肪醛類為主，苯甲醛具有杏仁香[14]，苯乙醛具有花香，己醛和壬醛具有青草香，肉桂醛具有肉桂香，2-苯基-2-丁烯醛具有甜香等。酮類化合物有苯乙酮、苯丙酮、2-庚酮和2-壬酮等，其中2-壬酮與苯乙酮具有花香，諸多羰基類化合物共同豐富了黃酒的香氣。

揮發(fā)性有機(jī)酸造就了黃酒香氣的酸味特征，酸類物質(zhì)占總量的6.0%。黃酒中含有乙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和癸酸等脂肪酸類，乙酸具有醋酸味，丁酸、己酸、庚酸、辛酸和壬酸呈現(xiàn)出奶酪的氣味，它們賦予了蘇派黃酒獨(dú)特的酸香特征，對(duì)黃酒的整體香氣有重要影響[14]。

酯類化合物是各種飲料酒[17-19]中含量最為豐富的一類揮發(fā)性化合物之一，常常具有水果的香氣，蘇派黃酒中共鑒定出87種酯類化合物，是其最豐富的一類物質(zhì)。酯類物質(zhì)主要由脂肪酸酯化生成，乙酯類化合物在酯類化合物中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，如乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、2-羥基-4-甲基-戊酸乙酯、丁二酸二乙酯、己酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯和2-羥基-3-苯基丙酸乙酯等，此外還有乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯和鄰苯二甲酸二異丁酯等其他非乙酯類化合物。乙酸乙酯具有類似溶劑的氣味，乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯等諸多酯類化合物具有水果的甜香氣息，而苯甲酸乙酯與苯乙酸乙酯等芳香族乙酯類化合物則呈花香氣味，乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯和丙酸乙酯是對(duì)黃酒香氣影響較大的酯類物質(zhì)[14]。

呋喃、吡喃類化合物是黃酒中一類不可忽視的香氣物質(zhì)，蘇派黃酒中共鑒定出19種呋喃、吡喃類物質(zhì)，占總量4.4%，包括糠醛、5-甲基糠醛、2-戊基呋喃、乙基糠基醚、5-羥甲基糠醛、2-糠酸乙酯和2,5-二甲酰基呋喃等，糠醛具有苦杏仁與焦糖香，5-甲基糠醛呈現(xiàn)出植物青香，2-糠酸乙酯具有花香氣味，乙基糠基醚可能具有特殊的杏仁與烤甜香[16]。一些呋喃類化合物如糠醛和5-甲基糠醛是糖降解和美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物[20]，對(duì)于研究黃酒加工過程中還原糖反應(yīng)具有一定價(jià)值。

萜烯及其衍生物廣泛存在于天然產(chǎn)物之中，蘇派黃酒中鑒定出的萜烯及其衍生物有α-松油醇、柏木腦和橙花基丙酮等，它們大多來自天然植物精油中，具有獨(dú)特的香氣，如α-松油醇具有花香，其對(duì)蘇派黃酒的香氣可能有一定貢獻(xiàn)。

黃酒中含有許多揮發(fā)性與不揮發(fā)性酚類化合物，蘇派黃酒中共鑒定出10種酚類化合物，主要有苯酚、4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚等。4-乙基苯酚具有藥香味，4-乙基愈創(chuàng)木酚具有香料的氣味，它們可能是對(duì)黃酒煙熏香有重要貢獻(xiàn)的物質(zhì)。

含硫化合物的氣味通常被描述為臭雞蛋與爛白菜等令人不愉快的氣味，但在低濃度時(shí)可能對(duì)令人滿意的葡萄酒香氣有重要貢獻(xiàn)[21]。黃酒中最具代表性的含硫化合物是二甲基三硫，它具有爛白菜的氣息，此外在蘇派黃酒中都檢測(cè)到了具有燒烤與堅(jiān)果氣味的2,5-二甲基-3-乙酰基噻吩，它們對(duì)蘇派黃酒的風(fēng)味多樣性可能有一定的貢獻(xiàn)。有報(bào)道稱黃酒中含有3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇[8,22]，其在蘇派黃酒中也被檢出。

蘇派黃酒中共鑒定出14種內(nèi)酯類化合物，主要有γ-丁內(nèi)酯、δ-戊內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯和5-戊基-2(5H)-呋喃酮等，許多內(nèi)酯類化合物具有水果香氣，γ-丁內(nèi)酯與γ-己內(nèi)酯具有甜香氣息[8]。

2.2 HS-SPME-GC-MS結(jié)合香氣活度值解析蘇派黃酒關(guān)鍵香氣物質(zhì)

黃酒中揮發(fā)性化合物種類繁多、組成復(fù)雜，由于化合物本身呈香性質(zhì)及其香氣閾值的限制，并非所有揮發(fā)性化合物均對(duì)黃酒的香氣具有貢獻(xiàn)，因此有必要采用一維GC-MS定量分析結(jié)合香氣活度值法(OAV)鑒定蘇派黃酒中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。

在GC×GC-TOFMS定性結(jié)果中進(jìn)一步篩選出37種黃酒中重要香氣化合物進(jìn)行HS-SPME-GC-MS定量分析[1,13-14]。結(jié)果顯示，37種香氣化合物中共有19種化合物含量高于其香氣閾值，其中半干型和半甜型黃酒中分別有17種和18種(表3)，它們可能對(duì)蘇派黃酒整體香氣具有重要貢獻(xiàn)，為蘇派黃酒中關(guān)鍵香氣物質(zhì)。

表3 兩種甜型蘇派黃酒關(guān)鍵香氣物質(zhì)含量及OAV比較Table 3 Comparison of concentrations of key aroma compounds and OAV of two sweet-type Jiansu Huangjiu

3 結(jié)論

本研究首次采用HS-SPME前處理結(jié)合GC×GC-TOFMS技術(shù)對(duì)中國江蘇地區(qū)黃酒的揮發(fā)性組分進(jìn)行了解析，研究發(fā)現(xiàn)相比于傳統(tǒng)一維氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，GC×GC-TOFMS擁有更高的分辨率與靈敏度，通過二維短色譜柱進(jìn)一步分離，在一維長(zhǎng)色譜柱上共流出的物質(zhì)分離效果良好，說明GC×GC-TOFMS適用于黃酒體系揮發(fā)性組分的鑒定。通過質(zhì)譜庫檢索與保留指數(shù)比對(duì)，在蘇派黃酒中共鑒定出432種揮發(fā)性化合物，其中半干型和半甜型黃酒分別有203和119種，酯類化合物數(shù)目最多。使用HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)蘇派黃酒中37種揮發(fā)性化合物進(jìn)行定量及香氣活度值分析，發(fā)現(xiàn)19種化合物含量高于其香氣閾值，其中半干型和半甜型黃酒分別有17和18種，可能為蘇派黃酒中關(guān)鍵香氣物質(zhì)。本研究豐富了中國黃酒風(fēng)味化學(xué)理論體系，為風(fēng)味導(dǎo)向的蘇派黃酒品質(zhì)控制提供數(shù)據(jù)支持，對(duì)今后不同地區(qū)黃酒揮發(fā)性組分解析具有一定的指導(dǎo)意義，但本研究?jī)H從定性及定量角度解析蘇派黃酒的揮發(fā)性組分，各香氣化合物對(duì)蘇派黃酒的感官貢獻(xiàn)及香氣相互作用仍值得進(jìn)一步探究。