間充質(zhì)干細胞來源外泌體對視網(wǎng)膜光感受器細胞PI3K/AKT通路及Ang-1蛋白水平作用的研究

洪 博，崔 蓓，王鳳翔，田春雨，曹利群，秦利維，王麗君

常見的致盲性疾病有老年黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜色素變性。其中，老年黃斑變性和視網(wǎng)膜色素變性都屬于視網(wǎng)膜退行性病變，與視網(wǎng)膜中的神經(jīng)細胞-光感受器細胞的損傷有關(guān)。我國在臍帶組織中分離出了探討間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)轉(zhuǎn)化為人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UCMSCs)，h UCMSCs具有分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便等特征，常用于治療糖尿病[1]、軟骨損傷疾病[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，給糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠注射h UCMSCs可改善視網(wǎng)膜的功能及結(jié)構(gòu)，同時還可降低血糖水平。存活細胞可分泌外泌體改變受體細胞的生理功能。相關(guān)研究證實[5]，h UCMSCs提取出的外泌體可自由穿梭進入卵巢癌細胞，并下調(diào)VEGF水平從而抑制新生血管生成達到抗腫瘤效果。另有研究證實[6]h UCMSCs外泌體對光損傷視網(wǎng)膜色素上皮細胞具有一定的治療作用。此外，在光損傷視網(wǎng)膜光感受器細胞的過程中，離不開信號通路及相關(guān)因子的參與。PI3K/AKT（磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B）通過調(diào)控下游因子水平，參與細胞生物學行為。研究表明，PI3K/AKT信號通路在增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病[7]、青光眼[8]等多種眼科疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；在高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞[9]、年齡相關(guān)性黃斑變性大鼠[10]光感受器細胞中為低表達。血管因子增加、出現(xiàn)微血管瘤等是造成糖尿病視網(wǎng)膜病變產(chǎn)生的較為基礎(chǔ)的病理變化，Ang-1與血管的再生長關(guān)系密切。Ang-1與Tie2結(jié)合可以阻滯細胞的凋亡，促進血管的穩(wěn)定生長，保護血管防止其滲漏。但h UCMSCs外泌體在光損傷視網(wǎng)膜光感受器細胞中對PI3K/AKT通路及Ang-1蛋白的影響目前尚未完全了解。因此，本研究對MSC下外泌體對視網(wǎng)膜光感受器細胞PI3K/AKT通路及Ang-1蛋白水平的研究進行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 h UCMSCs購自武漢普諾賽生命科技公司，凍存?zhèn)溆?。視網(wǎng)膜光感受器細胞株661W，購自上海奧陸谷生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 流式細胞儀（上海三歪醫(yī)療設備公司，型號：FACSVia）；透射電子顯微鏡（鄭州一品儀器公司，型號：JPX-1500）；CD63、CD90、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Ang-1一抗（中國碧云天生物科技公司）；辣根過氧化物酶二抗（北京索萊寶科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 h UCMSCs的復蘇 取出細胞凍存管，放入37℃水浴鍋內(nèi)水浴3 min。75%酒精擦拭消毒凍存管后，吸出細胞懸液注入離心管中，補加少量含有10%PBS的DMEM培養(yǎng)液，離心半徑10 cm，800 r/min離心5 min，棄上清后常規(guī)培養(yǎng)，次日換液后常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 h UCMSCs的傳代 觀察h UCMSCs貼壁生長至85%融合時，棄上清液，5 mL PBS液輕輕洗滌兩次。培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰蛋白酶消化液2 mL，輕搖培養(yǎng)瓶使其均勻覆蓋瓶底，與細胞充分接觸，在恒溫培養(yǎng)箱中消化1 min，倒置顯微鏡下觀察，當細胞間隙增大，形態(tài)變圓時加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化。吹打細胞使懸液均勻，取細胞懸液放入離心管中，離心半徑10 cm，800 r/min離心5 min后棄上清，加入2 mL 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，按1:2比例傳代，培養(yǎng)瓶中補充培養(yǎng)液至15 mL放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3 h UCMSCs外泌體的提取與電鏡觀察 取5~7代生長良好的h UCMSCs，按照細胞傳代方法，棄上清，常規(guī)PBS沖洗及胰蛋白酶消化后用含10%Exo-FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，收集上清液，2 000×g離心30 min，去細胞碎片，經(jīng)濾膜過濾到離心管中，4℃1 000×g離心70 min，得到外泌體濃縮液。將濃縮液移至離心管中，上述條件離心，收集底部沉淀，PBS稀釋，再次離心，洗滌，將外泌體濃縮液過濾除菌，于-80℃冷藏備用。按1:10的比例稀釋，取少量稀釋后外泌體液，于3%磷鎢酸溶液中染色5 min，透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片。

1.2.4 視網(wǎng)膜光感受器細胞光損傷模型 將處于對數(shù)生長期的661W細胞消化后，接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，在另一細胞培養(yǎng)箱中放人紫外線燈(radiant exposure=4.3 J/cm2)，將96孔板放在紫外線燈上10 cm處，照射10 min后關(guān)閉紫外燈，將96孔板移入沒有紫外線燈的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 h UCMSCs外泌體干預及分組 將細胞分為5組，正常組、光損傷組、低濃度組、中濃度組、高濃度組。正常組與光損傷組細胞常規(guī)培養(yǎng)，低、中、高濃度組在處理前24 h將光損傷視網(wǎng)膜光感受器細胞植入6孔板，當細胞生長融合至70%時，分別將25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL h UCMSCs外泌體添加到6孔板中與細胞共孵育48 h，加入PBS，收集細胞。

1.3 檢測指標

1.3.1 線粒體膜電位檢測 利用JC-1（5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide）檢測線粒體膜電位（DΨm）。向待檢測細胞內(nèi)加入JC-1工作液后37℃避光20 min，JC-1稀釋緩沖液沖洗3次，激光共聚焦顯微鏡檢測。正常情況下，線粒體電位處于去極化狀態(tài)，JC-1在590 nm波長的發(fā)射光下呈現(xiàn)紅色點狀熒光，在凋亡細胞中，JC-1仍保持其單體狀態(tài)，530 nm波長的發(fā)射光為綠色彌散熒光。

1.3.2 免疫印跡檢測h UCMSCs外泌體表面標志蛋白CD63及CD90將外泌體樣品與5倍上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）混合后，煮沸變性5 min，冰浴5 min。取30μg蛋白樣品上樣進行十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）變性，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳至目的蛋白有效分離。轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉。將膜置于含對應小鼠抗人CD63及CD90單克隆抗體的Blotto溶液中，搖床上4℃輕輕搖動過夜。洗膜緩沖液洗滌后，將膜浸入含相應辣根過氧化物酶（horse reddish peroxidase，HRP）標記二抗的Blotto溶液中，室溫輕輕搖動2 h。ECL試劑盒檢測，顯影。

1.3.3 流式細胞儀檢測光損傷661W細胞凋亡 收集細胞（2×105/孔）接種于6孔板中，胰酶消化，完全培養(yǎng)基終止；PBS清洗，進行細胞計數(shù)，離心，離心半徑8 cm，1 250 r/min離心6 min，棄上清，混入500 μL Binding Buffer（結(jié)合緩沖液）重懸。加入5μL Annexin V-FITC混勻、10μL PI混勻，室溫避光孵育5~15 min，隨即進行流式細胞儀檢測。

1.3.4 免疫熒光檢測Ang-1取各組光損傷661W細胞，用預溫的1×PBS洗3次。4%的甲醛室溫固定20 min，0.2%Triton X-100透化5 min，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉30 min，加入抗Ang-1一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4℃過夜。加入二抗（用1%BSA稀釋），閉光孵育120 min。95%甘油封片，鏡下觀察。

1.3.5 免疫印跡檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達 將光損傷661W細胞進行裂解并提取核蛋白,并對核蛋白的濃度進行測量,分裝后,保存在-20℃、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT一抗按1：500稀釋后孵育過夜，TTBS漂洗3次，每次10 min，最后加入辣根過氧化物酶二抗按1：2 000對溶液稀釋,常溫封閉。取出PVDF膜,每隔10 min漂洗1次，共3次，DAB顯色后照相，后計算其蛋白表達含量。實驗另設立抑制劑組（PI3K/AKT抑制劑LY294002）與激動劑組（PI3K/AKT激動劑740Y-P），實驗細胞處于對數(shù)生長期時用PBS緩沖液將INS-1細胞洗3遍，將細胞以數(shù)量為5×104接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后用濃度為25 nM的740 Y-P以及40μmol/L的LY294002刺激INS-1細胞48 h，規(guī)范處理細胞進行下一步試驗。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用GraphPad Prism 8.0軟件，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，均符合正太分布，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 h UCMSCs形態(tài)學 光鏡下見正常的h UCMSCs呈單層貼壁生長，細胞形態(tài)呈梭形、圓形或多邊形。細胞可成簇生長，胞內(nèi)可見清晰核仁，部分細胞表現(xiàn)為雙核或多核。傳至5~7代后，細胞生長良好，活躍，可進行相關(guān)實驗，圖1。

圖1 h UCMSCs形態(tài)學A：h UCMSCs原代；B：h UCMSCs5~7代

2.2 h UCMSCs外泌體形態(tài)學 透射電鏡下可見h UCMSCs外泌體表現(xiàn)為一群類圓形的具有明顯膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，直徑在60~100 nm之間，囊泡內(nèi)部可見低電子密度物質(zhì)，圖2。

圖2 h UCMSCs外泌體形態(tài)學

2.3 h UCMSCs外泌體的表面特異性蛋白CD63及CD90結(jié)果顯示，h UCMSCs外泌體表達外泌體共性標志蛋白CD63及h UCMSCs特異性表面蛋白CD90，證實其來源可靠，圖3。

圖3 免疫印跡檢測h UCMSCs外泌體蛋白CD63、CD90表達

2.4 光損傷661W細胞模型形態(tài)學 照射10 min的紫外燈后，顯微鏡下可見細胞呈現(xiàn)出較為嚴重的皺縮，提示光損傷視網(wǎng)膜光感受器細胞模型建立成功，圖4。

圖4 光損傷視網(wǎng)膜光感受器細胞模型形態(tài)學

2.5 線粒體膜電位檢測 利用JC-1染色各組細胞并在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組線粒體膜電位情況，紅色顆粒狀熒光為主是正常細胞在DΨm較高時表現(xiàn)出來的，圖5A，而綠色熒光提示光損傷狀態(tài)下細胞凋亡增多、線粒體膜電位較低，JC-1單體形成進而表現(xiàn)為彌散的綠色熒光，圖5B，提示光損傷細胞模型建立成功。

圖5 光感受器細胞線粒體膜電位

2.6 流式細胞儀測凋亡 正常組（0.11±0.02）較光損傷組（9.73±0.82）細胞凋亡率低（t=28.730，P＜0.001）。光損傷組較低濃度組（5.24±0.42）細胞凋亡率低（t=11.940，P＜0.001）。低濃度組較中濃度組（3.17±0.29）細胞凋亡率低（t=9.934，P＜0.001）。中濃度組較高濃度組（0.25±0.03）細胞凋亡率低（t=24.530，P＜0.001），圖6。

圖6 各組細胞凋亡率比較

2.7 免疫熒光檢測Ang-1熒光顯微鏡下，DAPI將細胞核染成藍色，以辣根酶標記的二抗將Ang-1蛋白染成紅色。光損傷組表達明顯強于正常組，低濃度組Ang-1表達稍有減弱，但不明顯，中濃度組表達有明顯的下降，而高濃度組的Ang-1表達下降更明顯，僅僅稍強于正常組，圖7。

圖7 不同濃度h UCMSCs外泌體作用后Ang-1的表達

2.8 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達 正常組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平高于光損傷組（P＜0.05），光損傷組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平低于低濃度組（P＜0.05），低濃度組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平低于中濃度組（P＜0.05），中濃度組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平低于高濃度組（P＜0.05），高濃度組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平與激動劑組比較無差異（P＞0.05），抑制劑組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平低于模型組（P＜0.05），表1，圖8。

圖8 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平比較

表1 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平比較（±s）

表1 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平比較（±s）

與正常組比較aP＜0.05；與光損傷組比較bP＜0.05；與低濃度組比較cP＜0.05；與中濃度組比較dP＜0.05；與高濃度組相比eP＜0.0；與抑制劑組相比fP＜0.05

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3 討論

高強度的光照會引起視網(wǎng)膜光感受器細胞的凋亡，加快視網(wǎng)膜退行性疾病的進展，導致不可逆的視力損害。本研究證實提取出的h UCMSCs外泌體可用于后續(xù)實驗，過程與何廣輝[11]等的鑒定一致。為了進一步研究h UCMSCs外泌體對光感受器細胞的作用，本研究采用體外培養(yǎng)的紫外線誘導661W細胞損傷模型[12]，結(jié)果顯示，在紫外線照射培養(yǎng)的661W細胞10 min后，給予h UCMSCs外泌體干預，與光損傷組相比,隨著濃度的增加，可顯著減少光損傷視網(wǎng)膜光感受器細胞凋亡，從而對光損傷視網(wǎng)膜起保護作用，提示h UCMSCs蛋白對紫外線照射誘導661W細胞損傷模型有神經(jīng)保護作用。馬明明[13]等提示，h UCMSCs外泌體可抑制視網(wǎng)膜脫落的大鼠炎癥反應及光感受器細胞凋亡。本研究與上述研究結(jié)果相似。

PI3K激活誘導Akt磷酸化調(diào)節(jié)對視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)損害的神經(jīng)保護作用已有報道[14]。PI3K被激活后通過生成磷脂產(chǎn)物激活AKT進而干擾線粒體細胞色素C釋放，抑制細胞凋亡。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[15]β-雌二醇可激活PI3K/AKT信號通路而抑制Bax參與的線粒體凋亡途徑而保護視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞。另有研究提示[16]，上調(diào)老年性黃斑變性視網(wǎng)膜色素上皮細胞PI3K/AKT通路，可降低細胞氧化應激損傷，發(fā)揮細胞保護作用。本研究結(jié)果顯示，在經(jīng)h UCMSCs外泌體干預后，p-PI3K、p-AKT蛋白水平升高，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。因此，推測h UCMSCs外泌體可能通過激活PI3K/AKT通路，抑制了視網(wǎng)膜光感受器細胞的凋亡。王輝[17]等研究提示，二十二碳六烯酸通過激活PI3K/AKT通路抑制年齡相關(guān)性大鼠光感受器細胞凋亡。劉輝[18]等研究提示，在h UCMSCs外泌體通過調(diào)控PI3K-AKT通路抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡。本研究與上述研究結(jié)果相似。

在眼底新生血管發(fā)生后，視網(wǎng)膜色素上皮層屏障被破壞，從而使血管滲漏，損傷光感受器細胞。Ang家族及其受體Tie2系統(tǒng)在血管的發(fā)育成熟與穩(wěn)定、調(diào)控血管完整性方面具有重要意義。Ang-1不僅刺激內(nèi)皮細胞增殖和遷移，從而促進新生血管生成，它還能起到破壞視網(wǎng)膜色素上皮層屏障的作用。Ang-1通過與Tie2受體結(jié)合后激活PI3K／AKT信號通路發(fā)揮對血管的發(fā)育成熟與穩(wěn)定、抑制滲漏等重要作用。雷潤佳[19]等研究發(fā)現(xiàn)，降低Ang-1水平后，通過與Tie2受體結(jié)合后激活PI3K/AKT信號通路發(fā)揮抑制血管滲漏等作用。楊梓超[20]等研究提示，通過下調(diào)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠Ang-1表達，改善視網(wǎng)膜光感受器細胞層結(jié)構(gòu)，減少細胞水腫等從而改善視網(wǎng)膜組織病變。本研究中免疫熒光結(jié)果顯示，與正常組比較，光損傷組Ang-1的表達增加，給予h UCMSCs外泌體干預后，隨著濃度的增加，Ang-1的表達逐漸降低，這提示h UCMSCs外泌體具有抑制血管滲漏的作用。

綜上所述，間充質(zhì)干細胞下外泌體可能是通過激活PI3K/AKT通路，抑制了視網(wǎng)膜光感受器細胞的凋亡以及Ang-1的水平，從而對光損傷視網(wǎng)膜起保護作用。