重組人鼠嵌合抗CD20單克隆抗體N糖譜的定性及定量分析

劉冰，王夢(mèng)瑩，肖志良，董衍東，鄒寒艷，楊惠潔，張伶俐

1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶401121；2.AB SCIEX亞太應(yīng)用支持中心，廣東廣州 510623

臨床上，單克隆抗體用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等多種疾病，是近年生物制藥行業(yè)最熱門的研究領(lǐng)域之一［1-2］。重組人鼠嵌合抗CD20單克隆抗體是一種特異性靶向淋巴細(xì)胞表面CD20抗原的抗體，可與CD20抗原發(fā)生結(jié)合，激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，可致表面表達(dá)CD20抗原的B-淋巴細(xì)胞的溶解和被殺傷，從而達(dá)到抗腫瘤效果［3］。單克隆抗體具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，且存在不同類型的翻譯后修飾，其中糖基化是最常見和復(fù)雜的修飾之一，主要形式為N糖基化修飾［4］，其差異可能會(huì)影響其藥學(xué)性質(zhì)，如有效性、體內(nèi)半衰期及免疫原性等［5-8］。因此，N糖基化修飾是單克隆抗體生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制的重要指征，對(duì)其進(jìn)行分析和監(jiān)控非常必要［9］。

單克隆抗體N糖基化修飾通常采用N糖譜來(lái)進(jìn)行定性和定量分析，2-AB標(biāo)記法為常用的檢測(cè)法，即N糖鏈通過(guò)糖苷酶F酶切釋放，用2-AB對(duì)游離N糖進(jìn)行標(biāo)記衍生，再經(jīng)液相色譜進(jìn)行分離檢測(cè)。該方法可作為N糖譜分析的定量方法，也可串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行糖型鑒定，但該方法操作繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)。RapiFluor-MSN糖分析試劑盒采用不同的糖苷酶和衍生試劑，實(shí)現(xiàn)了對(duì)N糖鏈的快速釋放和標(biāo)記，從而大幅提高了樣品的處理效率。本實(shí)驗(yàn)采用RapiFluor-MSN糖分析試劑盒對(duì)重組人鼠嵌合抗CD20單克隆抗體進(jìn)行前處理，分別通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用儀和液相-熒光檢測(cè)對(duì)N糖譜進(jìn)行定性和定量分析，同時(shí)與2-AB標(biāo)記法進(jìn)行比較［10］。

1 材料與方法

1.1樣品 重組人鼠嵌合抗CD20單克隆抗體（10 mg/mL）由重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院生物制品室提供。

1.2主要試劑及儀器 Glycoworks RapiFluor-MSN糖分析試劑盒（包含RapidPNGase F糖苷酶、Rapi-Gest SF緩沖液、RapiFluor-MS標(biāo)記試劑、二甲基甲酰胺溶劑、GlycoWorks HILIC Elution 96孔板、色譜柱Waters ACQUITY UPLCGlycan BEH Amide（1.7μm，2.1 mm×150 mm，130 A）和Waters UPLCH-class購(gòu)自美國(guó)Waters公司；2-氨基苯甲酰胺和甲酸銨購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；N糖苷酶F（PNGase F）及N糖純化小柱（GlycoCleanTMSCartridges）購(gòu)自美國(guó)Prozyme公司；超濾管購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司；乙腈購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司；ABSciex Triple TOF 5600型超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀購(gòu)自美國(guó)ABSCIEX公司；Agilent1260高效液相色譜儀-熒光檢測(cè)器購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。

1.3Rapi Fluor-MS標(biāo)記處理 取15μg重組人鼠嵌合抗CD20單克隆抗體樣品，加入6μL 5%Rapi-Gest SF緩沖溶液，再加入純水至終體積28.8μL，混勻，95℃溫育3 min，冷卻至室溫；加入1.2μL Ra-pidPNGase F糖苷酶，混勻，55℃溫育5 min，冷卻至室溫；加入12μLRapiFluor-MS標(biāo)記試劑，混勻，室溫放置5 min；加入358μL乙腈，混勻，用Glyco-Works HILICElution 96孔板對(duì)標(biāo)記的N糖進(jìn)行純化，用30μL洗脫液（含200 mmol/L醋酸銨的5%乙腈溶液）洗脫N糖3次；向洗脫液中加入100μL DMF和210μL乙腈，混勻，用于質(zhì)譜鑒定及液相-熒光鑒定。

1.42-AB標(biāo)記處理 取25μL經(jīng)超濾管脫鹽后的重組人鼠嵌合抗CD20單克隆抗體（10 mg/mL），加入5μL PNGase F和70μL 10 mmol/L的PBS，混勻，37℃水浴20 h；加入-20℃預(yù)冷的乙醇300μL，混勻，-20℃放置1h；15300×g離心10 min，取360μL上清液，干燥，加入20μL 2-AB標(biāo)記試劑，混勻，65℃孵育4 h；加至預(yù)處理過(guò)的純化小柱中，吸附約20 min；依次加入1 mL乙腈、5×1 mL 96%乙腈/水溶液、3×0.5 mL純水進(jìn)行純化洗脫，收集洗脫液，完全干燥；用100μL 70%乙腈水溶液復(fù)溶，完全溶解，15 300×g離心1 min，取上清液，用于液相-熒光鑒定。

1.5質(zhì)譜鑒定 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC Glycan BEHAmide（1.7μm，2.1 mm×150 mm，130 A）。柱溫：60℃，進(jìn)樣量：5μL，流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：50 mmol/L甲酸銨（pH 4.5），38.5 min內(nèi)B相：22%→44.1%，流速：0.5mL/min，激發(fā)波長(zhǎng)：260 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：430 nm。采用ESI離子源，正離子模式，離子源溫度：450℃，噴霧電壓：5 000 V，去簇電壓：30 V，母離子掃描范圍：500~2 000 m/z，子離子掃描范圍：100~2 500 m/z。

1.6液相-熒光定量檢測(cè) 色譜柱為Waters ACQUITY UPLCGlycan BEH Amide（1.7μm，2.1 mm×150 mm，130 A），色譜條件同1.5項(xiàng)，按面積歸一化法計(jì)算各糖型相對(duì)含量［11］。

2 結(jié)果

2.1質(zhì)譜鑒定結(jié)果 共檢測(cè)到10種N糖類型，主要糖型為G0F-GN、G0、G0F、Man5、G1F和G2F，其中G1F存在兩種異構(gòu)形式：G1F（1，6）和G1F（1，3），各糖型檢測(cè)的m/z值誤差均在理論值的±5 ppm以內(nèi)，見圖1、表1和圖2。表明液質(zhì)聯(lián)用可對(duì)RapiFluor-MS試劑盒處理后的N糖鏈進(jìn)行有效的鑒定區(qū)分，有助于液相-熒光檢測(cè)對(duì)N糖的定量分析。

圖2 質(zhì)譜測(cè)定各糖型的結(jié)構(gòu)示意圖

表1 質(zhì)譜糖型的鑒定結(jié)果

圖1 質(zhì)譜測(cè)定各糖型的相對(duì)分子質(zhì)量

2.2液相-熒光定量檢測(cè)結(jié)果 液相-熒光鑒定到的主要糖型與質(zhì)譜鑒定相同，N糖鏈以巖藻糖修飾的糖型為主（G0F、G1F、G2F），其中G0F含量最高，約占總糖型的50%，同時(shí)含有少量去巖藻糖修飾糖型（G0）和高甘露糖糖型（Man5）。2-AB標(biāo)記法檢測(cè)到的主要糖型的種類與RapiFluor-MS標(biāo)記法一致，主要糖型占總糖型的比例均達(dá)90%以上，且同一糖型之間的相對(duì)含量差異較小。見圖3和表2。

表2 兩種定量方法檢測(cè)主要糖型的含量（%，±s，n=3）

表2 兩種定量方法檢測(cè)主要糖型的含量（%，±s，n=3）

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圖3 兩種定量方法檢測(cè)的N糖圖譜

3 討論

重組人鼠嵌合抗CD20單克隆抗體的作用機(jī)制主要包括抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）和促細(xì)胞凋亡［3］。研究表明，N糖鏈巖藻糖修飾對(duì)ADCC有較大影響［12］，N糖鏈末端半乳糖含量與CDC活性呈正相關(guān)［13］，且高甘露糖含量會(huì)影響體內(nèi)半衰期［14］，某些特殊糖型（如α-1，3-半乳糖等）會(huì)增加免疫原性［15］。因此，為確保產(chǎn)品的有效性和安全性，對(duì)單克隆抗體N糖基化修飾進(jìn)行質(zhì)量控制，有效地監(jiān)控糖型的改變和糖型比例的變化十分必要。

本實(shí)驗(yàn)采用RapiFluor-MSN糖型標(biāo)記法結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用儀及液相-熒光檢測(cè)對(duì)重組人鼠嵌合抗CD20單克隆抗體N糖進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果表明，液質(zhì)聯(lián)用可對(duì)RapiFluor-MS試劑盒處理后的N糖鏈進(jìn)行有效的鑒定區(qū)分，液相-熒光定量檢測(cè)到的主要糖型與質(zhì)譜鑒定相同，N糖鏈以巖藻糖修飾的糖型為主（G0F、G1F、G2F），其中G0F含量最高，約占總糖型的50%，同時(shí)含有少量去巖藻糖修飾糖型（G0）和高甘露糖糖型（Man5）。2-AB標(biāo)記法檢測(cè)到的主要糖型的種類與RapiFluor-MS標(biāo)記法一致，主要糖型占總糖型的比例均達(dá)90%以上，且同一糖型之間的相對(duì)含量差異較小。與2-AB標(biāo)記法比較，RapiFluor-MS標(biāo)記法操作更為簡(jiǎn)便、快速，該方法使用的糖苷酶可使糖蛋白快速釋放糖鏈，且不影響靈敏度和重現(xiàn)性，RapiFluor-MS標(biāo)記試劑含有高反應(yīng)活性的NHS-氨基甲酸酯標(biāo)記基團(tuán)，可對(duì)糖鏈進(jìn)行快速標(biāo)記，大幅縮短了樣品制備時(shí)間，整個(gè)樣品處理過(guò)程可控制在30 min內(nèi)。2-AB標(biāo)記衍生法操作復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)，僅去糖基化和標(biāo)記過(guò)程就長(zhǎng)達(dá)24 h，還需對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽、濃縮等處理。另外，RapiFluor-MS標(biāo)記法所用樣品量較少，僅需15μg蛋白質(zhì)，適用于來(lái)源有限及珍貴樣品；2-AB標(biāo)記法完成一次N糖譜分析則需要250μg蛋白質(zhì)。在單克隆抗體制品的檢驗(yàn)中，生產(chǎn)企業(yè)及監(jiān)管單位應(yīng)基于明確的產(chǎn)品表征信息，選擇合適的分析方法，對(duì)單克隆抗體N糖鏈進(jìn)行合理的質(zhì)量控制。