木薯2C型蛋白磷酸酶基因MePP2C55的克隆及表達(dá)分析

曾堅(jiān) 謝雅倩 陳麗萍 顏彥 胡偉

摘要：2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C，PP2C） 基因是ABA信號(hào)途徑中主要組成部分，為分析其在木薯非生物脅迫和塊根采后生理性變質(zhì) （post-harvest physiological deterioration，PPD）中的作用，采用RT-PCR技術(shù)從木薯葉片（SC124）中克隆得到MePP2C55基因。對(duì)MePP2C55基因的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、遺傳進(jìn)化關(guān)系、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及基因的啟動(dòng)子元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，并對(duì)MePP2C55基因在不同處理和PPD過(guò)程中的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：（1）MePP2C55基因全長(zhǎng)1 100 bp，編碼369個(gè)氨基酸殘基，蛋白相對(duì)分子量40.7 ku，理論等電點(diǎn)為7.57，含有PP2C的家族結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)序列分析顯示，MePP2C55與橡膠樹和麻風(fēng)樹的PP2C最相似，分別為88.80%和80.60%。MePP2C55和其他PP2C一樣，在C-端保守。這些結(jié)果均表明，MePP2C55基因?qū)儆赑P2C家族。（2）MePP2C55基因在不同木薯組織中的表達(dá)均較高，在側(cè)芽和葉柄中最高。（3）MePP2C55基因?qū)儆贏BA核心通路，所以啟動(dòng)子序列分析顯示含有10個(gè)ABRE （abscisic acid responsiveness） 元件。MePP2C55基因能被PEG和ABA處理顯著誘導(dǎo)，且在PPD過(guò)程中也能被顯著誘導(dǎo)。從上述結(jié)果可推測(cè)，MePP2C55基因具有提高植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的潛力，同時(shí)也參與了PPD過(guò)程，為下一步研究該基因在木薯采后和抗逆中的功能提供了線索。

關(guān)鍵詞：ABA;MePP2C;非生物脅迫;采后生理性變質(zhì);表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： S533? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）08-0073-06

脫落酸 （abscisic acid，ABA） 是一種非常重要的植物激素，它能夠調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，也是植物應(yīng)對(duì)不同逆境的重要信號(hào)因子[1]。ABA信號(hào)可以提高植物在高滲、干旱和高鹽等逆境中的生存能力。2C類蛋白磷酸酶 （protein phosphatase 2C，PP2C） 是ABA信號(hào)通路中重要的組成成分之一。在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，PYR/PYL/RCAR為ABA受體，通過(guò)接收上游的信號(hào)進(jìn)行信息傳遞;SnRK2屬于信號(hào)通路正調(diào)控因子;PP2C屬于信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子。從而ABA受體、SnRK2和PP2C共同組成了ABA介導(dǎo)的信號(hào)通路[2-4]。PP2C屬于蛋白磷酸酶中的PPM類，是一類活性依賴于Mg2+或Mn2+等離子且進(jìn)化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶[5]。

PP2C是高等植物體內(nèi)廣泛存在的蛋白磷酸酶，在植物中也是一個(gè)數(shù)量龐大的蛋白家族。它沒(méi)有調(diào)節(jié)亞基，是一種單體酶。PP2C蛋白的C-端是保守的催化區(qū)域，N-端保守性很弱，能夠結(jié)合不同的序列，所以PP2C 的功能比較多樣化。在植物中，目前總共發(fā)現(xiàn)了6 種PP2C磷酸酶，如ABI1、ABI2、ABI3、HAB2、AHG1 和PP2CA/AHG3[6]。到目前為止，水稻中找到90個(gè)PP2C基因[7]，擬南芥中找到80個(gè)，二穗短柄草中找到86個(gè)[8]。PP2C 在植物中參與了不同信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中[9]，ABA受體蛋白、SnRK2與PP2C三者結(jié)合共同調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、干旱/低溫脅迫和植物創(chuàng)傷/種子休眠/萌發(fā)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6]。在小麥中過(guò)表達(dá)Wcs120（PP2C基因）提高了植株的耐冷性[10]。在擬南芥中，A亞族的PP2C蛋白對(duì)ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)均具有負(fù)調(diào)控功能[11-13]。玉米中ZmPP2C基因是干旱和鹽脅迫反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子[14]。在水稻中，A亞族的PP2C蛋白成員能夠不同程度地響應(yīng)ABA、低溫、高鹽等逆境脅迫[15]。

木薯（Manihot esculenta Crantz） 是熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛種植的作物，約有8億人將木薯作為主糧[16]。木薯主要在我國(guó)華南地區(qū)種植，種植面積約50萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量不低于 100億kg/年，總產(chǎn)值不低于140億元/年，是華南地區(qū)一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[17]。木薯的淀粉含量高，具有很好的抗旱和耐貧瘠特性，可作為重要的綠色能源作物[17-19]。但木薯采收后的塊根容易出現(xiàn)“采后生理性變質(zhì)（post-harvest physiological deterioration，PPD）”，因而存儲(chǔ)期短，大大限制了木薯塊根的大規(guī)模利用[20-22]。目前，關(guān)于木薯中PP2C基因家族的研究還很少[23]。因此，對(duì)木薯PP2C相關(guān)基因進(jìn)行克隆和相關(guān)的表達(dá)分析，有利于分析PP2C基因在木薯抗逆過(guò)程和PPD過(guò)程中的表達(dá)調(diào)控，為研究其功能有重要意義。本試驗(yàn)通過(guò)克隆MePP2C55基因，對(duì)其編碼蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)MePP2C55在干旱脅迫、ABA處理和PPD過(guò)程中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，為研究MePP2C55基因功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯材料為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所保存的木薯品種SC124 （Manihot esculenta cv. SC124）。樣品取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所溫室大棚，2020年4—10月在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所完成試驗(yàn)。RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑分別購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司和Fermentas公司。生工生物工程（上海）股份有限公司合成PCR引物。

1.2 材料處理

木薯種莖切成合適長(zhǎng)度 （15 cm左右） 的莖稈小節(jié)，每個(gè)小節(jié)有3～4個(gè)芽點(diǎn)，分別種入盆中生長(zhǎng)，盆中的土壤為蛭石 ∶營(yíng)養(yǎng)土=1 ∶1（體積比）。取生長(zhǎng)約60 d后生長(zhǎng)狀況一致的幼苗進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)處理。使用200 mg/mL PEG-6000模擬干旱，對(duì)照植株澆水，分別在0、3、5、7 d后收集相應(yīng)處理時(shí)間植株的葉片（取植株的老葉、第1張完全展開葉和未展開葉混合為1個(gè)樣品，共5個(gè)），葉片樣品在液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中;ABA處理濃度為100 μmol/L，分別在0、3、5、7 d收集處理后植株的葉片，葉片樣品液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中;木薯塊根的生長(zhǎng)期約為10個(gè)月，置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng) （25 ℃、70%相對(duì)濕度），在 0、6、12、48 h收集相應(yīng)處理時(shí)間后的塊根，塊根液氮速凍后置于 -80 ℃ 冰箱內(nèi)保存（樣品取3個(gè)重復(fù)）。

1.3 基因克隆

葉片cDNA模板通過(guò)反轉(zhuǎn)錄葉片RNA獲得。根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中的木薯同源序列 （Manes.06G158800） 設(shè)計(jì)引物（P1，5′-ATGAATCAACTCACCGTCATCA-3′;P2，5′-TTAAGAAATGCTGCCAAGTTTA-3′），以葉片cDNA為基因克隆模板進(jìn)行MePP2C55克隆，擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 生物信息學(xué)分析

BLASTp搜索NCBI中和MePYL12同源的蛋白質(zhì)序列;理化性質(zhì)使用ExPASy ProtParam進(jìn)行計(jì)算和預(yù)測(cè);蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用SWISS-MODEL和SOPMA等在線網(wǎng)站[23];在線網(wǎng)站Plantcare進(jìn)行基因的啟動(dòng)子元件分析 （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）;保守結(jié)構(gòu)域使用NCBI-CDD在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè);序列比對(duì)采用DNAMAN6;進(jìn)化樹采用NJ法構(gòu)建;引物設(shè)計(jì)使用軟件Primer 5.0。

1.5 基因的表達(dá)分析

上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成處理樣品的RNA提取和建庫(kù)，然后通過(guò)Illumina GAⅡ （美國(guó)Illumina公司） 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)處理方法見參考文獻(xiàn)[24]。本研究的基因表達(dá)水平為FPKM （fragments per kilobase per million mapped reads） 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 MePP2C55基因的克隆

采用序列比對(duì)的方法，在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到1個(gè)木薯序列Manes.06G158800，屬于PP2C家族。以Manes.06G158800序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并擴(kuò)增，測(cè)序得到1個(gè)全長(zhǎng)為1 110 bp的片段 （圖1），氨基酸總數(shù)為369個(gè)，將其命名為MePP2C55基因。MePP2C55蛋白預(yù)測(cè)的分子式為C1 752H2 891N527O552S17，理論等電點(diǎn)為7.57，蛋白相對(duì)分子量40.7 ku，不穩(wěn)定系數(shù)為47.0，預(yù)測(cè)為不穩(wěn)定蛋白。MePP2C55蛋白的二級(jí)預(yù)測(cè)顯示，α-螺旋占38.59%，β-轉(zhuǎn)角占7.07%，延伸鏈占20.65%，無(wú)規(guī)則卷曲占33.70%。MePP2C55蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖2）。保守結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析（圖3）顯示，MePP2C55蛋白含有PP2C的家族結(jié)構(gòu)域，這些預(yù)測(cè)結(jié)果表明克隆得到的基因?qū)儆赑P2C家族基因。

2.2 MePP2C55氨基酸序列同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

以MePP2C55基因的氨基酸序列為探針，在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù) （NCBI） 中進(jìn)行序列比對(duì)，將其中同源性較高的蛋白序列下載下來(lái)，其中橡膠樹（XP_021656134.1）的序列一致性最高，達(dá)到88.80%，其次是達(dá)到80.60%的麻風(fēng)樹（XP_012090097.1）。在多重序列比對(duì)中發(fā)現(xiàn)，PP2C基因的氨基酸序列和其他報(bào)道相一致，在C-端保守。保守結(jié)構(gòu)域分析也顯示，PP2C蛋白氨基酸序列在進(jìn)化上高度保守、高度相似，和橡膠樹及麻風(fēng)樹的保守元件完全相同（圖4）。MePP2C55和HbPP2C、RcPP2C都屬于大戟科，這些結(jié)果表明，MePP2C55基因?qū)儆赑P2C家族。

2.3 MePP2C55基因的組織表達(dá)分析

以數(shù)據(jù)庫(kù) （shiny.danforthcenter.org/cassava_atlas/）中的木薯組織表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)分析MePP2C55基因的組織表達(dá)差異。結(jié)果顯示，MePP2C55基因在不同組織中的表達(dá)都較高，在側(cè)芽和葉柄中的表達(dá)最高 （圖5）。

2.4 MePP2C55基因在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)分析

MePP2C55基因?qū)儆贏BA信號(hào)通路的核心組分，所以啟動(dòng)子序列分析顯示含有10個(gè)ABRE （abscisic acid responsiveness） 元件。MePP2C55基因都能被PEG和ABA處理顯著誘導(dǎo)。MePP2C55基因的相對(duì)表達(dá)量在ABA處理3 d后達(dá)到最高，為不處理時(shí)的2.6倍，隨后慢慢下降到1.8倍;而在PEG處理中，MePP2C55基因的相對(duì)表達(dá)量隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加，在7 d時(shí)達(dá)到最高，為不處理時(shí)的3.5倍 （圖6）。

MePP2C55基因的相對(duì)表達(dá)量也和木薯塊根的采后生理性變質(zhì)過(guò)程密切相關(guān)。MePP2C55基因的相對(duì)表達(dá)量隨著采后時(shí)間增加不斷提高，在采后 48 h 達(dá)到最大值，總共提高了12.2倍，表明MePP2C55基因的表達(dá)在該過(guò)程中明顯受到誘導(dǎo) （圖7）。

3 討論與結(jié)論

PP2C基因家族的數(shù)量在不同的植物物種中并不相同，而PP2C屬于ABA信號(hào)途徑的核心組成，因此研究PP2C的功能有助于闡述ABA信號(hào)通路。本研究克隆得到木薯MePP2C55基因， 氨基酸殘基總數(shù)為369個(gè)，具有PP2C的家族結(jié)構(gòu)域（圖4），序列比對(duì)分析顯示，包含和其他PP2C基因類似的保守C末端催化結(jié)構(gòu)域，它屬于A類PP2C[25]。在親緣關(guān)系上MePP2C55與橡膠樹HbPP2C和及麻風(fēng)樹JcPP2C較近。這些結(jié)果都證明MePP2C55基因?qū)儆赑P2C家族基因。

木薯是一種在熱帶被廣泛種植的糧食和經(jīng)濟(jì)作物，具有粗生易長(zhǎng)等特點(diǎn)[26]。在木薯的生產(chǎn)實(shí)踐中由于木薯塊根在收獲后極易出現(xiàn)PPD現(xiàn)象，從而導(dǎo)致其在工業(yè)生產(chǎn)中受到大大的限制[20-22]。在果實(shí)的成熟和采后存儲(chǔ)過(guò)程中，ABA信號(hào)具有非常重要的作用，有研究表明ABA信號(hào)的傳遞對(duì)果實(shí)最終的存儲(chǔ)品質(zhì)和相應(yīng)的采后相關(guān)生理指標(biāo)具有顯著影響[27]。ABA信號(hào)途徑也是植物響應(yīng)非生物逆境的重要信號(hào)通路，PP2C是核心的組成成分[28]。模式植物擬南芥中鑒定得到的A類PP2C基因都能對(duì)ABA信號(hào)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，其中多個(gè)基因和氧化脅迫相關(guān)，此外AHG3還參與抗冷脅迫[11-13]。在小麥中分離得到的PP2C基因Wcs120也能夠提高小麥的抗寒能力[10]。苜蓿中的PP2C受到逆境脅迫的誘導(dǎo)[29]。冰葉日中花克隆得到的10個(gè)PP2C 類基因都響應(yīng)非生物逆境的脅迫[30]。玉米PP2C 基因在高鹽和干旱脅迫中屬于負(fù)調(diào)控因子[14]，而山毛櫸（Fagus longipetiolata Seem.）中的PP2C2則屬于正調(diào)控因子[31]。A類PP2C基因在重要作物水稻中都可以在對(duì)非生物逆境如高鹽、干旱和低溫等逆境有不同的響應(yīng)程度[15]。木薯經(jīng)過(guò)干旱和ABA處理后，MePP2C55基因的表達(dá)明顯受到誘導(dǎo)，在擬南芥中A類PP2C家族基因通常屬于非生物逆境脅迫和ABA信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子，但FsPP2C2基因的超表達(dá)能夠提高植株耐受逆境脅迫的能力和對(duì)ABA信號(hào)的敏感性[31]，同時(shí)AtPP2CG1基因的超表達(dá)也能夠提高植株對(duì)高鹽的耐受及對(duì)ABA信號(hào)的敏感性[32]。因此，MePP2C55基因可能是木薯響應(yīng)非生物脅迫和ABA信號(hào)的正調(diào)控因子。在PPD過(guò)程中MePP2C55基因的表達(dá)也顯著受到誘導(dǎo)。例如，在擬南芥中超表達(dá)PdPP2C基因能夠提高植株的對(duì)氧化脅迫的能力[33]。在煙草中超表達(dá)ZmPP2C2基因能夠提高植株中抗氧化酶的活性[34]。OsBiPP2C1也和細(xì)胞中的抗氧化酶活性密切相關(guān)[35]。由此推測(cè)，MePP2C55基因參與了木薯PPD的抗氧化過(guò)程。以上結(jié)果為下一步研究MePP2C55基因在延緩木薯PPD過(guò)程和提高非生物脅迫中的適應(yīng)能力提供了參考。

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