牛心肌蛋白酶解物的呈味特性與其結(jié)構(gòu)關(guān)系研究

鄔威，王瑾，付余

1(西南大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶，400715)2(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

近年來，隨著全球人口的劇烈增長，人們對高蛋白食物的需求急劇增加[1]。肉類行業(yè)每年產(chǎn)生大量的屠宰副產(chǎn)物，例如動物內(nèi)臟，其蛋白質(zhì)含量較高[2]。然而，這些屠宰副產(chǎn)物常用于生產(chǎn)低附加值的產(chǎn)品，如動物飼料、寵物食品等[3]，一定程度上造成了資源的浪費(fèi)。如何更好地利用肉類加工副產(chǎn)物，使之成為食品工業(yè)的新原料十分重要[4]。目前，酶解肉類副產(chǎn)品是提取蛋白質(zhì)的有效方法之一，但是蛋白酶解物通常具有苦味，限制其在食品加工中的進(jìn)一步應(yīng)用[5]。因此，降低或去除蛋白酶解物中的苦味成為亟待解決的關(guān)鍵問題。

蛋白酶解物的理化特性與其苦味密切相關(guān)[5-6]。肽的疏水性是苦味產(chǎn)生的關(guān)鍵因素之一。平均疏水性高的蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的肽，其苦味強(qiáng)度往往較高。此外，多肽的序列、肽鏈長度和空間結(jié)構(gòu)等也對苦味具有影響[7]。據(jù)報道，苦味肽的氨基酸殘基個數(shù)通常少于8個，且其苦味隨著肽鏈長度的延長而增加，這是由于肽鏈長度增加使苦味肽與苦味受體結(jié)合增強(qiáng)[8]?？辔峨牡目辔兑部赡苁艿剿舛?degree of hydrolysis，DH)的影響。通常，當(dāng)DH值很低時，苦味強(qiáng)度和DH呈正相關(guān)[9]。隨著蛋白質(zhì)水解程度的增加，更多的疏水性氨基酸暴露出來，導(dǎo)致其苦味增加[10]。然而，通過高強(qiáng)度的蛋白酶水解可以使苦味肽進(jìn)一步降解成更小的肽或游離氨基酸，從而減少苦味[11]。此外，蛋白酶種類也可以影響其酶解物的苦味。由于不同蛋白酶具有獨(dú)特的酶切特異性，導(dǎo)致產(chǎn)生不同的肽組分，進(jìn)而造成其呈味特性的差別。整體上，苦味肽的確切構(gòu)效關(guān)系尚未闡明。

目前，選擇性脫除疏水性肽、苦味掩蓋、酶解脫苦和包埋法等常用來降低蛋白酶解物的苦味[5]。采用外肽酶(包括氨肽酶和羧肽酶)對苦味肽進(jìn)行酶解，可使蛋白酶解物的苦味降低，且不影響蛋白酶解物的產(chǎn)率[12]。外肽酶可以選擇性酶切苦味肽的N端或C端肽鍵，釋放出游離的疏水氨基酸，降低其苦味。此外，內(nèi)肽酶和外肽酶的聯(lián)合水解，已被證明可以減少小麥面筋蛋白酶解物的苦味[11]。CHEUNG等[13]研究表明，外肽酶處理后的乳清蛋白酶解物的苦味降低，鮮味提高。鮮味是一種可口的、像肉湯或肉類的味道。目前，一些鮮味肽已從各種食物中得到分離和鑒定，它們具有強(qiáng)烈的鮮味或鮮味增強(qiáng)特性[14-15]。通常，鮮味肽是分子質(zhì)量<500 Da的典型酸性多肽[16]。鮮味肽可以通過與人類苦味受體結(jié)合，進(jìn)而抑制苦味[17]，這可以作為減少酶解物苦味的另一種策略。對于乳蛋白或植物蛋白，通過外肽酶處理可以降低苦味，但對于動物內(nèi)臟(如心肌)是否也有類似效果仍未見相關(guān)研究。此外，蛋白酶解物的呈味特性與其結(jié)構(gòu)特征之間的關(guān)系仍不清楚?；诖?，本研究嘗試開發(fā)一種有效的酶解方法，制備低苦味牛心肌蛋白酶解物，同時闡明蛋白酶解物的呈味特點(diǎn)與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛心，重慶市北碚區(qū)永輝超市；Alcalase 2.4 L FG(2.4 AU/g)、Flavourzyme(1 000 LAPU/g)、Protamex(1.5 AU/g)、Neutrase 0.8 L(0.8 AU/g)，諾維信公司;ProteAX(1 400 U/g)、Protease P 6SD(600 000 U/g)、Protease A 2SD(100 000 U/g)、Protease A，日本天野酶制品株式會社；Sumizyme BNP-L(45 000 U/g)，新日本化工有限公司。鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)、乙?；?半胱氨酸(純度99%)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、Papain P1(100 TU/mg)、Bromelain(100 TU/mg)，山東億寶萊生物科技有限公司；L-亮氨酸(純度99%)，瑞士阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；本研究其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2型磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；H3-16KR高速冷凍離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；UV-6100紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PB-10 pH計，Sartorius賽多利斯；Ultimate 3000高效液相色譜儀、EASY nLC 1200-Orbitrap Fusion Lumos液質(zhì)聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基本營養(yǎng)成分測定

水分含量測定采用GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》；蛋白質(zhì)含量測定采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪含量測定采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》；灰分含量測定采用GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》。

1.3.2 蛋白酶解物的制備

牛心經(jīng)絞肉機(jī)處理后，按100 g牛心與200 g水混合，調(diào)整pH至蛋白酶的最適pH值，并在最適溫度下加入蛋白酶(酶底比為0.5%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，持續(xù)酶解1～5 h。10種蛋白酶最適溫度和pH值如下：Alcalase(pH 7.5，50 ℃)，F(xiàn)lavourzyme(pH 7.0，50 ℃)，Protamex(pH 7.5，55 ℃)，Neutrase(pH 7.0，50 ℃)，ProteAX(pH 7.0，50 ℃)，Protease P(pH 7.0，40 ℃)，Protease A(pH 7.0，50 ℃)，木瓜蛋白酶(pH 7.0，55 ℃)，菠蘿蛋白酶(pH 7.0，40 ℃)和Sumizyme BNP-L(pH 7.0，50 ℃)。酶解作用結(jié)束后，在95 ℃下滅酶15 min；冷卻后，離心(8 000×g，15 min)后取上清液。

1.3.3 水解度的測定

采用OPA法測定水解產(chǎn)物的DH[18]。OPA試劑由10 mL的50 mmol/L OPA甲醇溶液、5 mL的20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS溶液、10 mL的50 mmol/L乙酰基-半胱氨酸水溶液和75 mL硼酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 9.5)組成。取10 μL樣品和1.2 mL OPA試劑混合，室溫反應(yīng)10 min后，在340 nm處測定吸光度。以亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品的亮氨酸當(dāng)量濃度，進(jìn)而計算DH。DH計算公式如公式(1)所示:

(1)

式中：(NH2)Tx為酶解產(chǎn)物的游離氨基含量，μmol/mL；(NH2)T0為未水解樣品游離氨基含量，μmol/mL；(NH2)total為蛋白質(zhì)樣品中游離氨基的總量，μmol/mL；采用6 mol/L的HCl在110 ℃下水解樣品24 h后測定。

1.3.4 肽分子質(zhì)量分布測定

利用分子排阻色譜分析蛋白酶解物的分子質(zhì)量分布情況，通過Chromeleon 7.0色譜軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和分析。蛋白酶解物(1 mg/mL)上樣量為10 μL，采用含0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)的30%乙腈水溶液進(jìn)行等濃度洗脫，流速0.5 mL/min，檢測波長為214 nm。用Trp(204 Da)、GLV(287 Da)、Ser-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys(1 114 Da)、胰島素(5 700 Da)和肌紅蛋白(17 600 Da)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算公式如公式(2)所示：

lgMW=-0.608 6t+6.938 1

(2)

式中：MW為分子質(zhì)量,Da；t為洗脫時間,min。

1.3.5 蛋白酶解物的感官評價

采用定量描述分析法對蛋白酶解物的呈味特性進(jìn)行感官定量描述分析，由經(jīng)過訓(xùn)練的感官評價小組[10人，4男6女，平均年齡(25±2)歲]評價10種蛋白酶制備的蛋白酶解物。在室溫下，用純水將蛋白酶解物稀釋到蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。根據(jù)每個樣品的滋味強(qiáng)度，在15 cm線尺度上評估蛋白酶解物的苦、鮮、甜、咸、酸等感官屬性以及總體香氣強(qiáng)度。樣品(25 mL)在室溫下用帶有塑料蓋的黑色塑料杯盛裝，使用3位數(shù)字編碼。在感官評價前的培訓(xùn)中，向評價小組成員提供了以下參考溶液：咖啡因(0.4 g/L，苦味強(qiáng)度，5；0.8 g/L，苦味強(qiáng)度，10)，谷氨酸鈉(1.0 g/L，鮮味強(qiáng)度，5；2.0 g/L，鮮味強(qiáng)度，10)。

1.3.6 LC-MS/MS分析

液相色譜儀：Easy-nLC 1200系統(tǒng)；色譜柱：C18色譜柱(3 μm，100 ?，75 μm×15 cm)；流動相A：0.1%甲酸的超純水；流動相B：80%的乙腈水溶液。進(jìn)樣量為5 μL，流速為0.3 mL/min。質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Orbitrap Fusion Lumos在高能離解(higher energy collisional dissociation, HCD)狀態(tài)下進(jìn)行檢測。具體參數(shù)如下：噴霧電壓：2.0 kV；毛細(xì)管溫度：320 ℃；分辨率設(shè)置：一級120 000(m/z200)，二級30 000(m/z200)；離子掃描范圍：350～1 550m/z；MS1自動增益控制(automatic gain control，AGC)：4e5。

采用Peptigram在線分析軟件(http://bioware.ucd.ie/peptigram)對蛋白酶解物的肽譜圖進(jìn)行可視化分析。輸入所需信息的CSV文件，包括肽序列、前體蛋白的UniProt ID、起始位置、終止位置、肽強(qiáng)度級別。肽圖譜以綠色線條表示，具有不同的高度和強(qiáng)度水平。

1.3.7 蛋白酶切特異性分析

根據(jù)質(zhì)譜所鑒定的肽序列，從不同樣品中提取酶切位置的氨基酸信息，進(jìn)而分析蛋白酶的酶切特異性。使用iceLogo軟件(Version 1.2)在已識別的酶切位點(diǎn)附近的3個位置(P3，P2，P1，P1′，P2′，P3′)生成氨基酸的酶特異性logo，以代表酶切位置。

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以3次獨(dú)立重復(fù)測定的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析及事后多重比較，采用Duncan分析各組間是否有顯著性差異(P<0.05為顯著)。采用主成分分析(principal component analysis，PCA)法分析感官數(shù)據(jù)。采用偏最小二乘回歸(partial least squares regression，PLSR)模型分析呈味特性(因變量)和肽分子質(zhì)量分布(自變量)的關(guān)系。PCA和PLSR分析均使用Unscrambler X10.3版軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛心肌的一般化學(xué)組成特征

牛心肌的基本化學(xué)成分結(jié)果見表1，結(jié)果表明牛心肌是高蛋白含量原料，且脂肪含量較低，是一種良好的蛋白質(zhì)資源，可用于后續(xù)的蛋白酶解。

表1 牛心肌基本營養(yǎng)成分分析 單位：%

牛心肌的氨基酸組成及含量見表2。牛心的8種必需氨基酸(essential amino acid，EAA)含量為7.33 g/100g，10種非必需氨基酸(non-essential amino acid，NEAA)含量為11.82 g/100g。世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(World Health Organization/Food and Agriculture Organization of the United Nations，WHO/FAO)理想模式的EAA/NEAA為60 g/100g，而牛心的EAA/NEAA超過WHO/FAO理想模式，達(dá)到62.01 g/100g。此外，牛心中含有高比例的谷氨酸和天冬氨酸，其酶解產(chǎn)物可能具有良好的鮮味。因此，牛心有望用于開發(fā)呈味肽等調(diào)味類產(chǎn)品。

表2 牛心肌氨基酸組成及含量Table 2 The amino acid composition and content of bovine cardiac muscle

2.2 不同蛋白酶處理下的水解度

圖1顯示了10種不同蛋白酶酶解心肌后的水解度曲線。在酶解反應(yīng)初期(1～3 h)，水解速率較快，而水解度在5 h后達(dá)到最高。在預(yù)實驗中，酶解到6 h的樣品水解度未有較大程度的提升。從Protease A、Protease P、ProteAX、Alcalase得到的酶解物，其DH值高于其他蛋白酶得到的酶解物，主要由于它們同時具有內(nèi)肽酶和外肽酶的活性。ProteaseA水解5 h后，牛心肌酶解物的DH值達(dá)到最高(30.9%)，這表明這些蛋白酶可以有效地降解牛心肌蛋白為可溶性的小肽或氨基酸。然而，Neutrase和Sumizyme BNP-L酶解牛心肌后，其水解度較低，表明這2種蛋白酶對牛心肌水解效率相對較低。

圖1 十種不同蛋白酶酶解心肌后的水解度曲線Fig.1 DH curves of protein hydrolysates from bovine cardiac muscle hydrolyzed by 10 different proteases

2.3 酶解物中肽MW的分布特征

圖2顯示了不同酶解物的分子質(zhì)量分布情況。MW分布范圍分為5個部分，即>10 kDa、5～10 kDa、1～5 kDa、0.5～1 kDa和<0.5 kDa。總體而言，不同蛋白酶處理后的牛心肌蛋白酶解物主要由低分子質(zhì)量(<1 kDa)肽組成，說明牛心肌蛋白大部分被降解為小肽或游離氨基酸。值得注意的是，Protease A、Protease P和ProteAX 3種蛋白酶釋放的低分子質(zhì)量肽組分(<1 kDa)比例最高，而Neutrase和Sumizyme BNP-L酶解后蛋白水解物的低分子質(zhì)量肽組分含量較低。本研究結(jié)果與2.2部分的DH數(shù)據(jù)一致。

圖2 十種不同的蛋白酶制備酶解物(5 h)的肽分子質(zhì)量分布Fig.2 The MW distribution of protein hydrolysates (5 h) from bovine cardiac muscle hydrolyzed by 10 different proteases

2.4 蛋白水解物的感官評價結(jié)果

通過感官評價不同蛋白酶解物的呈味特性，PCA如圖3所示。10種牛心肌蛋白酶解物的PCA圖的PC1+PC2為71%。其中，通過Protease A催化牛心肌水解得到的酶解產(chǎn)物的鮮味強(qiáng)度最高(7.50)；Protease P得到的酶解產(chǎn)物的香氣強(qiáng)度最高(7.68)。木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶得到的酶解產(chǎn)物具有一定的苦味；其余水解產(chǎn)物的香氣強(qiáng)度均較低。

進(jìn)一步剖析肽分子質(zhì)量分布與蛋白酶解物的DH和呈味特性的關(guān)系，尤其是蛋白酶解物的鮮味和苦味，結(jié)果如圖4-a和圖4-b所示。通過PLSR和相關(guān)系數(shù)熱圖分析發(fā)現(xiàn)，鮮味與MW(<0.5 kDa)有中度的相關(guān)性(r=0.45)，但與DH有很強(qiáng)的相關(guān)性(r=0.87)?？辔杜cMW(0.5～1 kDa)具有一定的相關(guān)性(r=0.44)。

圖3 不同牛心肌酶解物的呈味特性的主成分分析Fig.3 PCA based on sensory attribute for different protein hydrolysates from bovine cardiac muscle

a-PLSR分析圖；b-相關(guān)系數(shù)熱圖圖4 牛心水解蛋白的分子質(zhì)量分布分別對呈味特性的 PLSR分析圖及相關(guān)系數(shù)熱圖Fig.4 Loading plots and heatmap from PLSR analysis of sensory attributes and MW distributions of protein hydrolysates from bovine cardiac muscle

2.5 蛋白酶的酶切特性

iceLogo揭示了10種蛋白酶的酶切特異性(圖5)。根據(jù)不同蛋白酶的酶切特異性，構(gòu)建了ice Logos中P3-P3′位點(diǎn)的氨基酸頻率分布，氨基酸字母的大小對應(yīng)氨基酸頻率的差異。為了探究10種不同蛋白酶的酶切特異性，根據(jù)牛心肌蛋白酶解物的LC-MS/MS肽序列的鑒定結(jié)果，分析了酶切位點(diǎn)的氨基酸殘基的相對豐度。iceLogos結(jié)果體現(xiàn)了不同氨基酸殘基在P3-P2-P1-P1′-P2′-P3′位置的相對豐度(圖5)。蛋白酶的酶切位點(diǎn)與其在N端和C端鄰近肽鍵的氨基酸殘基相關(guān)，酶切位置主要發(fā)生在P1和P1′殘基之間。在所有蛋白酶中，P1和P1′位置分別以Lys和Ala為主。一些蛋白酶具有相似的酶特異性。例如，ProteAX、Protease A、Protease P、Flavourzyme和Neutrase具有相似的酶切位點(diǎn)，P1和P1′位置包括為Leu和Ala。

2.6 肽組分的可視化分析結(jié)果

圖6顯示10種不同蛋白酶酶解代表性前體蛋白(肌球蛋白和肌動蛋白)的肽譜圖，分別包括牛心肌α-肌動蛋白(Q3ZC07)、肌球蛋白-2(Q9BE41)和肌球蛋白-7(Q9BE39)。在心肌肌動蛋白樣品中，肌動蛋白的肽覆蓋率要比肌球蛋白高，而肽的豐度值差異很大。ProteAX、Protease A、Protease P和Flavourzyme這4種蛋白酶具有類似的酶切結(jié)果，這可能與其酶特異性有關(guān)，這一結(jié)果也與2.5部分結(jié)果一致，即4種蛋白酶具有相似的酶切位點(diǎn)，可能是與其獨(dú)特的酶切位點(diǎn)(Asp和Lys)有關(guān)。另外，Protease A、Protease P和ProteAX在氨基酸位置130附近的強(qiáng)度也高于其他蛋白酶。

圖5 基于iceLogo分析10種蛋白酶的酶切特異性Fig.5 The specificity of 10 proteases analyzed based on iceLogo

a-牛心肌肌動蛋白(Q3ZC07)；b-肌球蛋白-2(Q9BE41)；c- 肌球蛋白-7(Q9BE39)圖6 十種蛋白酶水解的代表性前體蛋白的肽譜Fig.6 Peptide profiles of representative precursor proteins hydrolyzed by 10 proteases 注：綠色柱的高度和強(qiáng)度對應(yīng)于肽的數(shù)量及該位置重疊的肽強(qiáng)度總和

3 討論

3.1 水解度與蛋白酶解物呈味特性關(guān)系

通過比較蛋白酶解物DH的差異可以更好地了解不同蛋白酶的水解程度。Protease A、Protease P和ProteAX同時含有內(nèi)肽酶和外肽酶，其酶切范圍更廣。因此，其樣品的水解度值更高(圖2)。相反，F(xiàn)lavourzyme作為內(nèi)肽酶和外肽酶的混合物，由于外肽酶相對活性更高，因此不能產(chǎn)生高DH值[18]。已有研究表明，DH可能會對蛋白酶解物的苦味產(chǎn)生影響，但是對于DH在水解產(chǎn)物中苦味所起的作用具有爭議。一般而言，在酶解初期，酶解物的苦味隨著水解度的增加而逐漸增強(qiáng)，主要由于一些疏水性的苦味肽被逐漸釋放出來，導(dǎo)致酶解物的苦味強(qiáng)度較高。而隨著水解度繼續(xù)提高，酶解物的苦味又呈下降趨勢，主要由于這些苦味肽被進(jìn)一步降解，導(dǎo)致苦味強(qiáng)度的降低[5]。在本研究中，Protease A、Protease P、ProteAX水解5 h后得到的高DH酶解物有助于降低蛋白酶解物的苦味，且提高其鮮味。這一現(xiàn)象可能歸因于外肽酶的作用，蛋白酶解物中的苦味肽進(jìn)一步降解，同時釋放出大量小肽和游離氨基酸[9,13]，這一結(jié)果與之前的研究類似。利用內(nèi)肽酶和外肽酶聯(lián)合酶解小麥面筋蛋白，制備了低苦味蛋白酶解物[11]。此外，PLSR分析表明，DH與鮮味之間存在高度正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r分別為0.70和0.87)。在較高的DH下，苦味肽的N端或C端會進(jìn)一步被降解為小肽(分子質(zhì)量<1 kDa)和游離氨基酸，有助于酶解產(chǎn)物的苦味降低以及鮮味的提高[17]。

3.2 肽分子質(zhì)量與蛋白酶解物呈味特性關(guān)系

多肽具有不同的呈味特性，其中包括苦味和鮮味[19]。疏水性小肽可能引起蛋白酶解物的苦味，這一點(diǎn)已被廣泛證實。然而，蛋白酶解物中苦味肽的確切分子質(zhì)量范圍尚不明確。有研究表明，當(dāng)多肽的分子質(zhì)量達(dá)到1 kDa時，其苦味會增加[5]。大豆蛋白酶解物的苦味與分子質(zhì)量低于1 kDa的疏水苦味肽具有相關(guān)性[20]。大豆蛋白中分子質(zhì)量在1～4 kDa的肽組分最苦，而低于1 kDa的肽組分苦味較低[21]。在本研究中，蛋白酶解物的苦味與0.5～1 kDa肽組分具有高度相關(guān)性(圖4)。這一結(jié)果與最近研究結(jié)果相一致，即苦味與0.5～1 kDa的肽組分呈正相關(guān)性[22]。從植物或動物來源的蛋白酶解物具有鮮味或鮮味增強(qiáng)特性，可能與分子質(zhì)量<500 Da肽組分有關(guān)[16]。在本研究中，Protease A、Protease P和ProteAX所制備的酶解物鮮味明顯，其肽組成以<0.5 kDa的部分(小肽和游離氨基酸)為主。PLSR分析結(jié)果表明，蛋白酶解物的鮮味與低分子質(zhì)量的肽組分(<0.5 kDa)呈正相關(guān)，進(jìn)一步解釋了本研究中酶解物具有較高的鮮味強(qiáng)度的特點(diǎn)。此外，原料中具有高比例的谷氨酸和天冬氨酸，也是產(chǎn)生鮮味的可能原因。已有研究證實，鮮味肽對苦味具有一定的抑制作用[17]，這也支持了本研究中水解產(chǎn)物具有高鮮味和低苦味的特征。

3.3 酶切特異性與蛋白酶解物呈味特性的關(guān)系

蛋白酶的酶切特異性會影響酶解物的呈味特性，不同蛋白酶可以產(chǎn)生不同的肽譜圖[9]。內(nèi)肽酶能夠酶切蛋白質(zhì)分子內(nèi)的非末端肽鍵，而外肽酶可以酶切苦味肽中N端或C末端的氨基酸，進(jìn)一步釋放肽兩端的游離氨基酸[12]。Protease A、Protease P、ProteAX和Flavourzyme 4種酶兼具內(nèi)肽酶和外肽酶的活性，其余6種蛋白酶為不同酶切特異性的內(nèi)肽酶。酶切特異性和肽譜圖結(jié)果(圖6)表明，Protease A、Protease P、ProteAX和Flavourzyme具有相似的酶切肽譜圖，這主要是由于這些蛋白酶具有相似的微生物來源[18]。外肽酶處理方法已被證明可以有效減少蛋白酶解物的苦味，增加鮮味或咸味[11-12]。當(dāng)前的研究結(jié)果與已報道研究結(jié)果一致，即采用含內(nèi)肽酶和外肽酶的復(fù)合酶制劑所制備的酶解物具有高鮮味和低苦味特點(diǎn)。然而，利用木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶2種植物源的內(nèi)肽酶所制備的酶解物卻產(chǎn)生了相對較高強(qiáng)度的苦味。與其他蛋白酶相比，它們在肽譜圖中覆蓋范圍和強(qiáng)度的差異主要是由于其不同的酶切特異性(圖6)。木瓜蛋白酶(EC 3.4.22.2)和菠蘿蛋白酶(EC 3.4.22.4)對樣品中的疏水氨基酸具有一定的酶切特異性。因此，疏水氨基酸的釋放可能是由于蛋白酶解物高苦味強(qiáng)度的原因。此外，Protemax酶解后的樣品具有一定的咸味，這與使用Protamex酶解蝦加工副產(chǎn)物后，其樣品具有一定咸味強(qiáng)度的結(jié)果相一致[13]。類似地，有報道稱魚類蛋白質(zhì)的酶水解物可以提高鹽的味道[23]，其確切的原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究利用10種不同蛋白酶分別酶解牛心肌，明確蛋白酶A可作為制備低苦味、高鮮味蛋白酶解物的最佳蛋白酶，并初步解釋了蛋白酶解物的呈味特性與蛋白酶解物的水解度、分子質(zhì)量分布及酶特異性的關(guān)系；其中，蛋白酶解物的鮮味與0.5 kDa以下的小肽呈正相關(guān)，而苦味與肽組分(0.5～1 kDa)呈正相關(guān)。本研究證明，由于不同蛋白酶具有不同的酶切特異性，造成了蛋白酶解物的肽譜圖差異，進(jìn)而產(chǎn)生了不同的呈味特性。本研究為蛋白酶解物的呈味特性與結(jié)構(gòu)關(guān)系研究提供了理論依據(jù)。