基于磁性納米探針的漁用麻醉劑三卡因的快速檢測方法

戴曉娜，陸亦寬，蔡楊楊，孫虹，盧瑛*，謝晶

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，上海，201306)

水產(chǎn)品因富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和維生素，營養(yǎng)價值高，味道鮮美等特點深受消費者喜愛。近年我國水產(chǎn)品需求量持續(xù)上升，根據(jù)《2020中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》統(tǒng)計顯示，2019年我國水產(chǎn)養(yǎng)殖總量達(dá)到6 480.36萬t[1]。但與此同時，水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題逐漸成為民眾關(guān)注的敏感話題[2]。水產(chǎn)品安全問題主要集中于運輸環(huán)節(jié)，為減少水產(chǎn)品在運輸過程中鮮活度的損失，主要采用漁用麻醉劑對其進(jìn)行保活。常見的漁用麻醉劑有10余種，其中三卡因是美國藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)唯一批準(zhǔn)可用于水產(chǎn)品的麻醉劑，因其在魚體中代謝快，對魚?；盥矢叩葍?yōu)勢已被廣泛應(yīng)用于活魚的長途運輸[3]。但是，水產(chǎn)品中殘留的三卡因長期被人體攝入后，會對人體造成過敏、造血紊亂甚至致癌等危害[4]。如湯保貴等[5]研究報道三卡因具有Ⅲ級毒性；劉偉等[6]研究報道了三卡因質(zhì)量濃度大于60 mg/L時，會導(dǎo)致魚體處于亞健康狀態(tài)。因此，為保證水產(chǎn)品的食用安全性，部分國家對三卡因有嚴(yán)格的限制標(biāo)準(zhǔn)，美國要求采用三卡因麻醉的水產(chǎn)品需經(jīng)21 d休藥期才能出售，允許最大殘留限量為1 μg/mL；加拿大要求其休藥期為5 d[7]。

三卡因的使用方法中，主要采用藥液浸泡對長途運輸中的魚類進(jìn)行麻醉?；睢２糠盅芯繉W(xué)者就三卡因?qū)Σ煌a(chǎn)品麻醉效果進(jìn)行了研究。如李寧等[8]研究了不同質(zhì)量濃度三卡因?qū)Υ罂诤邝|魚的麻醉效果，發(fā)現(xiàn)模擬運輸中三卡因的最適濃度為50～60 mg/L；采用55 mg/L的三卡因藥浴麻醉8 h，其殘留量達(dá)到36.24 mg/kg，復(fù)蘇3 d其殘留量為1.12 mg/kg。郝長杰等[9]研究了三卡因?qū)Π导y東方鲀幼魚的麻醉效果，發(fā)現(xiàn)隨著三卡因質(zhì)量濃度的升高，幼魚的麻醉時間逐漸縮短，復(fù)蘇時間延長，三卡因?qū)Π导y東方鲀的有效麻醉質(zhì)量濃度為120～140 mg/L。由此可見，無論是水產(chǎn)品運輸?shù)乃w，還是復(fù)蘇后的魚肉基質(zhì)均有高濃度的三卡因。我國對三卡因在水產(chǎn)品中的使用沒有明確的規(guī)定，尚無相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)前漁用麻醉劑濫用現(xiàn)象比較多。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，有商家未經(jīng)休藥期就將水產(chǎn)品進(jìn)行出售。試紙法主要用于目標(biāo)物的快速篩查和初步分析，三卡因快速檢測試劑盒能夠讓相關(guān)部門快速了解污染情況。但國內(nèi)市場目前沒有三卡因快檢試劑盒，現(xiàn)有的三卡因檢測方法主要是儀器分析方法，包括高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)[11]以及氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS/MS)[12-13]。而這些儀器分析法的樣本前處理復(fù)雜、耗時長，且對操作人員的技術(shù)要求高，難以滿足現(xiàn)場大批量快速篩查和檢測要求。由此可見，我國水產(chǎn)品中麻醉劑三卡因殘留檢測研究較少，尤其在漁用麻醉劑的快速檢測技術(shù)方面急需加強(qiáng)。

本研究構(gòu)建的試紙條可用于水體以及魚肉基質(zhì)中三卡因快速檢測。其中，磁性微球由超順磁性納米材料和高分子材料構(gòu)成，其表面修飾有羧基，能夠與蛋白形成牢固的共價結(jié)合，不受外界溫度、濕度影響；由于具有超順磁性，在磁場作用下，標(biāo)記操作簡單。此外，磁場具有穿透性強(qiáng)、背景干擾低的特點，以超順磁性納米材料標(biāo)記的試紙條，可以通過磁信號分析儀捕捉硝酸纖維素膜(introcellulose，NC膜)從表面到底部的近90%信號，從而在實現(xiàn)復(fù)雜的反應(yīng)體系中也能夠進(jìn)行高靈敏度的定量檢測[14]。本研究以合成的3-氨基苯甲酸(半抗原)-BSA偶聯(lián)復(fù)合物作為抗原包被到試紙條的檢測線上，以磁性納米探針作為檢測標(biāo)記物，在自主優(yōu)化設(shè)計基礎(chǔ)上開發(fā)了基于磁性納米探針的三卡因快速檢測試紙條，并和經(jīng)典的HPLC法進(jìn)行對比，對試紙條的檢測性能進(jìn)行了評價，旨在解決我國缺乏三卡因快速檢測方法問題，為今后政府部門對漁用麻醉劑的實時監(jiān)管提供參考，為開發(fā)三卡因快檢試劑盒提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙泊酚、N，N-二甲基苯胺、布比卡因、苯佐卡因，上海源葉生物科技有限公司；利多卡因，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丁香酚，德國CNW公司；苯氧乙醇，BePure標(biāo)準(zhǔn)品有限公司；三乙胺、氯甲酸異丁酯、乙腈，上海麥克林生物科技有限公司；吐溫-20、牛血清蛋白(bovine albumin，BSA)、2-嗎啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid，MES)，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；三卡因標(biāo)準(zhǔn)品，德國LGC公司；三卡因抗體，無錫迪騰敏生物科技有限公司；3-氨基苯甲酸、1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亞胺鹽酸鹽[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy succinimide，NHS)，美國Sigma公司；羊抗鼠IgG、吸水墊、硝酸纖維素膜(CN140)、結(jié)合墊、樣本墊、覆膜、底板，上海捷寧生物科技有限公司；超順磁性納米材料 (PM3-020，180 nm，棕褐色)，上海奧潤微納新材料科技有限公司；均質(zhì)子、QuEChERS 凈化管，逗點生物有限公司；TMB顯色液，上海泛柯實業(yè)有限公司；羊抗鼠IgG-HRP，上海威奧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bio-Tek酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；切條機(jī)，上海捷寧生物科技有限公司；HS-3垂直混合器，寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ400-KDE超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；磁性分析儀MICAD-F1，自研；磁力架，上海奧潤微納新材料科技有限公司；QL-901 漩渦振蕩器，海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 3-氨基苯甲酸-BSA抗原的制備與表征

將6 mg 3-氨基苯甲酸溶于500 μLN，N-二甲基苯胺，以體積比100∶1加入三乙胺，垂直混合(4 ℃，15 min)，加入3 μL氯甲酸異丁酯，垂直混合(4 ℃，1 h)，再加1.4 mL BSA(2.5 mg/mL)，垂直混合(4 ℃，過夜)，用10 mmol/L PBS(pH 7.2)透析72 h后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e對2 mg/mL BSA、3-氨基苯甲酸和 3-氨基苯甲酸-BSA抗原進(jìn)行紫外光譜掃描，觀察吸收峰位置。

1.3.2 間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗

參考胥傳來等[15]方法，以碳酸鹽[CBS(Na2CO3和NaHCO3)，50 mmol/L，pH 9.6]為包被緩沖液，10 μg/mL 3-氨基苯甲酸-BSA抗原作為包被抗原4 ℃過夜反應(yīng)。以50 g/L脫脂奶粉(200 μL/孔)作為封閉溶液，37 ℃反應(yīng)2 h。0.5～2 700 ng/mL三卡因標(biāo)準(zhǔn)溶液先與三卡因單抗(1∶25 000,體積比)混合均勻(37 ℃預(yù)孵育1 h)后于加入酶標(biāo)孔中37 ℃孵育1 h。充分洗滌后加入羊抗鼠IgG-HRP(用PBS以體積比1∶2 500稀釋)37 ℃孵育1 h，最后加入TMB顯色液25 ℃顯色15 min，加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。

1.3.3 磁性納米探針的制備

參考LIU等[16]方法，將500 g/L EDC和250 g/L NHS以體積比1∶2加入含有1 mg 磁性納米材料的MEST緩沖液[含有0.05%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-20的MES緩沖液，10 mmol/L，pH=5.0]，垂直混合(25 ℃，30 min)，加入20 μg 三卡因單抗，垂直混合(25 ℃，3 h)，隨后加入0.5 mL 10 g/L BSA，垂直混合(25 ℃，30 min)，最后將探針置于1 g/L BSA、0.1g/L NaN3的BST[含0.05%吐溫(體積分?jǐn)?shù))-20的硼酸鹽緩沖液，5 mmol/L，pH 9.0]溶液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 三卡因試紙條的構(gòu)建

首先將0.5 mg/mL的3-氨基苯甲酸-BSA抗原、0.5 mg/mL羊抗鼠IgG以1 μL/cm的速度分別噴涂在NC膜的檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)上，37 ℃下干燥2 h；然后把NC膜、樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊及聚氯乙烯底板依次組裝，裁切成5 mm寬的試紙條密封干燥保存。

1.3.5 三卡因試紙條的樣品檢測和結(jié)果判定

將待測樣品、磁性納米探針和層析液[含有5%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-20、200 g/L BSA的PBS緩沖液]以體積比100∶4∶15混合均勻后滴加于樣品墊上，靜置(傾斜10度)5～10 min后肉眼觀察T線和C線顯色情況，以PBS緩沖液代替樣品的混合溶液作為陰性對照。檢測結(jié)束后，C線顏色明顯，樣品的T線顏色明顯淺于陰性對照甚至完全消失的為陽性結(jié)果，而樣品的T線顏色與陰性對照接近或更深的則為陰性；如果檢測時C線未顯色表示該試紙條無效。反應(yīng)20 min后采用磁性分析儀檢測試紙條T、C線上的磁信號值，繪制三卡因的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用公式(1)判定檢測結(jié)果。

(1)

式中：S，儀器檢測到的磁信號值；B，檢測樣本的T/C線的磁信號比值；B0，陰性對照的T線和C線的磁信號比值。當(dāng)B/B0≥0.8時為陰性，0.3≤B/B0<0.8為弱陽性，B/B0<0.3為強(qiáng)陽性結(jié)果。

1.3.6 檢測性能評價

特異性：以10 μg/mL的三卡因、布比卡因、苯佐卡因、利多卡因、丁香酚、苯氧乙醇、丙泊酚7種常見漁用麻醉劑為樣品進(jìn)行試紙條檢測，以PBS緩沖液代替樣品的混合溶液作為陰性對照。

靈敏度：采用0～500 μg/mL系列質(zhì)量濃度三卡因溶液進(jìn)行試紙條檢測，以肉眼觀察到T線消失時的三卡因濃度作為試紙條定性檢出限，每個濃度設(shè)置3個平行，以陰性樣本B/B0值的平均值減去三倍標(biāo)準(zhǔn)差對應(yīng)的濃度作為檢出限。

重現(xiàn)性和穩(wěn)定性：分別采用同一批次和不同批次的試紙條檢測0.5、1.0、5.0 μg/mL三卡因，根據(jù)檢測結(jié)果評價試紙條的重現(xiàn)性。利用高溫加速試驗原理[17]，將試紙條存放于60 ℃烘箱，每隔1 d檢測1次0.5、1.0、5.0 μg/mL三卡因樣品，持續(xù)5 d，根據(jù)檢測結(jié)果判斷試紙條的穩(wěn)定性。

1.3.7 人工污染樣品檢測和方法學(xué)驗證

采集校園內(nèi)不同的魚塘水作為稀釋溶液，分別制備0.5、1.0、5.0 μg/mL三卡因人工污染水體。此外，將草魚洗凈，取部分魚肉樣品于組織勻漿機(jī)攪碎混勻，放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。? g勻漿后的魚肉于50 mL離心管，加入三卡因標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行混合，加入500 μL 去離子水和一粒均質(zhì)子渦旋振蕩5 min，渦旋混勻后加入1 mL乙腈振蕩提取(25 ℃，10 min)，隨后加入1 g MgSO4渦旋振蕩30 s，離心收集上清(4 ℃，4 000 r/min，5 min)，過凈化管小柱凈化，收集流出液，60 ℃氮吹至近干，加入PBS定容至2.5 mL，制備0.5、1.0、5.0 μg/mL三卡因人工污染魚肉提取液。過0.22 μm膜，收集濾液作為樣品，分別用HPLC和試紙條進(jìn)行檢測，依據(jù)定量結(jié)果計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 3-氨基苯甲酸-BSA抗原的鑒定

3-氨基苯甲酸-BSA分子結(jié)構(gòu)與三卡因相似，且末端有直接與載體蛋白偶聯(lián)的羧基，與載體偶聯(lián)后仍保留基本結(jié)構(gòu)不變[18]，因此本研究以3-氨基苯甲酸為半抗原，利用三乙胺/氯甲酸異丁酯混合酸酐法把BSA和3-氨基苯甲酸偶聯(lián)制備3-氨基苯甲酸-BSA復(fù)合物，以此作為ELISA和試紙條T線的包被抗原。紫外吸收光譜結(jié)果(圖1-a)顯示，3-氨基苯甲酸在220～260及305 nm處有多個特征吸收峰，BSA則在280 nm附近有特征吸收峰，與BSA相比，3-氨基苯甲酸-BSA復(fù)合物在260～320 nm處的吸收峰較寬；與3-氨基苯甲酸相比，3-氨基苯甲酸-BSA復(fù)合物220～260 nm處的吸收峰形狀發(fā)生改變，由此可見，3-氨基苯甲酸-BSA復(fù)合物的這些紫外吸收峰改變可能是BSA和3-氨基苯甲酸的偶聯(lián)所致。為了進(jìn)一步評價3-氨基苯甲酸-BSA是否偶聯(lián)成功，本研究以10 μg/mL 3-氨基苯甲酸-BSA作為包被抗原，采用三卡因的特異性單抗進(jìn)行競爭性ELISA檢測，結(jié)果如圖1-b所示，呈現(xiàn)一個典型的“S”型競爭曲線，表明3-氨基苯甲酸-BSA與抗體間存在特異性反應(yīng)，經(jīng)計算抗體的IC50值為32.12 ng/mL。沈心怡[19]采用間接競爭ELISA方法評價丁香酚、三卡因抗體的質(zhì)量，測得IC50值分別為42.844、43.399 ng/mL，證明抗體的靈敏度較高，且包被抗原與抗體之間具有較強(qiáng)的親和力和特異性。本研究得到的IC50較之更小，由此可見，合成的3-氨基苯甲酸-BSA抗原可用于免疫層析試紙條檢測。

a-紫外吸收光譜圖;b-競爭ELISA抑制曲線圖1 三卡因完全抗原的紫外吸收光譜和競爭ELISA曲線圖Fig.1 The UV absorption spectrum and competitive ELISA curve of tricaine complete antigen

2.2 基于磁性納米探針的三卡因?qū)游鰴z測原理

三卡因的檢測試紙條結(jié)構(gòu)如圖2所示，由樣品墊、結(jié)合墊、NC、吸水墊組成，T線包被3-氨基苯甲酸-BSA抗原，C線包被羊抗鼠IgG。若樣品中無三卡因時，磁納米探針與T線上的3-氨基苯甲酸-BSA抗原發(fā)生特異性反應(yīng)從而停留在T線上，而C線上的羊抗鼠IgG和探針表面的三卡因單抗也存在特異性反應(yīng)，因而試紙條的T線和C線都可以通過肉眼觀察到顏色，用磁信號儀檢測時可以看到T和C線處均有吸收峰，檢測結(jié)果為陰性(圖2，右上)。當(dāng)樣品中三卡因濃度逐漸增加時，被T線捕獲的磁性納米探針則越來越少，T線顯色減弱，顏色越淺，相應(yīng)的磁信號吸收峰變小(圖2，右下)，其檢測結(jié)果為陽性。

圖2 磁性免疫層析試紙條定量檢測三卡因的原理圖Fig.2 Schematic of magnetic immunochromatographic test strip for quantitative detection of tricaine

2.3 特異性

本研究選用了三卡因、布比卡因、苯佐卡因、利多卡因、丁香酚、苯氧乙醇、丙泊酚7種常見的漁用麻醉劑評價所開發(fā)試紙條的檢測特異性，檢測結(jié)果如圖3所示。由圖3-a可知，僅三卡因的檢測試紙條，在T線處的檢測限肉眼幾乎不可見，而丁香酚、布比卡因等其他6種麻醉劑的T線處顏色與陰性對照幾乎一致，表明磁性納米探針表面的三卡因單抗僅與三卡因有特異性反應(yīng)，與其他麻醉劑無交叉反應(yīng)。此外，依據(jù)試紙條的T線和C線的定量檢測結(jié)果，三卡因樣品的B/B0<0.2，為強(qiáng)陽性結(jié)果(圖3-b)；而其他6種麻醉劑的B/B0均大于0.9，與陰性樣品接近(圖3-b)，為陰性結(jié)果。由此可見，定量結(jié)果與定性觀察到的結(jié)果相吻合。三卡因與苯佐卡因互為同分異構(gòu)體[20]，而本試紙條對苯佐卡因無交叉反應(yīng)，表明該試紙條具有良好的特異性，檢測時不受其他漁用麻醉劑的干擾，具有較好的應(yīng)用前景。

a-定性結(jié)果;b-定量結(jié)果圖3 三卡因試紙條特異性檢測Fig.3 SpeciffiIcity of tricaine test strip

2.4 靈敏度

采用三卡因試紙條分別檢測PBS和魚肉基質(zhì)和水體中的三卡因標(biāo)準(zhǔn)品，其定性和定量檢測結(jié)果見圖4。由圖4可知，T線顏色隨著三卡因質(zhì)量濃度的增加而逐漸變淺，當(dāng)PBS緩沖液(圖4-a)、魚肉基質(zhì)(圖4-b)和水體(圖4-c)中的三卡因質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 μg/mL (魚肉基質(zhì)1.25 μg/g)時，T線顏色很淺，而5.0 μg/mL(魚肉基質(zhì)2.5 μg/g)時則幾乎肉眼不可見。以T線消失時的質(zhì)量濃度作為定性檢出限，因此魚肉基質(zhì)5.0 μg/mL(相當(dāng)于2.5 μg/g)可作為試紙條的定性檢出限。采用磁性免疫層析分析儀測定T、C線的磁信號強(qiáng)度，通過數(shù)據(jù)擬合表明，所建立的三卡因快速檢測方法對PBS緩沖液、魚肉基質(zhì)、水體樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線如公式(2)～公式(4)所示:

(2)

(3)

(4)

式中：Y，檢測樣本的T/C線的磁信號比值與陰性對照的T線和C線的磁信號比值的比值(B/B0)；X，三卡因質(zhì)量濃度，μg/mL。

根據(jù)B/B0值與三卡因加標(biāo)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4-d)，檢出限采用公式計算得出[21]。由圖4-d可知，3個曲線基本一致，表明魚肉基質(zhì)對試紙條的檢測干擾較小。經(jīng)計算，該試紙條對PBS稀釋三卡因的檢出限為0.131 μg/mL，對魚肉基質(zhì)中三卡因的檢出限為0.150 μg/mL(相當(dāng)于0.075 μg/g)，對水體中三卡因的檢出限為0.141 μg/mL，僅為美國FDA規(guī)定的水產(chǎn)品中三卡因最大殘留量(1 μg/mL)的1/6。

a-PBS緩沖液;b-魚肉基質(zhì);c-水體;d-定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4 三卡因試紙條靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity of tricaine test strip

通常水產(chǎn)品運輸水體和魚肉基質(zhì)中三卡因的濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于該試紙條的檢出限，如王文豪等[22]研究發(fā)現(xiàn)適合麻醉大口黑鱸魚的三卡因劑量為70 mg/L，最適的運輸質(zhì)量濃度為50 mg/L。李寧等[8]采用50 mg/L三卡因?qū)Υ罂诤邝|魚進(jìn)行麻醉，發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇8 h魚肉基質(zhì)中三卡因殘留量高達(dá)36.24 mg/kg。盡管儀器分析法靈敏度高，由于耗時長、操作繁瑣、場地受限等問題難以滿足三卡因現(xiàn)場檢測需求。劉海新等[13]建立了魚肉中三卡因殘留的GC-MS檢測方法，方法檢出限為2.5 μg/kg，但魚肉樣品測定前需要經(jīng)乙腈提取、氮吹濃縮、鹽酸溶液引導(dǎo)三卡因電離、固相萃取柱凈化等處理，從樣品處理到檢測完成所用時間大于3 h，操作繁瑣。劉春新等[23]建立了魚血和魚肝中三卡因的HPLC檢測方法，樣品經(jīng)勻漿、高速離心、0.45 μm膜過濾處理后上樣檢測，使用魚血(稀釋倍數(shù)30 mg/mL)和魚肝(稀釋倍數(shù)30 mg/mL)勻漿液制備質(zhì)量濃度為10、20、40、80、100 μg/mL的三卡因，成功建立了三卡因的工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，但回收率較低，其中魚血中回收率低至80%，魚肝中回收率低至66.66%，說明基質(zhì)效應(yīng)對該方法的影響較大。而本研究建立的試紙條法，魚肉基質(zhì)干擾較小，從樣品處理到檢測僅需約40 min，且操作簡單，無需大型儀器，成本低廉，適合于水產(chǎn)品中殘留三卡因的現(xiàn)場快速篩查和檢測。

2.5 準(zhǔn)確性評價

分別采用三卡因試紙條和HPLC檢測三卡因人工污染水體和魚肉基質(zhì)(n=3)，結(jié)果見表1。試紙法與HPLC對三卡因各濃度的檢測結(jié)果比較接近，表明試紙法與HPLC具有良好的一致性。試紙法對水體和魚肉基質(zhì)中三卡因的加標(biāo)回收率81.56%～113.59%，但是魚肉基質(zhì)各樣品檢測值的CV值明顯高于水體組樣品，由此可見，在可接受范圍內(nèi)魚肉基質(zhì)對試紙條的檢測存在干擾。魚肉基質(zhì)加標(biāo)三卡因樣品5.0 μg/mL(相當(dāng)于2.5 μg/g)的試紙條回收率最低，為(81.56±4.98)%，且樣本間的變異系數(shù)CV較高(6.1%)，表明檢測高濃度三卡因麻醉劑時，魚肉基質(zhì)對試紙條的檢測結(jié)果干擾相對較大。HPLC分析方法因為其通過色譜柱分離富集，減少了基質(zhì)帶來干擾。盡管儀器分析法準(zhǔn)確性高，但在檢測效率上是遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于試紙法。黎智廣等[24]采用HPLC-MS/MS檢測水產(chǎn)品中的三卡因，樣品需要提取、氮吹、過膜等前處理步驟，時長約3 h，樣品檢測還需15 min以上。本研究建立的試紙法樣品前處理操作簡單(約40 min)，可在5～10 min實現(xiàn)定性檢測，20 min實現(xiàn)準(zhǔn)確定量檢測，大大縮短了檢測時間，且操作簡單，能夠有效提高檢測效率。

表1 試紙法與HPLC法對三卡因人工污染水體和魚樣的檢測結(jié)果Table 1 Test results of tricaine by test strip and HPLC in artificially contaminated water and fish samples

2.6 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

三卡因試紙條的檢測重現(xiàn)性主要采用批內(nèi)和批間實驗進(jìn)行評價，本研究在檢測線性范圍內(nèi)，以PBS為稀釋溶液，選擇了低、中、高加標(biāo)濃度(0.5、1.0、5.0 μg/mL)進(jìn)行試紙條檢測。由表2可知，來自同一批次(批內(nèi))及不同批次(批間)的試紙條對三卡因的檢測濃度與其加標(biāo)濃度基本一致，不同濃度加標(biāo)樣品對應(yīng)的批內(nèi)差異(CV<5%)略小于批間差異(CV<6%)，該結(jié)果與WANG等[25]對試紙條重現(xiàn)性檢測的結(jié)論一致。各濃度的同一批次檢測結(jié)果，其回收率為89.2%～112%，且變異系數(shù)較低(CV<5%)，表明本研究所構(gòu)建的試紙條具有較好的重現(xiàn)性。采用高溫加速實驗對試紙條的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果見表2，隨著高溫保存時間的延長，試紙條對低、中和高濃度三卡因的檢測結(jié)果并未發(fā)生明顯變化，試紙條在60 ℃保存5 d后，其B/B0的變異系數(shù)CV值仍小于8%，表明試紙條穩(wěn)定性很好。徐曉巍等[26]基于磁納米探針構(gòu)建了乙肝快速檢測試紙條，并進(jìn)行了37 ℃高溫加速實驗檢測試紙條穩(wěn)定性，結(jié)果表明，該試紙條可在37 ℃下穩(wěn)定保存3周，相當(dāng)于25 ℃下可保存半年。根據(jù)Arrhenius方程，試紙條在干燥環(huán)境下60 ℃貯存1 d相當(dāng)于25 ℃貯存1個月[17]。由此推測該試紙條25 ℃下至少可保存5個月，將其密封保存至4 ℃下，可保存更長時間。

表2 試紙條重現(xiàn)性和穩(wěn)定性檢測(n=5)Table 2 Reproducibility and stability test of tricaine test strip (n=5)

3 討論

三卡因是長途運輸活魚常用的一種漁用麻醉劑，盡管其應(yīng)用于水產(chǎn)品麻醉中具有很大優(yōu)勢，但被人體大量攝入后會對人體造成不良反應(yīng)。據(jù)研究調(diào)查結(jié)果表明，水產(chǎn)品長途運輸過程中三卡因有效麻醉濃度較高、運輸時間(持續(xù)麻醉時間)較長，進(jìn)而導(dǎo)致水產(chǎn)品中殘留有大量的三卡因。如陳永平等[27]對三卡因在草魚、花鱸、鯽魚組織中的富集和消除進(jìn)行探究，采用50 mg/L的三卡因?qū)|(zhì)量約100 g的3種魚進(jìn)行浸泡，發(fā)現(xiàn)浸泡3 h時三卡因在草魚血液、肌肉和肝胰臟的殘留量分別為2.341 μg/mL、1 275 μg/kg、2 130 μg/kg；花鱸魚中的殘留量分別為1.856 μg/mL、1 467 μg/kg、1 717 μg/kg；鯽魚中的殘留量分別為2.382 μg/mL、1 241 μg/kg、1 962 μg/kg。復(fù)蘇8 h后，草魚肌肉和肝胰臟殘留三卡因含量為120 μg/kg和482 μg/kg；花鱸魚中殘留量為244 μg/kg和334 μg/kg；鯽魚中殘留量為132 μg/kg和504 μg/kg。由此可見，復(fù)蘇后的魚體內(nèi)還殘留有大量的三卡因，而本研究構(gòu)建的三卡因快速檢測試紙條檢測限為75 μg/kg，可實現(xiàn)運輸水體中和魚肉組織中三卡因的快速篩查和初步分析，使相關(guān)部門快速了解麻醉劑污染情況。儀器檢測方法在檢測靈敏度上的確占有優(yōu)勢，但對儀器設(shè)備和操作人員的技術(shù)能力依賴性較強(qiáng)，耗時長，所以不適用于漁業(yè)基層監(jiān)管部門的現(xiàn)場監(jiān)管。如表3所示，HPLC-MS/MS及GC-MS/MS等儀器方法是目前三卡因的主要檢測手段，其中，HPLC-MS/MS法的檢出限達(dá)1.0 μg/kg，但檢測時間大于90 min，且樣品的前處理需要經(jīng)過提取、離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、凈化等多次操作，過程較為復(fù)雜，無法滿足快速檢測的需求。GC-MS/MS法的檢出限達(dá)2.0 μg/kg，由于前處理需要經(jīng)過重復(fù)提取、離心、凈化、氮吹、過膜等步驟，整個檢測時長大于120 min，這導(dǎo)致儀器分析無法應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測。本研究利用磁性納米材料標(biāo)記三卡因單抗，構(gòu)建了可準(zhǔn)確檢測魚肉基質(zhì)和水體中三卡因的試紙條檢測方法，且水體無需進(jìn)行特殊的前處理，只需肉眼觀察T線和C線的顏色即可在5～10 min 內(nèi)實現(xiàn)三卡因的快速定性檢測，定量檢出限低至0.141 μg/mL，且操作簡單、成本低，可進(jìn)行現(xiàn)場大規(guī)模檢測，采用本研究開發(fā)的試紙條檢測魚肉基質(zhì)中三卡因，其結(jié)果為陽性表示魚肉中三卡因殘留量較高，污染程度較高，對監(jiān)管部門具有示警作用。

4 結(jié)論

本研究將磁性納米探針與層析檢測技術(shù)相結(jié)合，建立了一種漁用麻醉劑三卡因的快速定性和定量檢測試紙條。該試紙條可在5～10 min內(nèi)實現(xiàn)水體和魚肉基質(zhì)中三卡因的定性檢測，其檢出限為0.141 μg/mL和0.150 μg/mL(相當(dāng)于0.075 μg/g)，僅為美國對水產(chǎn)品中三卡因最大殘留量要求(1 μg/mL)的1/6，可對水產(chǎn)品在運輸過程中及出售前水體中的三卡因進(jìn)行初步快速分析，對苯佐卡因、利多卡因、丁香酚、苯氧乙醇、丙泊酚等常見漁用麻醉劑無交叉反應(yīng)，特異性高。此外，該試紙條具有較好的穩(wěn)定性(25 ℃下可保存半年)，操作簡便，不僅為國內(nèi)市場三卡因快速檢測試劑盒的缺乏提供參考價值，還實現(xiàn)了魚肉基質(zhì)和水體中三卡因的現(xiàn)場快速篩查與檢測，為今后水產(chǎn)品及水體中三卡因的監(jiān)控提供了技術(shù)支撐，保障鮮活水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。