天然產(chǎn)物的合成生物學(xué)研究

葉少杰 秦嘉豪 路斯博 魏岱旭

合成生物學(xué)是21世紀(jì)誕生的一門交叉學(xué)科，它結(jié)合了傳統(tǒng)的生物工程和系統(tǒng)生物學(xué)概念，旨在建立人為設(shè)計的生物系統(tǒng)，即將基因連接成網(wǎng)絡(luò)，利用宿主細胞（底盤細胞）完成設(shè)想的相關(guān)任務(wù)，具體過程一般包括底盤細胞的構(gòu)建、合成元件的挖掘與采用、合成途徑的設(shè)計以及細胞合成工廠的創(chuàng)建。由于微生物具有代謝速率高、培養(yǎng)條件易控制、可通過生化反應(yīng)器放大其規(guī)模等諸多優(yōu)點，所以目前普遍將微生物作為底盤細胞。

利用合成生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)目的產(chǎn)物具有高效、經(jīng)濟、環(huán)境友好等一系列優(yōu)點，因此，運用該手段針對各種化學(xué)品、新型非天然藥物、天然產(chǎn)物等的研發(fā)與應(yīng)用正在如火如荼地展開。有研究團隊利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組的關(guān)聯(lián)分析，確定并全面解析了黃芩素的整個生物合成途徑，再用生物合成技術(shù)生產(chǎn)產(chǎn)品[1]；有研究人員以嗜鹽單胞菌為研究對象，實現(xiàn)了聚羥基脂肪酸等高分子材料、化學(xué)品和燃料的生物制造，其可應(yīng)用于醫(yī)療、環(huán)境等領(lǐng)域[2-5]；另有研究團隊長期以深海、極地等極端環(huán)境的微生物和動植物共生生物為研究對象，克隆并鑒定了多種抗生素的基因簇，開展關(guān)于非天然抗生素藥物的合成生物學(xué)研究，獲得了大量新型的抗生素衍生物，推動了我國微生物藥物生物合成領(lǐng)域的發(fā)展[6]；還有實驗室利用邏輯門的概念（指具有與計算機所用電路邏輯門類似信息處理能力的基因線路組件），成功設(shè)計并構(gòu)建了基因線路，實現(xiàn)了對于膀胱癌細胞的識別和治療[7]。合成生物學(xué)的不斷發(fā)展和完善為能源、材料、醫(yī)療、食品、日化等行業(yè)提供了更多的產(chǎn)品支撐。

結(jié)構(gòu)多樣的天然產(chǎn)物

天然產(chǎn)物具有很好的生物學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、香料、化妝品等方面。然而，從植物或動物本身提取天然產(chǎn)物的步驟十分煩瑣，且收益低，同時由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，利用化學(xué)合成天然產(chǎn)物也會帶來很大的困難，因此生物合成法就成為一個值得考慮的新方法。

萜類化合物

萜類化合物是自然界廣泛存在的一大類異戊二烯衍生物，主要從植物、微生物及海洋生物中分離得到。萜類通式是 （C5H8）n（n是異戊二烯的單元數(shù)）。其目前已鑒定得到的種類有55 000多個，占所有天然化合物的60%[8]。

萜類不但具有廣泛的抗癌功效[9]，還有消炎、降糖等藥理作用。三萜皂苷類能夠消炎、抗過敏、抗病毒、降血糖、治療白血病，以及防治心腦血管等疾病[10]。此外，很多植物源萜類化合物是芳香性揮發(fā)性物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于香料、香水、調(diào)味劑及化妝品等行業(yè)[11]。萜類結(jié)構(gòu)的多樣性還使其成為汽油、柴油等燃料的高級替代物。例如單萜蒎烯、檸檬烯、半萜異戊烯醇、異戊醇等均是公認的燃料及燃料的前體物。

萜類在植物中的含量通常很低，且植物提取法還存在野生資源稀缺、分離效果不佳、產(chǎn)量極低的問題?；瘜W(xué)合成法雖解決了植物提取法中的諸多問題，但仍存在原料昂貴、工藝流程復(fù)雜、立體選擇性低、污染大、總收率偏低等問題。而生物合成法則不受原料的限制，具有生產(chǎn)過程綠色清潔、產(chǎn)物單一、產(chǎn)率提升空間大等優(yōu)勢。生物合成法有兩種，一種是通過代謝工程手段直接在植物中促進萜類化合物的合成，然而由于植物生長緩慢且體內(nèi)代謝過程錯綜復(fù)雜，所以這種萜類合成方法面臨著目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量有限、后期分離困難、生產(chǎn)周期長等問題；另一種是通過合成生物學(xué)的方法在微生物等底盤細胞中合成目標(biāo)產(chǎn)物。目前，對于萜類合成生物學(xué)的設(shè)計策略一般可以分為兩部分：一是底盤細胞的選擇及改造；二是萜類合成途徑的挖掘。

底盤細胞的選擇及改造是實現(xiàn)合成生物學(xué)方法用以生產(chǎn)萜類化合物的基礎(chǔ)。選取不同的底盤細胞對于萜類的生物合成有關(guān)鍵性的影響，例如大腸桿菌主要用于酮、醇、酸等化學(xué)品而非萜類的生物合成。另外，由于細菌缺少翻譯后修飾而難以表達細胞色素，且很多萜類化合物具有抗細菌活性，因此多采用釀酒酵母等真核生物進行萜類的生物合成。利用酵母細胞的好處是酵母能夠直接合成較多的二甲基丙烯基二磷酸和異戊烯焦磷酸，從而為萜類合成提供大量的前體物。其優(yōu)勢有三點：一是選用酵母作為底盤細胞可以通過酵母基因組的必需基因分析，保留最小基因組，從而在萜類的生物合成過程中減少其內(nèi)源消耗；二是所有基因工程操作都可以通過染色體融合完成，這樣可以保證酵母工程菌株的遺傳穩(wěn)定性；三是可以通過對酵母細胞進行耐高溫、耐酸、耐鹽等抗逆改造。

萜類合成途徑的挖掘是從自然中尋找合適的萜類化合物生成與表達的相關(guān)基因，并將其加入人工設(shè)計的基因表達系統(tǒng)內(nèi)，從而直接或間接實現(xiàn)對萜類物質(zhì)的生物生產(chǎn)流程的優(yōu)化或創(chuàng)造。無論何種產(chǎn)物，其相關(guān)合成途徑的挖掘是合成生物學(xué)快速發(fā)展的保障。隨著全基因組測序、第二代 DNA 測序技術(shù)以及宏基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的天然產(chǎn)物代謝途徑被挖掘出來，并且植物萜類化合物的合成往往伴隨著基因表達簇結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)。隨著對異源基因的密碼子優(yōu)化、啟動子終止子的選取和搭配組合優(yōu)化、合成途徑的標(biāo)準(zhǔn)化組裝、發(fā)酵條件摸索及發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面的深入研究，萜類合成關(guān)鍵酶的異源高效表達以及萜類的合成能力已經(jīng)得到了很大的提高。

當(dāng)前通過對萜類的生物合成途徑的鑒定研究，設(shè)計開發(fā)出越來越多的組合調(diào)控萜類合成途徑的功能模塊，并在底盤細胞中創(chuàng)建合成工廠，已可實現(xiàn)萜類的體外合成。因此，合成生物學(xué)的發(fā)展為實現(xiàn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)萜類提供了有力的支撐。

生物堿

生物堿是一類含負電荷氮離子的、具有環(huán)狀或非環(huán)狀結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于諸多生物分泌物中。植物界中的罌粟科、豆科、蘭科以及麻黃科等普遍會分泌生物堿；動物界中有蟾蜍分泌的蟾蜍堿、麝香中的麝香吡啶、加拿大海貍香腺中的海貍堿等。生物堿普遍具有抗菌、抗癌、鎮(zhèn)痛等作用，也是當(dāng)今抗腫瘤、心血管疾病相關(guān)藥物研發(fā)生產(chǎn)的重要資源。然而，由于植物生長緩慢且體內(nèi)生物堿含量較低，無法滿足市場需求。因此用合成生物學(xué)的方法實現(xiàn)生物堿的規(guī)?；a(chǎn)是很好的方法。

青蒿素是我國發(fā)現(xiàn)的第一個被國際公認的抗瘧首選天然藥物，其結(jié)構(gòu)為含過氧橋基團結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物。眾多科研人員通過接力式的研究，先后實現(xiàn)了將青蒿中的紫穗槐-4， 11-二烯合酶在酵母中過表達（實現(xiàn)了青蒿素合成前體紫穗槐-4， 11-二烯的合成）、啟動子和代謝流優(yōu)化、整合細胞色素酶、脫氫酶，再通過添加過程代謝物等手段，目前已使得酵母中青蒿酸的含量達到 25 克/升，初步達到工業(yè)化生產(chǎn)水平?？梢哉f，青蒿素是目前利用合成生物學(xué)技術(shù)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化最為成功的典范之一。然而，實現(xiàn)低成本工業(yè)化生產(chǎn)青蒿素等眾多生物堿的探索道路仍然任重道遠。

目前，利用合成生物學(xué)手段實現(xiàn)實際社會生產(chǎn)中的天然產(chǎn)物合成仍然存在著諸多挑戰(zhàn)。例如原核表達系統(tǒng)、細胞內(nèi)無高級細胞器、缺乏轉(zhuǎn)錄后修飾，而酵母作為真核表達系統(tǒng)必須人為地將內(nèi)含子從蛋白質(zhì)編碼序列中刪除。越來越多的生物技術(shù)，如構(gòu)建基因庫、蛋白質(zhì)工程、高通量篩選以及 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)等的發(fā)明與應(yīng)用可解決上述難題。這些不斷完善的新生物合成工具正隨著具有重要藥用價值的生物次生代謝物的生產(chǎn)成本與資源協(xié)調(diào)等相關(guān)問題的解決，逐步創(chuàng)造著更加可觀的未來。

參與生物合成的工具酶

天然產(chǎn)物的生物合成過程離不開一個關(guān)鍵物質(zhì)——酶。對于我們?nèi)祟愖陨韥碚f，情緒波動、思維跳動、身體運動都離不開各種酶類。酶在各種生物體內(nèi)含量雖微小但卻起著舉足輕重的作用。天然產(chǎn)物的合成更離不開它們。參與天然產(chǎn)物生物合成的這些酶類被稱為工具酶。顧名思義，就是合成天然產(chǎn)物的“工具”。主要包含途徑酶和后修飾酶[12]。

途徑酶

途徑酶，即合成天然產(chǎn)物相關(guān)生化反應(yīng)途徑過程中的酶類，是由底物生成某種產(chǎn)物的先決條件。

氧化還原酶（催化氧化還原反應(yīng)的一類酶）就是一大類關(guān)鍵的途徑酶，其在生物體的氧化產(chǎn)能、解毒以及某些生理物質(zhì)形成等過程中起重要的作用，屬于第一大類酶，在生物界中存在且數(shù)量龐大。而在催化作用中，一般都需要輔酶或輔基參加，其通?？煞譃?個亞類：①脫氫酶，催化從底物上脫氫反應(yīng)的酶；②氧化酶，催化底物脫氫，并把氫交給氧氣生成過氧化氫或水的酶；③過氧化物酶，催化以過氧化氫或其他過氧化物為氧化劑反應(yīng)的酶；④氧合酶，催化氧原子直接參與有機分子反應(yīng)的酶。

目前，天然產(chǎn)物的生物合成中主要的困難是氧化還原酶結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有輔酶和底物等多個結(jié)合位點，且往往由多個亞基組成，因此在反應(yīng)過程中容易失活。而提高氧化還原酶的穩(wěn)定性主要有酶分子結(jié)構(gòu)改造和固定化兩種途徑[13]。氧化還原酶的固定化需要在材料選取和固定化方法選擇方面，例如酶固定化載體的化學(xué)組成、界面性質(zhì)以及微觀結(jié)構(gòu)等對酶的穩(wěn)定性、電子傳遞、底物和產(chǎn)物擴散過程的影響等多做考慮。目前廣泛使用的載體材料分為高分子材料、碳材料、聚合物—無機復(fù)合材料、金屬—有機框架材料等。這些材料具有穩(wěn)定性好、機械強度高、化學(xué)惰性、孔隙率高、比表面積大等優(yōu)勢，并可通過表面可控修飾獲得生物相容性好的固定化載體。

另外一大類途徑酶即限速酶。在天然產(chǎn)物的生物合成中，要想控制產(chǎn)率和產(chǎn)速，應(yīng)從反應(yīng)途徑入手。而調(diào)節(jié)反應(yīng)途徑中對酶的調(diào)控在很大程度上是對限速酶的調(diào)控。如果把人體內(nèi)的生化反應(yīng)過程想象成道路上行駛的汽車，那么限速酶就如同限速攝像頭，超速行駛的車輛遇到攝像頭便會放緩速度，通過這樣的方式達到提高安全系數(shù)的目的。人體的基礎(chǔ)代謝，如糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)中都有限速步驟，限速酶能夠影響反應(yīng)的速度及進行與否。

后修飾酶

后修飾酶可以對天然產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)修飾，豐富天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性，改善天然產(chǎn)物的性質(zhì)，增加篩選獲得活性天然產(chǎn)物的概率。簡單來說，后修飾酶就是對途徑酶催化后的產(chǎn)物進一步優(yōu)化，使其具有更強的效能。后修飾酶包括甲基轉(zhuǎn)移酶、?；D(zhuǎn)移酶、脂肪酶、氧化酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶等。目前非常熱門的表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域研究的就是環(huán)境因素導(dǎo)致生物的基因表達不同的問題?；虮磉_的不同與基因修飾密不可分，當(dāng)然也就與后修飾酶密不可分了。如果我們把途徑酶比作一個熟練的工匠，那么后修飾酶就是精巧的刻刀，兩種酶之間只有熟練地配合，才能實現(xiàn)天然產(chǎn)物的生物合成。

合成生物學(xué)技術(shù)的新發(fā)展

構(gòu)建大腸桿菌工程菌

研究者通常可參考生物合成天然產(chǎn)物的相關(guān)研究，尋找到天然產(chǎn)物合成中所需要的酶，并通過設(shè)計特異性引物，擴增獲得其DNA全長片段，然后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對其進行酶切，再用DNA連接酶將其插入載體獲得重組質(zhì)粒。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并在對應(yīng)的抗性平板上培養(yǎng)，利用各基因特異性引物進行菌落PCR，篩選驗證后構(gòu)建大腸桿菌工程菌。

姜黃素是從姜科、天南星科等植物的根莖中提取的一種二酮類化合物，具有良好的抗炎和抗癌特性。在利用合成生物學(xué)方法合成姜黃素的研究中，研究者利用姜黃素生物合成關(guān)鍵酶β-酮酰輔酶A合酶基因和姜黃素合酶基因構(gòu)建非天然融合基因，并將其與4-香豆酰輔酶A連接酶 和乙酰輔酶A羧化酶基因共同引入大腸桿菌中，構(gòu)建合成姜黃素的大腸桿菌工程菌，進而實現(xiàn)姜黃素的大量生產(chǎn)。

CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)與核糖體工程

目前，在生物合成過程中，工程菌經(jīng)過多輪的遺傳改造和誘變育種會產(chǎn)生新的基因，以至于難以通過抗性基因?qū)ζ溥M行遺傳操作。而CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)不僅可以對靶向基因進行特定修飾，包括敲除、修復(fù)和替換等，同時還具有成本低、操作簡便、效率高、功能多樣等優(yōu)點，因此近年來被廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)、代謝工程和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

核糖體工程技術(shù)可對核糖體、RNA 聚合酶及轉(zhuǎn)錄因子進行修飾改造，進而提高次級代謝產(chǎn)物的生物合成。該方法常用靶向核糖體或RNA 聚合酶的抗生素來篩選抗性突變株。當(dāng)?shù)玫降墓こ叹l(fā)酵水平無法達到工業(yè)水平時，可以通過核糖體工程技術(shù)來篩選出高產(chǎn)菌株，進而提高產(chǎn)量。

可利霉素是我國首次利用合成生物學(xué)技術(shù)研發(fā)的具有中國自主知識產(chǎn)權(quán)的一類新藥。合成可利霉素的工程菌因多次基因改造已獲得了兩種抗性基因，難以再進行基因改造。然而CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)可以通過向?qū)NA指導(dǎo)Cas9蛋白對靶基因進行剪切，然后完成對DNA的編輯，之后再通過核糖體工程技術(shù)篩選得到可利霉素的高產(chǎn)工程菌株。

截至目前，利用合成生物學(xué)方法合成天然產(chǎn)物已取得了一定的成果。然而在生物合成的過程中，工程菌的重構(gòu)隨著基因簇的增大而變得愈發(fā)復(fù)雜，最后生成的產(chǎn)物也難以達到標(biāo)準(zhǔn)。因此，設(shè)計更好的基因編輯系統(tǒng)和構(gòu)建更加適合的底盤細胞是未來發(fā)展的一個方向。

原始宿主的調(diào)控

對原始宿主的調(diào)控主要通過調(diào)控子（存在于基因旁側(cè)序列中，能影響基因表達的序列），以及改變代謝途徑中的加工酶或轉(zhuǎn)運酶等來增加天然產(chǎn)物的產(chǎn)量。

研究者在有關(guān)糖多孢紅霉菌TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子SACE7301調(diào)控紅霉素產(chǎn)量的研究中，通過敲除SACE7301基因構(gòu)建了ΔSACE7301突變體。在之后的對比實驗中發(fā)現(xiàn)，糖多孢紅霉菌中TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子SACE7301可正向增加紅霉素的產(chǎn)量，但對糖多孢紅霉菌的形態(tài)分化影響不大。研究者進一步通過凝膠阻滯實驗發(fā)現(xiàn)SACE7301蛋白可在細菌體外與eryAI啟動子結(jié)合，進而推測SACE7301可能直接調(diào)控紅霉素的合成。

此外，在調(diào)控萜類合成途徑的基因表達，進而提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量時，研究人員將β-胡蘿卜素合成途徑基因?qū)氪竽c桿菌，并用多個調(diào)控元件對大腸桿菌甲基赤蘚糖醇磷酸途徑的7個基因和ispA基因進行調(diào)控。在此基礎(chǔ)上，進一步對dxr、ispG和ispH基因進行調(diào)控，同時對dxs和idi基因進行組合調(diào)控，將β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了8倍。

基因表達的調(diào)控在天然產(chǎn)物合成方面獲得了很大的突破。目前，原始宿主內(nèi)的調(diào)控主要集中在正向調(diào)控元件或生物傳感器的引入、負調(diào)控因子的刪除或沉默，從而實現(xiàn)未知基因簇的激活和過表達。因此，建立可通用的生物傳感器、發(fā)明快速準(zhǔn)確的基因編輯手段是基于原始宿主調(diào)控天然產(chǎn)物合成產(chǎn)量的重要策略。

合成生物學(xué)對天然產(chǎn)物的實際生產(chǎn)將會產(chǎn)生顛覆式的影響。自合成生物學(xué)誕生至今的20多年來，其發(fā)展成果只是冰山一角，還有許多問題等待科研人員繼續(xù)挖掘和研究。合成生物學(xué)在化合物生產(chǎn)、組織醫(yī)療、食物生產(chǎn)、甚至是寵物娛樂行業(yè)都有理論上的應(yīng)用，這是一門前沿的、將科幻變?yōu)楝F(xiàn)實的、應(yīng)用型交叉學(xué)科，同時它帶來的相關(guān)社會倫理問題也需要進行深入討論。

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關(guān)鍵詞：合成生物學(xué) 天然產(chǎn)物 工具酶 大腸桿菌 ■