三個(gè)中國(guó)無脈絡(luò)膜癥家系的臨床與遺傳分析*

李鵬程， 秦亞運(yùn)， 何曉婕， 唐朝暉， 劉 飛， 劉木根△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院眼科，武漢 430022 2華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430074 3華中科技大學(xué)醫(yī)院，武漢430074

無脈絡(luò)膜癥(choroideremia，CHM；OMIM：#303100)是一種少見的X連鎖的遺傳性視網(wǎng)膜疾病，其患病率約為1∶50000～1∶100000，以感光細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)和脈絡(luò)膜的進(jìn)行性退化為主要特征[1-3]。CHM基因(OMIM：*300390)是無脈絡(luò)膜癥的唯一致病基因，編碼REP-1蛋白[4]。REP-1蛋白對(duì)于Rab蛋白的異戊二烯化修飾和正確定位是必需的，其功能障礙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞囊泡運(yùn)輸異常和蛋白質(zhì)錯(cuò)誤定位[5-6]。CHM的主要癥狀為進(jìn)行性加重的夜盲、漸進(jìn)性視野縮小，晚期逐漸出現(xiàn)中心視力下降，與視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)的臨床癥狀高度重疊，極易被誤診為RP[7]。因此，遺傳分析對(duì)于CHM的精準(zhǔn)診斷十分必要。本文對(duì)3個(gè)中國(guó)無脈絡(luò)膜癥家系進(jìn)行了臨床和遺傳學(xué)研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 參與者與臨床檢查

本研究招募了2016～2021年在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院和華中科技大學(xué)醫(yī)院就診的3個(gè)中國(guó)漢族非近親家系。納入標(biāo)準(zhǔn)：①滿足無脈絡(luò)膜癥的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，有夜盲病史，特征性眼底表現(xiàn)及家族史符合X連鎖遺傳特征；②通過分子遺傳學(xué)方法明確CHM基因突變。排除有其他眼部疾病及不能配合完成眼科檢查者[8]。所有參與者或其法定監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書。本研究經(jīng)過華中科技大學(xué)倫理委員會(huì)的審查與批準(zhǔn)。所有參與者在協(xié)和醫(yī)院進(jìn)行了全面眼科檢查，包括最佳矯正視力測(cè)量(best corrected visual acuity，BCVA)、裂隙燈觀察、眼底彩照和光學(xué)相干斷層掃描(spectral domain optical coherence tomography，SD-OCT)等。采集參與者的外周血標(biāo)本2 mL，采用試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit)提取基因組DNA，并測(cè)定濃度和純度[9-10]。

1.2 全外顯子組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

全外顯子組測(cè)序和生物信息學(xué)分析由藥明康德公司(WuXi AppTec)完成。外顯子捕獲和建庫(kù)測(cè)序采用SureSelect_Human_Exon_V5試劑盒(Agilent Technologies，Santa Clara，USA)和HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)(Illumina，San Diego，USA)。根據(jù)生信分析結(jié)果和美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南，挑選候選基因和突變進(jìn)行致病性評(píng)級(jí)[11]。家系3患者就診時(shí)攜帶外院進(jìn)行的二代測(cè)序報(bào)告。

1.3 基因突變的驗(yàn)證

首先，通過Sanger測(cè)序確認(rèn)全外顯子組測(cè)序得到的候選突變是否存在。其次，采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)對(duì)家系內(nèi)成員進(jìn)行共分離驗(yàn)證，并驗(yàn)證候選突變是否存在于200例正常人對(duì)照中。CHM基因的c.186C>G突變會(huì)破壞SexAⅠ的酶切位點(diǎn)。通過一對(duì)引物(F：5′-TTGGGATCTGAGAGGCCTACT-3′，R：5′-CGCACCCGAGCTC-TATTTATAT-3′)擴(kuò)增包含突變位點(diǎn)的CHM基因片段，再用限制性內(nèi)切酶SexAⅠ(New England BioLabs)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切(37℃，4 h)，DNA凝膠電泳觀察條帶大小變化。

2 結(jié)果

2.1 家系圖與一般特征

本研究招募的3個(gè)家系的成員關(guān)系見圖1。家系1納入3名男性患者?；颊撷?1，10歲左右出現(xiàn)夜盲癥狀，約20歲時(shí)在外院接受抗青光眼手術(shù)治療，來院就診時(shí)有嚴(yán)重白內(nèi)障且拒絕手術(shù)治療，無法進(jìn)行眼底檢查，故本研究排除該患者。家系1中Ⅱ-3、Ⅱ-5的父母均無夜盲或視力下降癥狀，而Ⅲ-4的父母也表現(xiàn)正常，提示遺傳方式可能為X連鎖隱性遺傳(圖1A)。家系2、3各納入1名第3代男性患者；而家系2、3的患者Ⅱ-1均有夜盲癥狀和視力障礙，初步判定為患者，但在外院就診，未進(jìn)行詳細(xì)的眼科檢查，故未納入本研究。家系2、3遺傳方式與家系1類似(圖1B、1C)。三家系中均無近親結(jié)婚史。納入的5例患者初診年齡22～49歲，初診中位數(shù)年齡39歲。

A:家系1;B:家系2;C:家系3;'□：正常男性；○：正常女性；■：男性患者；⊙：女性攜帶者；↑：先證者圖1 X連鎖視網(wǎng)膜變性家系圖譜Fig.1 Maps of X-linked retinal degeneration families

2.2 患者臨床表現(xiàn)

2.2.1 視力 所有5例患者均從10歲左右開始出現(xiàn)夜盲，部分患者逐漸出現(xiàn)中心視力下降。5例10眼均接受了BCVA檢查?；颊連CVA介于0.02～0.60之間(小數(shù)視力)，其中80%患眼視力≥0.5，明顯好于之前關(guān)于國(guó)人報(bào)道中的平均視力0.28[8]。值得注意的是，家系1的Ⅱ-3、Ⅱ-5患者初診時(shí)均存在晶體后極部局限性皮質(zhì)渾濁，未接受手術(shù)治療。家系1的3名患者隨訪5年視力均無明顯變化。家系2的1名患者于2021年復(fù)診，隨訪半年，視力無明顯變化。家系3患者雙眼視力0.6。

2.2.2 眼底改變 家系1先證者Ⅱ-5眼底檢查顯示雙眼視盤邊界清晰，視網(wǎng)膜色素上皮及脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層廣泛萎縮、消失，導(dǎo)致脈絡(luò)膜大血管層和鞏膜暴露，中周部視網(wǎng)膜有骨細(xì)胞樣色素沉積(圖2A)，雙眼黃斑中心凹反光消失?；颊撷?3的左眼黃斑灰白色隆起，右眼與先證者類似；患者Ⅲ-4的眼底情況好于先證者(圖2A)。女性攜帶者Ⅰ-2未見明顯眼底異常(圖略)，Ⅱ-8見廣泛椒鹽狀脫色素改變(圖2A)。

家系2患者眼底所見與上述患者基本一致；雙眼萎縮性改變及色素沉積波及黃斑區(qū)，較家系1患者程度更嚴(yán)重；且其右眼黃斑大片視網(wǎng)膜下白色脈絡(luò)膜新生血管(CNV)性增殖膜(圖2B)。家系3患者眼底見雙眼萎縮性及色素沉積波及黃斑區(qū)，鞏膜暴露更明顯，余與上述患者類似(圖2C)。家系1和家系2的4名患者于2021年復(fù)診，眼底均無明顯變化。

A：家系1中患者Ⅱ-5和Ⅲ-4眼底中周部可見暴露的大血管和鞏膜以及片狀色素沉積，攜帶者Ⅱ-8周邊視網(wǎng)膜可見大量的椒鹽狀脫色素改變；B：家系2先證者Ⅲ-2眼底可見嚴(yán)重的視網(wǎng)膜色素上皮和脈絡(luò)膜萎縮、大量片狀色素沉積以及右眼黃斑區(qū)視網(wǎng)膜下脈絡(luò)膜新生血管性增殖膜；C：家系3先證者Ⅲ-2眼底可見嚴(yán)重的視網(wǎng)膜色素上皮和脈絡(luò)膜萎縮，色素沉積及鞏膜暴露；OD：右眼；OS：左眼圖2 彩色眼底照片F(xiàn)ig.2 Color fundus photographs

2.2.3 SD-OCT下的形態(tài)改變 家系1先證者Ⅱ-5的SD-OCT結(jié)果顯示右眼黃斑保留相對(duì)完整的視網(wǎng)膜層次和結(jié)構(gòu)，但外叢狀層與外核層間出現(xiàn)微小的黃斑囊樣病變(cystoid macular lesion，CM)及外層視網(wǎng)膜管狀結(jié)構(gòu)(outer retinal tubulation，ORT)；外核層在黃斑區(qū)保留的情況相對(duì)好于周邊區(qū)域；黃斑中心凹以外的區(qū)域可以觀察到突然丟失的外層視網(wǎng)膜以及脈絡(luò)膜顯著變薄和對(duì)應(yīng)處?kù)柲し瓷湫盘?hào)的增強(qiáng)(圖3A)?；颊撷?3右眼中心視網(wǎng)膜厚度約為295 μm，左眼可見嚴(yán)重的大面積橢圓形全層視網(wǎng)膜囊樣病變(橫徑約12 mm，豎徑約6 mm，中心視網(wǎng)膜厚度約1000 μm)(圖3B)?；颊撷?4的SD-OCT表現(xiàn)與先證者右眼類似。先證者母親Ⅰ-2和妹妹Ⅱ-8雙眼黃斑結(jié)構(gòu)正常(圖略)。

A：家系1先證者Ⅱ-5右眼黃斑區(qū)SD-OCT掃描圖，黃斑區(qū)見囊樣改變(白色箭頭)，中心凹外見外層視網(wǎng)膜管狀結(jié)構(gòu)(紅色箭頭)，黃斑中心凹以外可以觀察到突然丟失的外層視網(wǎng)膜以及脈絡(luò)膜顯著變薄和對(duì)應(yīng)處?kù)柲し瓷湫盘?hào)的增強(qiáng)(黃色箭頭)；B：家系1患者Ⅱ-3左眼黃斑區(qū)SD-OCT掃描圖，左眼出現(xiàn)大面積波及全層視網(wǎng)膜的囊樣病變；C：家系2先證者Ⅲ-2雙眼SD-OCT圖，右眼見視網(wǎng)膜下CNV性高反射團(tuán)；OD：右眼；OS：左眼圖3 患者的SD-OCT表現(xiàn)Fig.3 SD-OCT presentation of the patients

家系2先證者Ⅲ-2的SD-OCT結(jié)果顯示右眼黃斑中心凹區(qū)域存在明顯視網(wǎng)膜下CNV性增殖膜，左眼黃斑結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，雙眼萎縮性改變與家系1患者改變類似(圖3C)。家系3患者雙眼見萎縮性改變與上述患者類似(圖略)。

所有10只眼，8只(80%)可見不同程度黃斑囊樣病變，其中7眼為微小病變。7眼(70%)可見ORT改變，且大部分位于黃斑中心凹以外伴有RPE萎縮的區(qū)域?；颊吲R床資料匯總見表1。

表1 患者臨床資料Table 1 The clinical data of patients

2.3 致病基因和突變鑒定

3個(gè)家系均不存在近親婚史，且都存在父母視力正常而子女發(fā)病的情況?；颊呔鶠槟行?，而其女性同胞(姐妹)均不發(fā)病。結(jié)合家系圖和患者的臨床表現(xiàn)，我們對(duì)3個(gè)家系的初步診斷為X連鎖隱性遺傳的視網(wǎng)膜色素變性或無脈絡(luò)膜癥。

對(duì)于家系1，在排除X連鎖RP致病基因RPGR和RP2后，我們對(duì)先證者Ⅱ-5進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，共發(fā)現(xiàn)6個(gè)位于X染色體上的候選突變(CHM c.186C>G；AKAP4 c.2191G>C；TSC22D3 c.472C>T；SHROOM2 c.4541A>C；ARMCX6 c.131G>A；ARMCX6 c.333T>A)。經(jīng)過Sanger測(cè)序驗(yàn)證(圖4A)和家系內(nèi)共分離分析(圖4B)，最后確定CHM為該家系致病基因。CHM基因的c.186C>G突變是一個(gè)未見報(bào)道的無義突變，可導(dǎo)致CHM基因第62位酪氨酸密碼子TAC轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子TAG，產(chǎn)生一個(gè)含61 aa的截短蛋白(p.Tyr62*)。家系中有夜盲癥狀者均為男性且攜帶該突變，先證者母親Ⅰ-2和妹妹Ⅱ-8為該突變的攜帶者(圖4B)。

對(duì)于家系2，我們直接對(duì)CHM基因進(jìn)行了Sanger測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)CHM基因的c.189+1G>A突變(圖4C)。該突變是一個(gè)剪接位點(diǎn)突變，曾經(jīng)在一個(gè)西班牙家系中報(bào)道過[12]，可導(dǎo)致3號(hào)外顯子跳躍，產(chǎn)生一個(gè)含44 aa的截短蛋白，具有明確的致病性。

A：家系1先證者Ⅱ-5存在c.186C>G突變(黑色下劃線)；B：CHM基因突變?cè)诩蚁?中的共分離分析，正常人為2個(gè)較小條帶，患者只有1條未切開條帶，攜帶者則為3個(gè)條帶；C：家系2先證者Ⅲ-2存在c.189+1G>A剪接位點(diǎn)突變(紅色箭頭)圖4 CHM基因突變位點(diǎn)驗(yàn)證Fig.4 Verification of CHM gene mutation site

家系3患者就診時(shí)已進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序。通過查閱測(cè)序報(bào)告，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)CHM基因的c.808 C>T突變。該突變?cè)谝粋€(gè)中國(guó)人家系中報(bào)道過[7]，為無義突變，可導(dǎo)致翻譯在第270位密碼子處提前終止，具有明確的致病性。根據(jù)遺傳學(xué)分析結(jié)果3個(gè)家系最終均確診為無脈絡(luò)膜癥。

3 討論

無脈絡(luò)膜癥是一種X染色體連鎖的遺傳性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜退化疾病，主要癥狀包括夜盲、漸進(jìn)性視野收縮、視力下降和畏光。由于視網(wǎng)膜色素上皮層、外層視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜血管層的漸進(jìn)性萎縮，患者眼底暴露出白色鞏膜和深層脈絡(luò)膜血管[13]。由于發(fā)病率低，國(guó)內(nèi)罕有大宗病例研究。韓筱煦等[8]報(bào)道了一項(xiàng)包含10例患者的研究，提示中國(guó)CHM患者的平均視力為0.28，35歲以上患者70%眼的視力低于0.5，且病情進(jìn)展更快。與上述研究不同的是，本研究納入的患者視力大部分大于0.5，即使在有白內(nèi)障存在的情況下也明顯好于此前國(guó)人的報(bào)道，并且3例患者隨防5年視力無明顯惡化。國(guó)外的一些大宗病例報(bào)道，如Heon等[14]基于60例患者的研究發(fā)現(xiàn)，30歲以下患者的視力與正常人比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；50歲以上患者的視力明顯低于0.62(小數(shù)視力)。Freund等[15]基于128例患者的研究發(fā)現(xiàn)，40歲以下患者視力基本正常。本研究與國(guó)外的這些大宗病例報(bào)道結(jié)論較為一致，而與國(guó)人的報(bào)道有所不同。但由于本研究樣本量過小，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行跟蹤研究。

黃斑囊樣病變是CHM常見的SD-OCT改變。本研究中CHM患者黃斑囊樣病變的發(fā)生率為80%，大部分患眼該改變僅限于外層視網(wǎng)膜且程度較輕，僅1眼可見囊樣改變波及節(jié)細(xì)胞層。此外，家系1患者中有1眼黃斑區(qū)存在大面積的嚴(yán)重囊樣病變，是導(dǎo)致其視力低下的重要原因。這一現(xiàn)象此前在中國(guó)CHM患者中未見詳細(xì)報(bào)道[7-8]，但我們觀察到的發(fā)生率與國(guó)外報(bào)道相近。如，Murro等[16]的一項(xiàng)包括42例患者的回顧性研究，發(fā)現(xiàn)38%的患者(34.7%患眼)有此改變。Genead等[17]的研究報(bào)道了一組16例患者，發(fā)現(xiàn)70%的患眼有不同程度的黃斑囊樣病變。這一現(xiàn)象之前也在視網(wǎng)膜色素變性等遺傳性視網(wǎng)膜變性類疾病中被報(bào)道，其具體發(fā)病機(jī)制還不明確，可能與血-視網(wǎng)膜屏障功能異常，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的功能障礙等有關(guān)[18]。由于這一現(xiàn)象發(fā)生率很高，對(duì)患者進(jìn)行定期復(fù)查一旦發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜厚度增加，可考慮給予碳酸酐酶抑制劑治療[18]，有可能阻止患者視力進(jìn)一步下降。

ORT指位于視網(wǎng)膜外層的、環(huán)以高反射信號(hào)邊緣的、圓形或卵圓形低反射信號(hào)空腔。本研究納入的5名患者10眼ORT的發(fā)生率為70%，其部位多位于黃斑中心凹以外伴有視網(wǎng)膜色素上皮萎縮的區(qū)域，與之前關(guān)于國(guó)人的研究結(jié)果類似[8]。Murro等[16]也曾在15/18(83.3%)患者中觀察到此現(xiàn)象。ORT是Bietti結(jié)晶樣視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜色素變性等變性類疾病晚期的標(biāo)志[19-20]，通常被認(rèn)為是變性的光感受器在鄰近視網(wǎng)膜色素上皮和膠質(zhì)細(xì)胞的影響下發(fā)生的重排[20]。但是這一改變與患者視力、疾病進(jìn)展等方面的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

本研究中家系2先證者右眼黃斑區(qū)視網(wǎng)膜色素上皮與脈絡(luò)膜之間存在高反射團(tuán)，結(jié)合病史考慮為繼發(fā)脈絡(luò)膜新生血管，是此眼視力低下的主要原因。有文獻(xiàn)報(bào)道1例CHM患者發(fā)生CNV引起嚴(yán)重的視力下降，但是半年后發(fā)生自發(fā)消退，視力恢復(fù)到0.8[21]。也有報(bào)道，抗VEGF藥物貝伐單抗可以有效治療繼發(fā)性CNV[22]。然而，本例患者就診時(shí)CNV已經(jīng)呈視網(wǎng)膜下疤痕樣改變，無黃斑區(qū)出血或水腫等活動(dòng)性病變，失去治療價(jià)值。CNV也見于其他多種視網(wǎng)膜變性類疾病[21]，是視力嚴(yán)重下降的重要原因。定期復(fù)查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療這類并發(fā)癥顯得非常重要。

CHM是目前已知的X連鎖隱性遺傳無脈絡(luò)膜癥的唯一致病基因[13]，目前已有300多個(gè)CHM基因突變被報(bào)道，包括錯(cuò)義、無義、剪接等突變類型(Human Gene Mutation Database，http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，其中以無義突變出現(xiàn)的頻率最高。本研究中發(fā)現(xiàn)的CHM基因新突變(c.186C>G，p.Tyr62*)屬于無義突變，但由于十分接近剪接位點(diǎn)，也可能引起pre-mRNA剪接的改變[23]，突變導(dǎo)致REP-1蛋白的翻譯在非常靠前的位置終止，無法產(chǎn)生有功能的蛋白。本研究家系2發(fā)現(xiàn)的剪接突變(c.189+1G>A，)曾見于報(bào)道，但在中國(guó)人群中是首次發(fā)現(xiàn)。家系3的突變?yōu)闊o義突變(c.808C>T)，在中國(guó)人群已有報(bào)道。3個(gè)突變均會(huì)導(dǎo)致CHM蛋白的截短，從而無法行使正常功能，導(dǎo)致未修飾的Rab蛋白錯(cuò)誤累積并影響細(xì)胞蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終引起感光細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮和脈絡(luò)膜的進(jìn)行性變性[6]。根據(jù)ACMG致病性評(píng)級(jí)指南，這3個(gè)突變均可確定為致病性突變。

綜上所述，本文報(bào)道了3個(gè)中國(guó)無脈絡(luò)膜癥家系的臨床特征和遺傳病因。該研究拓寬了CHM基因的突變譜，提示黃斑萎縮性改變、嚴(yán)重的黃斑囊樣病變或脈絡(luò)膜新生血管是無脈絡(luò)膜癥患者中心視力下降的常見原因,為今后的遺傳咨詢和基因治療奠定了基礎(chǔ)。