白頭翁湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制研究進(jìn)展*

李云從， 劉星星

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430022

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是慢性非特異性的炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)之一，病變主要以黏膜的潰瘍、糜爛為主，多累及直腸、乙狀結(jié)腸，并可向近端結(jié)腸發(fā)展，甚至波及整個(gè)結(jié)腸，病程遷延，反復(fù)發(fā)作，難以痊愈。UC的病因與發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前普遍認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制是由環(huán)境因素和腸道菌群共同作用，激活遺傳易感個(gè)體腸道黏膜的免疫應(yīng)答，引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，使腸黏膜中的抗炎和促炎介質(zhì)失衡，導(dǎo)致腸黏膜的病理改變[1]。

UC在中醫(yī)理論中，可歸為“久痢、下利、臟毒”的范疇。本病在活動(dòng)期可表現(xiàn)為膿血便、里急后重、舌暗紅苔黃膩、脈滑數(shù)等。臨床辨證UC活動(dòng)期以濕熱蘊(yùn)結(jié)大腸、血熱妄行為主。白頭翁湯是臨床常用的中醫(yī)傳統(tǒng)方劑，具有清熱解毒和涼血止痢的功效。大量臨床研究表明，白頭翁湯在治療UC方面具有良好的療效。白頭翁湯出自《傷寒論》，由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮等組成，有清熱解毒止痢的作用。《傷寒論》曰：“熱利、下寒者，白頭翁湯主之”、“下利，欲飲水者，白頭翁湯主之”，與UC活動(dòng)期的癥狀相符，故對(duì)于此類病癥有很好的治療作用。白頭翁為毛茛科植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦，性寒，歸胃、大腸經(jīng)。本文就白頭翁湯及其主藥白頭翁相關(guān)提取物治療UC的作用機(jī)制研究作一綜述。

1 對(duì)腸道免疫的調(diào)節(jié)

1.1 調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞平衡

T淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用，分為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell，Tc)、抑制性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)和輔助性T細(xì)胞(help T cell，Th)，其中Th17與Treg細(xì)胞都由CD4+T細(xì)胞分化而來。目前的研究表明，這兩種細(xì)胞的失衡可導(dǎo)致腸道免疫紊亂和腸黏膜損傷，是IBD發(fā)病的重要原因之一[2-4]。在這個(gè)過程中，Th17細(xì)胞過度活化，Treg細(xì)胞活動(dòng)不足，從而導(dǎo)致Th17/Treg比值升高，Th17細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子放大炎癥反應(yīng)，而Treg細(xì)胞無法約束過度的炎癥反應(yīng)?？娭緜5]用白頭翁湯水煎液(分為低劑量組和高劑量組)和柳氮磺吡啶(salicylazosulfapyridine，SASP)分別治療葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)造模的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠，在第10天進(jìn)行檢測(cè)，治療組小鼠腸系膜淋巴結(jié)中Th17與模型組相比顯著減少，而白頭翁高劑量組腸系膜淋巴結(jié)中的Treg細(xì)胞占比顯著高于模型組，表明白頭翁湯可以調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡進(jìn)而調(diào)節(jié)促炎/抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平，幫助恢復(fù)腸道內(nèi)免疫環(huán)境的平衡，減輕炎癥反應(yīng)。譚朝暉等[6]用白頭翁湯(口服+保留灌腸治療)和美沙拉嗪分別治療潰瘍性結(jié)腸炎患者4周，結(jié)果顯示患者外周血中Th17/Treg比例較治療前明顯降低(P<0.01)，且優(yōu)于西藥組(P<0.05)，結(jié)直腸組織中RORγt蛋白與治療前相比表達(dá)減少，F(xiàn)oxp3表達(dá)則增加(均P<0.01)，該研究認(rèn)為白頭翁湯可能是通過下調(diào)RORγt轉(zhuǎn)錄因子抑制Th17細(xì)胞分化，從而減少相關(guān)促炎因子的釋放，同時(shí)上調(diào)Foxp3的表達(dá)，促進(jìn)幼稚T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制。

1.2 抑制EGFR/PI3K/Akt/HIF-1α通路的激活

PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，對(duì)細(xì)胞分化、自噬、增殖與凋亡、炎癥反應(yīng)與免疫方面具有重要調(diào)控作用。在DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎中，結(jié)腸黏膜的AKT表達(dá)顯著上調(diào)，并介導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)生和進(jìn)展[7-8]；同時(shí)活化的AKT可激活NF-κB，提高TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，加重炎癥反應(yīng)和組織損傷；此外，在因腸道中免疫細(xì)胞聚集引起的缺氧環(huán)境中，PI3K/Akt通路可活化HIF-1α，促進(jìn)IL-1β與COX-2的合成，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，白頭翁湯可能作用于EGFR這一靶點(diǎn)，從而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路[9-11]?？娭緜サ萚11]的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，他們使用白頭翁湯(低劑量組和高劑量組)和SASP分別治療DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠，在第10天檢測(cè)結(jié)腸組織的EGFR、HIF-1α表達(dá)與PI3K、Akt磷酸化水平，證明白頭翁湯可通過對(duì)EGFR/PI3K/Akt/HIF-1α通路的抑制作用減少潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)。也有研究表明，IBD存在細(xì)胞凋亡失調(diào)，包括腸上皮細(xì)胞過度凋亡和固有層免疫細(xì)胞的凋亡抵抗[12-13]，這可能是由于PI3K/Akt通路的過度活化引起的，白頭翁湯對(duì)PI3K/Akt通路的抑制也可抑制這一現(xiàn)象，從而達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)的效果。

1.3 抑制NF-κB的活性

核因子κB(NF-κB)是一種多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，廣泛參與炎癥免疫細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等多種生理病理過程的基因調(diào)控。通過對(duì)細(xì)胞因子、粘附分子、趨化因子及其他炎性遞質(zhì)的調(diào)控，NF-κB在IBD炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。活化的NF-κB促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等的表達(dá)，因此抑制NF-κB的活性是控制UC的重要機(jī)制之一[14]。

1.3.1 抑制STAT3/NF-κB通路的激活 STAT3是STAT家族的重要成員之一，主要在調(diào)節(jié)炎癥、免疫和細(xì)胞生長(zhǎng)方面發(fā)揮重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，它與NF-κB之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)十分復(fù)雜，存在串?dāng)_現(xiàn)象。NF-κB的激活可觸發(fā)STAT3關(guān)鍵上游分子IL-6的表達(dá)[15]，而有研究發(fā)現(xiàn)抑制STAT3可能增加TNF-α水平，它是NF-κB活化的主要來源。故欲產(chǎn)生顯著的治療效果需要考慮破壞二者之間的串?dāng)_。因此，共同抑制NF-κB和STAT3是更好的策略。Huangfu等[16]通過DSS體外誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞與DSS小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，并采用白頭翁湯干預(yù)，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明白頭翁湯在治療DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎中，能夠降低DSS引起的STAT3和NF-κB磷酸化程度增高，以及NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)量升高，證實(shí)了白頭翁湯通過抑制IL-6/STAT3通路來抑制NF-κB激活的作用機(jī)制。

1.3.2 抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路 Toll樣受體作為進(jìn)化上高度保守的非特異性免疫受體家族，在先天免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，TLR4是免疫和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游的核心因子[17]。在潰瘍性結(jié)腸炎中，活化的TLR4可激活NF-κB，上調(diào)多種炎癥因子表達(dá)量，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜的炎癥損傷。鐘宇等[18]用白頭翁湯治療DNCB加醋酸/乙醇復(fù)合法造模的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠，于造模成功后給藥7 d，檢測(cè)結(jié)腸組織中NF-κB和TLR4的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，使用白頭翁湯治療的大鼠與模型組相比，TLR4與NF-κB表達(dá)的異常增加被顯著抑制，炎癥反應(yīng)減輕。田歌等[19]在探究白頭翁湯正丁醇提取物預(yù)保護(hù)結(jié)腸上皮細(xì)胞因白假絲酵母菌異常定植引起炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)白頭翁湯正丁醇提取物提前干預(yù)的Caco-2細(xì)胞在接觸白假絲酵母菌滅活孢子后，與對(duì)照組相比TLR4表達(dá)水平顯著下降，這一結(jié)果也間接證明白頭翁湯中的相關(guān)成分可以降低結(jié)腸組織細(xì)胞因炎癥刺激引起的TLR4水平升高，從而達(dá)到抑制下游NF-κB激活，避免放大炎癥反應(yīng)的作用。

2 白頭翁湯的抗腫瘤作用

潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌(ulcerative colitis associated cancer，UCAC)是UC病情發(fā)展惡化的結(jié)果，也是UC患者死亡的重要原因。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，白頭翁湯中的白頭翁皂苷類成分具有一定的抗腫瘤作用[20-21]，其在UC治療中，也可起到抑制腫瘤發(fā)生相關(guān)通路的作用，減少UC的受損結(jié)腸組織惡變的可能性，降低UCAC的發(fā)病率，從而改善患者的預(yù)后和生存預(yù)期。

2.1 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路

UCAC的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，其中β-catenin的磷酸化異常轉(zhuǎn)位在UCAC的發(fā)生中占有重要地位。多項(xiàng)研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的過度激活在β-catenin的磷酸化中具有調(diào)節(jié)作用[22-23]，此外，IBD中PI3K/Akt/mTOR通路的激活還會(huì)使PAK1過表達(dá)，從而加重IBD，并與結(jié)腸炎相關(guān)癌癥(CAC)密切相關(guān)[24]。因此，防止PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的過度激活是UC治療和預(yù)防UCAC中值得考慮的策略。Son等[25]制備并使用白頭翁皂苷D(SB365)體外抑制HT-29和LoVo兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)，測(cè)得其IC50在HT-29和LoVo中分別為1.9和1.8 μmol/L，與5-FU(兩種細(xì)胞系IC50均>20 μmol/L)相比具有更顯著的抑制作用;對(duì)HT-29細(xì)胞系PI3K/Akt/mTOR通路靶蛋白的免疫熒光顯示，白頭翁皂苷D處理組顯著弱于對(duì)照組，CoCl2誘導(dǎo)的缺氧狀態(tài)下HIF-1α、VEGF的表達(dá)也有顯著降低；Western blot提示，mTOR的下游蛋白p70S6K的磷酸化與對(duì)照組相比也被下調(diào)。由此推測(cè)，白頭翁皂苷D對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制效果與此通路密切相關(guān)，而其通過這一通路在UC治療以及預(yù)防UCAC的發(fā)生中抗腫瘤的效果有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。

2.2 激活cleaved-Caspase-3表達(dá)

cleaved-Caspase-3是Caspase-3切割活化后的狀態(tài)，Caspase-3基因的表達(dá)與細(xì)胞的外源性與內(nèi)源性凋亡兩條途徑均密切相關(guān)。作為凋亡蛋白酶Caspase家族的核心成員，Caspase-3是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的終末剪切酶，為凋亡相關(guān)最重要的分子之一。結(jié)腸癌的發(fā)生過程中，與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞以及結(jié)腸腺瘤相比，結(jié)腸癌的Caspase-3表達(dá)率大幅降低。Caspase-3的表達(dá)抑制或表達(dá)缺失在結(jié)腸癌細(xì)胞的形成過程是重要環(huán)節(jié)[26]。因此，激活Caspase-3的表達(dá)在控制UCAC以及治療UC過程中防止病變組織發(fā)生惡變有重要意義。羅穎穎等[27]使用白頭翁皂苷體外干預(yù)人HT29結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，測(cè)得其IC50為1.44 μg/mL，與5-FU(IC50=5.27 μg/mL)相比具有更好的抗腫瘤效果，用Western blot檢測(cè)cleaved-Caspase-3表達(dá)水平，結(jié)果顯示從5 μg/mL給藥組開始，cleaved-Caspase-3開始表達(dá)，且隨著給藥劑量增加表達(dá)量逐漸增加，證實(shí)白頭翁湯可能通過激活Caspase-3來引起腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的。

2.3 抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。EMT在胚胎和腫瘤生長(zhǎng)中起著至關(guān)重要的作用，有助于將上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)特征的間充質(zhì)細(xì)胞，使細(xì)胞間粘附減少，細(xì)胞極性消失，提升其運(yùn)動(dòng)性和遷移性[28-29]，從而為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供分子基礎(chǔ)。此外，UC患者的活動(dòng)性與非活動(dòng)性組織病變相比，EMT相關(guān)基因更為活躍，表達(dá)產(chǎn)物更為富集，且EMT相關(guān)基因發(fā)生的高度甲基化與更嚴(yán)重的UC臨床表型相關(guān)，且在結(jié)直腸癌中也有發(fā)現(xiàn)，表明相關(guān)基因的甲基化很可能發(fā)生于由潰瘍病變轉(zhuǎn)為腫瘤的過程中，即UC向UCAC轉(zhuǎn)化的過程中[30]。

Zhang等[31]使用TGF-β1誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生EMT，并使用白頭翁五環(huán)三萜皂苷提取物(PPTS)處理誘導(dǎo)后的細(xì)胞以抑制EMT，CCK-8檢測(cè)與流式細(xì)胞術(shù)表明TGF-β1的誘導(dǎo)有利于SW480的增殖，減少凋亡，而PPTS能顯著抑制SW480，并提高凋亡率；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)提示PPTS能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)后SW480的侵襲能力；qRT-PCR測(cè)得TGF-β1處理48 h后，SW480細(xì)胞中MMP-9、CYP2C9、CYP3A、N-鈣粘蛋白和CYP2C19的相對(duì)表達(dá)升高；與單一TGF-β1誘導(dǎo)組相比，所有PPTS濃度組的MMP-9、CYP2C9、CYP3A、N-鈣粘蛋白和CYP2C19表達(dá)量都隨著PPTS濃度的增加而降低。這一研究在分子水平上證明，PPTS對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力及EMT過程具有抑制作用，也表明了白頭翁湯通過對(duì)EMT的抑制，不僅可緩解結(jié)直腸癌以及UCAC的癥狀，也可在UC的治療中抑制UC的活動(dòng)病變，防止活動(dòng)期UC繼續(xù)加重，以及預(yù)防UCAC的發(fā)生。

3 白頭翁湯對(duì)腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)

益生菌及其共生細(xì)菌對(duì)腸道的緊密連接屏障具有積極作用。目前較多研究顯示IBD患者的腸道菌群與健康人相比，有菌群不穩(wěn)定性升高、多樣性降低和菌群功能失調(diào)的特點(diǎn)[32-33]。近年來糞菌移植作為UC治療的熱點(diǎn)，其治療思路正是從調(diào)整腸道微生態(tài)，使菌群功能恢復(fù)正常著手。因此，對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)也是UC治療的一個(gè)重要思路和研究方向。鮑炳州等[34]采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)研究白頭翁湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群的影響。結(jié)果顯示模型組大鼠菌群豐度、多樣性均降低，且厚壁菌門/擬桿菌門比值(F/B，常用于反映腸道菌群的紊亂狀態(tài))顯著升高，而白頭翁湯(低、中、高劑量組)和美沙拉嗪的治療均能下調(diào)F/B值，其中白頭翁湯中劑量組(4.31 g/kg)與其他3組相比，回調(diào)效果最為明顯。這一研究結(jié)果提示白頭翁湯也可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群對(duì)UC起治療作用，一方面對(duì)腸道致病菌生長(zhǎng)起到抑制作用，另一方面，對(duì)不同種類腸道正常菌群的作用存在差異，使其比例向正常狀態(tài)回調(diào)，防止微生態(tài)紊亂環(huán)境下菌群的代謝產(chǎn)物對(duì)腸道產(chǎn)生刺激作用，同時(shí)恢復(fù)正常的益生菌比例也利于腸道緊密連接屏障的修復(fù)[35]。

4 白頭翁湯對(duì)腸道屏障功能的調(diào)節(jié)

腸道黏膜屏障功能障礙是IBD的主要特征之一，黏膜屏障受損會(huì)導(dǎo)致滲出性腹瀉和有害抗原吸收增加兩個(gè)后果。上皮細(xì)胞間的緊密連接是腸道屏障功能的決定因素，IBD中發(fā)生的屏障受損病變中往往可發(fā)現(xiàn)緊密連接的數(shù)量及深度均有減少，而研究表明，促炎細(xì)胞因子的活躍表達(dá)與腸道菌群的紊亂在屏障缺陷的誘導(dǎo)中起到關(guān)鍵作用[36]。由此看來，通過調(diào)控緊密連接關(guān)鍵蛋白的上游表達(dá)，控制促炎細(xì)胞因子以及調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)有助于保護(hù)腸道黏膜屏障功能，改善滲出性腹瀉，減少有害抗原的吸收，從而緩解UC的癥狀，減少并發(fā)癥的發(fā)生。

Wang等[37]使用加味白頭翁湯(白頭翁30 g，黃連5 g，黃柏12 g，秦皮9 g，三七3 g，赤芍12 g，甘草6 g)灌胃治療噁唑酮誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠，并通過ELISA和Western blot測(cè)定對(duì)照組、SASP組、加味白頭翁湯組、PBS組小鼠結(jié)腸組織中IL-5和IL-13，以及緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1和claudin-2的表達(dá)水平。ELISA和Western blot結(jié)果顯示，與SASP組比較，加味白頭翁湯更好地控制了IL-5和IL-13的表達(dá)水平；加味白頭翁湯組與PBS組相比，相關(guān)蛋白的表達(dá)量較低，說明加味白頭翁湯能夠維持結(jié)腸黏膜緊密連接的完整性，由于炎癥刺激等因素遭到的破壞較小，故相關(guān)蛋白表達(dá)量較PBS組低，作用機(jī)制可能為抑制NF-κB的激活以降低IL-13、IL-5等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，以及對(duì)腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)等。

5 結(jié)論與展望

UC的病因和發(fā)病機(jī)制主要與遺傳、機(jī)體免疫功能、環(huán)境與感染密切相關(guān)，腸道菌群也參與其中，最終導(dǎo)致腸道產(chǎn)生發(fā)作與緩解交替的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生結(jié)腸黏膜屏障受損，潰瘍、炎性增生等病理改變。白頭翁湯防治潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制主要包括調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)，維持腸道免疫平衡，防治潰瘍的結(jié)腸組織發(fā)生惡變，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，調(diào)節(jié)腸道屏障功能等方面。這些研究為臨床治療UC以及后續(xù)的深入研究提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，也對(duì)探索中醫(yī)藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的效果及作用機(jī)制有著重要意義。