不同層次穴位埋線調(diào)節(jié)單純性肥胖大鼠外周脂肪代謝的機(jī)制研究*

鄭宇皓，申苗銜，伍先明，莫倩，楊碩

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州貴陽 550001）

單純性肥胖是機(jī)體由于脂肪堆積過多或分布異常且無明顯原發(fā)性疾病引起的一種慢性代謝性疾病，與高血壓、糖尿病、心腦血管疾病的發(fā)病關(guān)系密切，并對(duì)患者的身心健康造成嚴(yán)重影響[1-2]。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)顯示，全球有超過19 億成年人超重，其中超過6 億人患有肥胖癥[3]。

穴位埋線療法是針灸療法的延伸和發(fā)展，其操作過程包含了“穴、針、線”的綜合療法，除有針刺和留針效應(yīng)外，還能延長(zhǎng)刺激時(shí)間。其原理是在體內(nèi)埋置可吸收的蛋白線體，通過線體自身的分解、液化、吸收，達(dá)到長(zhǎng)時(shí)效、強(qiáng)刺激的目的。其臨床應(yīng)用日趨廣泛，尤其是在治療單純性肥胖方面具有潛在優(yōu)勢(shì)[4-7]。

瘦素的發(fā)現(xiàn)是肥胖研究領(lǐng)域的一個(gè)里程碑。瘦素是攝食調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的上游因子，通過降低動(dòng)物食欲、提高能量代謝效率，增加能量消耗，減少脂肪儲(chǔ)存而減輕機(jī)體重量[8]。中樞系統(tǒng)中，瘦素受體（leptin receptor, LEP-R）主要分布在下丘腦；而外周系統(tǒng)也有分布[9]。瘦素介導(dǎo)的中樞機(jī)制主要為瘦素與下丘腦長(zhǎng)型LEP-R 結(jié)合后，通過Janus 蛋白絡(luò)氨酸激酶2（janus kinase 2, JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription,STAT3）途徑抑制食欲，增加能量消耗，調(diào)節(jié)體重[10-11]。細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白3（suppressor of cytokine signaling, SOCS3）由JAK2/STAT3 通路激活，而SOCS3 高表達(dá)又反過來抑制該通路的活性，從而形成瘦素抵抗，導(dǎo)致瘦素不能發(fā)揮調(diào)節(jié)人體食欲與能量代謝的作用，因此SOCS3 是瘦素信號(hào)傳導(dǎo)中的主要抑制因子[12]。以往研究認(rèn)為瘦素僅由下丘腦中樞介導(dǎo)，隨著在外周多種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)LEP-R，瘦素的外周直接調(diào)節(jié)作用逐漸受到廣泛關(guān)注，如瘦素可通過JAK2/STAT3 信號(hào)通路參與促角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合[13]；以及通過血睪屏障作用于JAK2/STAT3 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞代謝并對(duì)雄性生殖功能造成損傷[14]；如脂肪細(xì)胞中的功能性LEP-R 提示瘦素可能具有外周自分泌調(diào)節(jié)功能，能直接調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞代謝，包括抑制脂肪合成、誘導(dǎo)脂肪分解及肥胖形成[15]。

本研究在課題組前期研究[16-17]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討不同層次穴位埋線調(diào)節(jié)單純性肥胖大鼠外周脂肪代謝的機(jī)制，并驗(yàn)證JAK2/STAT3 信號(hào)通路參與瘦素外周直接調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1月齡SD 雄性大鼠60 只，體重（100±20）g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2017-0002；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2021-0005。飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度50%，12 h 晝/夜循環(huán)照明。自由飲食、飲水，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 主要試劑

兔抗大鼠JAK2 單克隆抗體（批號(hào)：ab108596）、兔抗大鼠STAT3 單克隆抗體（批號(hào)ab68153）、兔抗大鼠SOCS3 多克隆抗體（批號(hào)：ab16030）、兔抗大鼠LEP-R 多克隆抗體（批號(hào)：ab5593）（美國(guó)Abcam公司），AG490（批號(hào)：HY-12000/CS-0108，美國(guó)MedChemExpress 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：RR047A，日本TaKaRa 公司），BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：500T，北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的復(fù)制與分組將60 只SD 雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（A 組）10 只、模型組50 只。對(duì)照組予普通飼料喂養(yǎng)，模型組予高脂飼料喂養(yǎng)。28 周后將體重超過對(duì)照組大鼠平均體重20%的作為肥胖模型大鼠[18]。采用隨機(jī)數(shù)字表法將模型復(fù)制成功的大鼠分為空白組（B 組）、脂肪層埋線組（C組）、肌肉層埋線組（D組）、脂肪層埋線+AG490組（E 組）、肌肉層埋線+AG490 組（F 組），每組10 只。本實(shí)驗(yàn)通過貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查（No：2015088）。

1.3.2 取穴取穴參照華興邦等[19]研制的大鼠穴位圖譜：雙側(cè)天樞、水道、脾俞、胃俞、三焦俞、中脘。

1.3.3 治療方法①A、B 組：每周將大鼠固定在自制大鼠固定器上，不予處理。②C、D 組：每周將大鼠固定在自制大鼠固定器上，將3-0 醫(yī)用外科可吸收羊腸線剪至0.5～2.0 mm 的長(zhǎng)度備用。雙手消毒后，戴無菌手套及口罩、帽子，用碘伏消毒相應(yīng)穴位處，持簡(jiǎn)易埋線針將羊腸線埋入大鼠相應(yīng)穴位的脂肪層或肌肉層[20]。每周日上午9：00～12：00埋線治療1 次，4 次為1 療程。埋線期間，各組大鼠均予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。③E、F 組：埋線操作同C、D 組，埋線干預(yù)期間每天腹腔注射AG490 1 mg/kg[21]。

1.3.4 脂肪組織采集及檢測(cè)治療結(jié)束后禁食12 h，次日用10%水合氯醛腹腔麻醉后（0.3 ml/100 g）處死大鼠，剝離大鼠體內(nèi)白色脂肪組織。將脂肪組織分裝至無酶EP 管中，置入-80℃冰箱冷凍保存，進(jìn)行下一步mRNA 和蛋白檢測(cè)，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組脂肪組織JAK2 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

A、B、C、D、E、F 組脂肪組織JAK2 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=367.628 和246.146，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：B、E、F 組脂肪組織JAK2 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于A 組（P＜0.05）；C、D 組JAK2 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于B 組（P＜0.05）；E、F 組與B 組脂肪組織JAK2 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；D、E、F 組JAK2 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于C 組（P＜0.05）；E、F 組JAK2 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于D 組（P＜0.05）。見表1和圖1。

圖1 各組脂肪組織JAK2蛋白的表達(dá)

表1 各組脂肪組織JAK2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，±s）

表1 各組脂肪組織JAK2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，±s）

組別A組B組C組D組E組F組F 值P 值JAK2 mRNA 0.92±0.02 0.80±0.02 1.10±0.01 0.98±0.01 0.81±0.04 0.82±0.02 367.628 0.000 JAK2蛋白1.07±0.04 0.75±0.03 0.92±0.02 0.86±0.02 0.76±0.02 0.74±0.01 246.146 0.000

2.2 各組脂肪組織STAT3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

A、B、C、D、E、F 組脂肪組織STAT3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.114 和139.538，P=0.000 和0.001）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：B、E、F 組脂肪組織STAT3mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于A 組（P＜0.05）；C、D組STAT3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于B 組（P＜0.05）；E、F 組與B 組脂肪組織STAT3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；D、E、F 組STAT3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于C 組（P＜0.05）；E、F 組STAT3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于D 組（P＜0.05）。見表2和圖2。

圖2 各組脂肪組織STAT3蛋白的表達(dá)

表2 各組脂肪組織STAT3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，±s）

表2 各組脂肪組織STAT3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，±s）

組別A組B組C組D組E組F組F 值P 值STAT3 mRNA 1.00±0.21 0.86±0.03 1.12±0.03 0.97±0.02 0.87±0.02 0.87±0.02 13.114 0.000 STAT3蛋白1.14±0.06 0.76±0.02 1.00±0.06 0.93±0.02 0.80±0.02 0.82±0.03 139.538 0.001

2.3 各組脂肪組織SOCS3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

A、B、C、D、E、F 組脂肪組織SOCS3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.883 和68.754，P=0.002 和0.001）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：B、C、D、E、F 組脂肪組織SOCS3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于A 組（P＜0.05）；B、E、F 組脂肪組織SOCS3 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于A 組（P＜0.05）；C、D 組SOCS3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于B 組（P＜0.05）；E、F 組與B 組脂肪組織SOCS3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；D、E、F 組SOCS3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于C 組（P＜0.05）；E、F 組SOCS3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于D 組（P＜0.05）。見表3和圖3。

表3 各組脂肪組織SOCS3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

表3 各組脂肪組織SOCS3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

組別A組B組C組D組E組F組F 值P 值SOCS3 mRNA 0.83±0.07 1.41±0.02 0.98±0.02 1.14±0.05 1.36±0.12 1.40±0.23 45.883 0.002 SOCS3蛋白0.94±0.04 1.34±0.10 1.03±0.03 1.11±0.04 1.31±0.09 1.30±0.04 68.754 0.001

圖3 各組脂肪組織SOCS3蛋白的表達(dá)

2.4 各組脂肪組織LEP-R mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

A、B、C、D、E、F組脂肪組織LEP-R mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=43.842 和39.776，均P=0.001）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：B、E、F 組脂肪組織LEP-R mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于A 組（P＜0.05）；C、D 組脂肪組織LEP-R mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于A 組（P＜0.05）；B、D、E、F 組脂肪組織LEP-R 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于A 組（P＜0.05）；C、D 組LEP-R mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于B 組（P＜0.05）；D、E、F 組LEP-R mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于C 組（P＜0.05）；E、F 組LEP-R mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于D組（P＜0.05）。見表4和圖4。

表4 各組脂肪組織LEP-R mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

表4 各組脂肪組織LEP-R mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

組別A組B組C組D組E組F組F 值P 值LEP-R mRNA 0.93±0.06 0.74±0.07 1.10±0.07 1.00±0.09 0.77±0.07 0.76±0.05 43.842 0.001 LEP-R蛋白0.89±0.04 0.72±0.03 0.85±0.03 0.81±0.03 0.75±0.03 0.79±0.03 39.776 0.001

圖4 各組脂肪組織LEP-R蛋白的表達(dá)

3 討論

肥胖與先天體質(zhì)、飲食、運(yùn)動(dòng)等因素有關(guān)，涉及脾、腎、胃三臟。脾胃運(yùn)化功能障礙，腎氣蒸騰水液無力，就會(huì)導(dǎo)致水谷精微不能輸送到全身，則痰濕膏脂就會(huì)聚集在體內(nèi)，從而形成肥胖。本實(shí)驗(yàn)選取雙側(cè)天樞、水道、脾俞、胃俞、三焦俞、中脘進(jìn)行穴位埋線治療，脾俞為脾之背俞穴，有健脾和胃、利濕升清之功；天樞穴為大腸募穴，有和胃氣，通調(diào)腸胃之功；中脘穴為胃募穴、腑會(huì)，具有良性調(diào)理胃腸道的功能；水道能通調(diào)水道，利尿消腫；胃俞為胃的背俞穴，可理脾和胃；三焦俞為三焦的背俞穴，疏利三焦、化濕行水。諸穴合用，以達(dá)健脾和胃、通調(diào)水道，化痰除濕之功。

本研究中，脂肪層埋線組及肌肉層埋線組JAK2、STAT3、LEP-R mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量相比空白組、肌肉層埋線+AG490 組、脂肪層埋線+AG490 組均明顯升高，并且脂肪層埋線組及肌肉層埋線組SOCS3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白組、肌肉層埋線+AG490 組、脂肪層埋線+AG490 組相比均明顯降低。脂肪層埋線組JAK2、STAT3、LEP-R mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高與SOCS3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低的幅度均大于肌肉層埋線組。

綜上所述，脂肪層及肌肉層穴位埋線可以通過JAK2/STAT3 信號(hào)通路使瘦素直接參與外周脂肪的調(diào)節(jié)，其機(jī)制是通過下調(diào)外周脂肪組織中SOCS3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量，上調(diào)外周脂肪組織中LEP-R、JAK2、STAT3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量，從而使瘦素直接參與外周脂肪細(xì)胞的自分泌代謝，包括抑制脂肪合成、誘導(dǎo)脂肪分解等一系列阻礙肥胖形成的作用，以達(dá)到降低單純性肥胖大鼠體重的目的。通過本實(shí)驗(yàn)研究可知脂肪層穴位埋線組LEP-R、JAK2、STAT3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高與SOCS3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低的幅度均大于肌肉層埋線組，從而進(jìn)一步印證課題組前期研究得出的脂肪層穴位埋線減肥效果優(yōu)于肌肉層埋線。課題組對(duì)不同層次穴位埋線有較深入的研究，而近期有報(bào)道指出穴位埋線在降低腰臀比和體質(zhì)量指數(shù)上，埋線時(shí)間間隔1 周的療效優(yōu)于2 周，且兩者不良反應(yīng)無明顯差異[22]，故課題組接下來可向不同間隔時(shí)間穴位埋線方向進(jìn)行探索。