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    毛竹基因組中熱激蛋白HSP90基因家族的鑒定與分析

    2022-04-28 10:11:08AndreaChen陳思睿
    福建林業(yè)科技 2022年1期
    關(guān)鍵詞:基序毛竹元件

    Andrea Chen(陳思睿)

    (St.Aidan′s Anglican Girls′ School,Brisbane,Queensland 4075)

    毛竹(Phyllostachysedulis)屬禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)多年生常綠單子葉植物,廣泛分布于北緯25°—30°之間400~800 m的丘陵、低山山麓地帶,耐貧瘠、高溫干旱,但不耐寒。與同科農(nóng)作物相比,毛竹具有比較強的抗非生物脅迫能力。一般來講,植物抗逆強弱由自身攜帶的基因來決定。

    植物熱激蛋白(heat shock protein,HSP)是在植物遭遇非生物脅迫時,激活并能大量產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì);是廣泛存在于各種生物體內(nèi)、進化上高度保守的蛋白質(zhì)[1]。根據(jù)分子量大小,熱激蛋白可分為 5 個家族:即sHSP(小分子熱激蛋白)、HSP60、HSP70、HSP90、HSP100[2-4]。HSP90蛋白是一類正常細(xì)胞中不可缺少的蛋白質(zhì),包含3個區(qū)域:含有ATP結(jié)合和水解位點的N末端,中部區(qū)域和包含二聚化作用區(qū)域的C末端結(jié)構(gòu)域,其中ATP酶活性是HSP90蛋白發(fā)揮生物功能所必需的[5]。HSP90蛋白參與調(diào)控多種蛋白的調(diào)控和維持蛋白正常構(gòu)型,并參與細(xì)胞的抗逆活動[6-7]。真核生物中的HSP90s屬于持家蛋白,含量較高,約占總蛋白的1%~2%[8],在高溫脅迫時,比例迅速升至4%~6%[9]。

    本研究利用多種生物信息學(xué)工具鑒定毛竹HSP90基因家族成員,分析家族各成員的特征、進化關(guān)系及表達特征,以期為更深入研究HSP90基因的生物學(xué)功能及挖掘毛竹的優(yōu)良基因資源提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    從毛竹基因組、蛋白數(shù)據(jù)庫(http://202.127.18.221/bamboo/down.php)中下載毛竹全基因組序列、cDNA序列及氨基酸序列,構(gòu)建本地blast數(shù)據(jù)庫。

    1.2 方法

    1.2.1 毛竹HSP90基因家族序列的獲得 從Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)庫中(http://pfam.xfam.org/)下載與PF00183.18和PF02518.26 結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的HMM圖譜,e-value≤1e-10。以單子葉植物水稻(Oryzasativa)的所有HSP90基因家族氨基酸序列為誘餌,通過blastp和隱藏馬爾科夫模型(HMM)方法對毛竹基因組中的HSP90基因進行篩選。

    1.2.2 毛竹HSP90基因家族理化性質(zhì)分析 通過在線網(wǎng)站Expasy的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析毛竹HSP90基因家族成員分子量,理論等電點、親疏水性等理化性質(zhì),通過ProtComp 9.0在線分析工具(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group= programs&subgroup=proloc)對HSP90蛋白進行亞細(xì)胞定位預(yù)測,通過SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin)預(yù)測蛋白是否具有信號肽。

    1.2.3 毛竹HSP90基因家族系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)分析 從水稻和擬南芥(Arabidopsis)數(shù)據(jù)庫中篩選具有PF00183.18和PF02518.26結(jié)構(gòu)域的蛋白序列,分別通過ClustalW多重比對,用MEGA 7.0(http://www.megasoftware.net)軟件鄰位連接(Neighbor-Joining,NJ)法構(gòu)建毛竹和其它物種中HSP90基因家族系統(tǒng)進化樹,自檢值取1000次抽樣。利用毛竹基因組位置注釋文件,使用TBtools繪制毛竹HSP90家族基因結(jié)構(gòu)圖及scaffold定位圖。利用在線網(wǎng)站NCBI Conserved Domain(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和MEME(http://meme.sdsc.edu/meme/meme-intro.html)預(yù)測HSP90家族基因保守域和基序,并提交到TBtools繪制。

    1.2.4 共線性分析 利用TBtools軟件對毛竹基因組所有氨基酸進行序列比對,并將毛竹基因組蛋白序列與水稻基因組氨基酸序列成對比對,利用MCScanX獲得毛竹基因家族共線性關(guān)系,并用Circos對結(jié)果進行可視化。

    1.2.5 毛竹HSP90基因家族順式響應(yīng)元件分析 從毛竹數(shù)據(jù)庫中下載全基因組序列,構(gòu)建本地Blast 數(shù)據(jù)庫,以已獲得的完整的毛竹HSP90基因家族cDNA序列進行本地Blast搜索,分析毛竹11個HSP90基因與上游基因之間的間距,對于間距大于2000 bp的HSP90基因,獲取翻譯起始密碼子上游2000 bp序列,剔除長度小于2000 bp的序列,所獲序列用于順式作用元件預(yù)測。利用Plant CARE database(plant cis-acting regulatory element database,http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools /plantcare/ html/)對所獲啟動子序列上的順式調(diào)控元件進行分析。預(yù)測所得的順式作用元件按功能進行分類。

    1.2.6 組織特異性表達 從毛竹數(shù)據(jù)庫[10]中下載毛竹不同組織,包括根、葉、鞭、花序1(早期花序)、花序2(花期花序)、莖20(20 cm長的筍芽頂部)、莖50(50 cm長的筍芽頂部)的7個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),繪制各組織中HSP90家族成員的表達熱圖。

    同時,采集30 d的毛竹幼苗的根、莖、葉,液氮速凍,5株為1次重復(fù),共3次重復(fù)。使用天根公司RNAprep Pure 植物總 RNA提取試劑盒提取RNA,用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈,用在線工具Primer 3.0(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計特異性引物(表1)。

    表1 特異性引物

    熒光定量PCR擴增體系為10 μL,包括2×SYBR Premix ExTaqTMII 5μL,正反向引物(10 μM)各0.4 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 3.2 μL。熒光定量PCR擴增條件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt方法[11]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 毛竹HSP90基因家族成員序列分析

    以水稻8條完整的HSP90基因序列為種子序列,通過本地Blastp和hmmsearch搜索,共獲得16條毛竹HSP90基因的氨基酸序列,通過在線pfam搜索軟件,確認(rèn)11個成員序列既含有N端的ATP酶結(jié)構(gòu)域,又含有HSP90結(jié)構(gòu)域。需要說明的是:雖然4個成員(PH02Gene07542、PH02Gene09089、PH02Gene17689、PH02Gene45866)的分子量均小于50 kD,但由于均含有ATP酶結(jié)構(gòu)域和HSP90結(jié)構(gòu)域,后續(xù)一并進行分析。11個成員的基本信息見表2,11個成員的多肽鏈長度從356(PH02Gene17689)~806 aa(PH02Gene31917)不等;分子量介于39.63~92.42 kD;脂肪指數(shù)介于78.86(PH02Gene48597)~85.48(PH02Gene17689)之間;等電點范圍為4.56(PH02Gene17689)~5.31(PH02Gene39947),11個毛竹HSP90蛋白均為酸性蛋白(pI<7.0)。4個HSP90的不穩(wěn)定指數(shù)大于40,表明毛竹中這4個HSP90屬于穩(wěn)定蛋白,而另外7個屬于不穩(wěn)定蛋白。親水性總平均值均為負(fù)值,表明11個HSP90蛋白均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位顯示,分子量小于50 kD的4個成員定位在細(xì)胞質(zhì),而其它7個成員定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。另外,11個HSP90蛋白均不含跨膜結(jié)構(gòu),只有PH02Gene31917包含有典型的信號肽序列。PH02Gene37282和PH02Gene31917包含有駐留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的KDEL短肽。

    表2 11個毛竹HSP90成員信息

    2.2 毛竹HSP90家族基因的結(jié)構(gòu)

    毛竹家族成員的基因結(jié)構(gòu)存在明顯差異,所含外顯子數(shù)5~20個,其中分子量低于50 kD的4個基因含有5個外顯子,結(jié)構(gòu)相對簡單;其它7個大分子量的基因含有15~20個外顯子,結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜(圖1)。

    圖1 毛竹HSP90基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及結(jié)構(gòu)

    2.3 毛竹HSP90基因家族的scaffold定位

    從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫獲得HSP90家族成員的位置以及在scaffold上的信息。從圖2可知,11個毛竹HSP90基因分布在9條scaffold上,較為分散。其中scaffold 3和scaffold 22上各分布有2條,且每2條之間的距離非常接近,不過分布在同一scaffold上的2個基因結(jié)構(gòu)不一致,進化上也分屬于不同的group組,表明同一scaffold上的2個HSP90基因不是基因復(fù)制而來的。

    圖2 毛竹HSP90基因家族成員在scaffold上的分布

    2.4 毛竹HSP90家族成員蛋白保守基序的預(yù)測

    毛竹HSP90家族成員中,6個成員的蛋白序列共含5個保守基序(圖3),每個基序含40~50個氨基酸(表3)。4個成員的蛋白序列含4個保守基序,缺乏Motif 5。另外1個成員也含4個保守基序,但缺乏Motif 2。11個成員均含有Motif 1、Motif 3、Motif 4 3個保守基序,從pfam注釋來看,motif 3、motif 4被注釋為HATPase_c,而motif 1被注釋為HSP90。以上結(jié)果表明毛竹HSP90家族成員的功能可能發(fā)生了分化。

    表3 毛竹HSP90家族蛋白的基序組成

    圖3 毛竹HSP90家族成員蛋白保守基序的預(yù)測

    2.5 毛竹HSP90家族成員及其它植物中該家族成員的聚類分析

    以擬南芥、水稻、毛竹的26個HSP90家族成員的氨基酸序列構(gòu)建了無根系統(tǒng)進化樹(圖4)。結(jié)果顯示:26個成員被分為3組:Group A中包含5個毛竹HSP90家族成員,Group B中包含2個含15個外顯子的HSP90家族成員,而4個結(jié)構(gòu)簡單、分子量小的HSP90家族成員均聚在Group C組,表明結(jié)構(gòu)類似的毛竹HSP90基因在進化上更接近,推測功能也更相近。另外,Group A和B組的毛竹HSP90基因具有倍增的現(xiàn)象。從進化樹來看,毛竹HSP90與水稻HSP90更為接近。

    圖4 擬南芥、水稻、毛竹中HSP90蛋白的系統(tǒng)進化樹

    2.6 毛竹HSP90家族成員的共線性分析

    直系同源基因?qū)梢蕴峁┯嘘P(guān)物種之間進化關(guān)系的有效信息。水稻與毛竹HSP90家族成員間的共線性分析表明:7個水稻HSP90基因與10個毛竹HSP90基因有共線性關(guān)系(圖5)。僅1個毛竹的HSP90基因PH02Gene09089與水稻HSP90基因間無直系同源關(guān)系,表明該基因是毛竹中特有的。

    圖5 毛竹與水稻HSP90家族的共線性分析

    2.7 毛竹HSP90家族基因的啟動子分析

    截取ATG上游2 kb的序列用于分析啟動子中的順式作用元件,結(jié)果顯示,除了基本的啟動子結(jié)構(gòu)元件,如TATA box和CAAT box外,HSP90家族成員的啟動子序列上還存在13個與逆境脅迫相關(guān)的順式元件及其它順式作用元件。每個成員啟動子上的順式作用元件見圖6。每個啟動子上都含有光相關(guān)的順式作用元件,如G-box和MRE等。在所有11個成員的順式作用元件中,與激素(如茉莉酸甲酯、脫落酸、赤霉素、生長素和水楊酸)相關(guān)的順式作用元件約占一半(46.1%);其次是與光相關(guān)的順式作用元件,占到五分之二;與各種逆境脅迫(如無氧脅迫、干旱脅迫及其他防御脅迫)相關(guān)的順式作用元件占8.1%。另外,與各組織(如分生組織及胚乳)相關(guān)的順式作用元件也有被鑒定到。雖然各成員中都包含光相關(guān)及激素相關(guān)的元件,但每個成員的順式作用元件仍存在差別,如晝夜節(jié)律相關(guān)的元件僅存在于2個成員的啟動子中,也說明了毛竹11個HSP90成員的功能發(fā)生了變化。

    圖6 毛竹HSP90基因家族成員啟動子上順式作用元件的分布

    2.8 毛竹HSP90家族成員的組織特異性表達分析

    基于已發(fā)表的毛竹不同組織的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[10],繪制了毛竹HSP90基因家族各成員的組織特異性表達圖譜熱圖(圖7A)。結(jié)果表明,在自然條件下,6個結(jié)構(gòu)復(fù)雜的基因,包括PH02Gene05953、PH02Gene48597、PH02Gene39947、PH02Gene37282、PH02Gene21535、PH02Gene01254,在各組織中的表達量非常微弱,而4個結(jié)構(gòu)相對簡單的基因在花序中表達強烈,在其它組織中表達較弱,表現(xiàn)出強烈的組織特異性表達模式。RT-PCR的檢測結(jié)果(圖7B)也證實:6個結(jié)構(gòu)復(fù)雜的基因在幼苗期的組織中幾乎檢測不到表達(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)),而4個結(jié)構(gòu)相對簡單的基因表現(xiàn)出明顯的組織特異性表達模式。值得關(guān)注的是,組織特異性表達模式與聚類分析及基因結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出很強的關(guān)聯(lián)性。

    圖7 毛竹HSP90基因家族成員在不同組織中的表達量

    3 討論

    在原核與真核生物中,HSP90是一類高度保守的分子伴侶蛋白,廣泛參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞周期及其它重要的生物學(xué)過程[12]。目前,在動物和真菌中,HSP90的功能已被廣泛報道,而植物中的報道相對落后。隨著多種植物基因組序列的公布,一些模式植物,如擬南芥[13]、水稻[14],一些重要的蔬菜作物,如番茄(Solanumlycopersicum)[15]、辣椒[16](Capsicumannuum)、黃瓜[17](Cucumissativus)中的HSP90基因家族相繼被報道。

    毛竹是一種廣泛分布在南方的亞熱帶經(jīng)濟樹種,其基因組已被測序2次,該數(shù)據(jù)的釋放有利于深入分析在逆境中起重要作用的HSP90基因家族,為進一步深入探索毛竹抗逆特性提供理論依據(jù)。本文從毛竹基因組中共鑒定出11個HSP90家族基因,比模式植物擬南芥[13](7個)、水稻[14](9個)、楊樹(Populus)[18](10個)多,比地中海橄欖樹[19](Oleaeuropaeasubsp.Europaea,12個)少,HSP90成員個數(shù)可能與物種的抗逆性有一定相關(guān)性。多數(shù)二倍體的葫蘆科作物含5~7個HSP90成員,而四倍體的筍瓜(Cucurbitamaxima)含10個HSP90成員[17],毛竹中HSP90成員的個數(shù)與四倍體筍瓜的個數(shù)最接近。理化特性分析顯示毛竹中HSP90成員均為酸性蛋白,這與擬南芥、水稻、楊樹和番茄中的研究結(jié)果相吻合,表明植物中HSP90的理化特性非常保守。同時,本文中鑒定到的3對HSP90旁系同源基因分別位于不同的scaffold上,表明毛竹中HSP90基因的擴張主要是由于區(qū)域重復(fù)導(dǎo)致的。進化樹和表達量的結(jié)果顯示,毛竹中結(jié)構(gòu)相似的HSP90成員聚在一組,且結(jié)構(gòu)相似的基因表達特性非常相似,表明進化不僅影響了毛竹HSP90成員的功能,也影響了其結(jié)構(gòu)[20-21]。闡明毛竹HSP90家族成員在各種逆境脅迫以及生長發(fā)育過程中的生物學(xué)功能還需要大量的直接證據(jù)佐證。

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