辛鵝溫敏原位凝膠經鼻給藥后木蘭脂素血漿含量的測定及藥動學研究

顏紅　彭志榮　高司琪　駱慧婷　歐陽威

〔摘要〕 目的 建立辛鵝溫敏原位凝膠經鼻給藥后大鼠血漿中木蘭脂素的液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry， LC-MS/MS）檢測方法，并探討其在大鼠體內的藥動學特性。方法 大鼠滴鼻給予辛鵝鼻用溫敏原位凝膠（1.5 mL/kg）后于不同時間點腹主動脈取血，應用梯度洗脫程序進行色譜分離，用LC-MS/MS技術檢測，以采樣時間對血藥濃度建立藥-時曲線，采用DPS 15.10軟件計算藥動學參數(shù)。結果 在2～500 ng/mL范圍內，木蘭脂素與內標的峰面積比值與濃度的線性關系良好。大鼠滴鼻給予辛鵝鼻用溫敏原位凝膠，其主要藥動學參數(shù)分別為達峰時間T為（0.46±0.03） h，達峰濃度C為（230.83±55.17） ng/mL，半衰期T為（2.98±0.43） h，體內平均駐留時間MRT為（4.30±0.62） h，藥-時曲線下面積值AUC為（1 035.34±200.65） ng·h/mL、AUC為（1089.22±201.00） ng·h/mL，總清除率CL為（1278.30±226.46） L/（kg·h）。結論 建立的LC-MS/MS檢測方法靈敏度高、專屬性強，適用于大鼠體內的木蘭脂素藥動學研究。辛鵝溫敏原位凝膠經鼻給藥后，木蘭脂素在大鼠體內的過程符合一室模型。

〔關鍵詞〕 原位凝膠;辛夷;鵝不食草;木蘭脂素;藥動學;液相色譜-串聯(lián)質譜;血藥濃度

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.009

Study on content determination and pharmacokinetics of magnolin in rat plasmafrom Xinyi （Magnoliae Flos）-Ebushicao （Centipedae Herba） thermosensitive in situ gels after intranasal administration

YAN Hong， PENG Zhirong， GAO Siqi， LUO Huiting， OUYANG Wei

（School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To establish a liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry （LC-MS/MS） method for determination of magnolin and study its pharmacokinetics after intranasal delivery of Xinyi （Magnoliae Flos）-Ebushicao （Centipedae Herba） thermosensitive in situ gels. Methods Blood samples were taken from abdominal aorta at different time points after intranasal delivery of Xinyi （Magnoliae Flos）-Ebushicao （Centipedae Herba） thermosensitive in situ gels in rats （1.5 mL/kg）. The gradient elution program was used for chromatographic separation. The LC-MS/MS was applicated for detection. The plasma drug concentration-time curve was established by the sampling time to blood drug concentration. The pharmacokinetic parameters were obtained calculated with DPS 15.10 software. Results There was a good linear relationship between peak area ratio and concentration of magnolin and internal standard within range of 2～500 ng/mL. After intranasal administration of Xinyi （Magnoliae Flos）-Ebushicao （Centipedae Herba） thermosensitive in situ gels in rats， the main pharmacokinetics parameters were as follows： the peak time T was （0.46±0.03） h， the peak concentration C was （230.83±55.17） ng/mL， the half-life T was （2.98±0.43） h， the average residence time MRT was （4.30±0.62） h， the area under the drug-time curve AUC was （1035.34±200.65） ng·h/mL， AUC was （1089.22±201.00） ng·h/mL， and the total clearance CL was （1278.30±226.46） L/（kg·h）. Conclusion The established LC-MS/MS method has the high sensitivity and strong specificity， and it can be used for the pharmacokinetic study of magnolin in rats. The process of magnolin in rats conforms to one-compartment model after intranasal delivery of Xinyi （Magnoliae Flos）-Ebushicao （Centipedae Herba） thermosensitive in situ gels.

〔Keywords〕 in situ gel; Xinyi （Magnoliae Flos）; Ebushicao （Centipedae Herba）; magnolin; pharmacokinetics; liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry; plasma concentration

辛鵝鼻用溫敏原位凝膠源于臨床經驗方[1]，由辛夷與鵝不食草兩味藥材組方而成，辛夷的主要有效成分為木蘭脂素，鵝不食草的主要成分為揮發(fā)油類。辛夷與鵝不食草均具有發(fā)散風寒、宣通鼻竅之功效[2-5]，臨床多用于治療風寒頭痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵等。溫敏原位凝膠劑是一種具有臨界相轉變溫度的原位凝膠，它可在臨界相轉變溫度附近由液體狀態(tài)突變?yōu)榘牍腆w狀態(tài)，可使凝膠黏附于鼻黏膜表面，具有延長藥物滯留時間、使用方便、組織相容性和生物黏附性好等優(yōu)點[6-9]。

本實驗前期已成功制備了辛鵝鼻用溫敏原位凝膠，其pH值、膠凝溫度、黏度均適宜，常溫下呈液體，預期給藥后可迅速在鼻黏膜上形成凝膠，體外釋藥實驗表明其具有一定的緩釋作用，可延長藥物在鼻腔內滯留的時間[10]。為進一步考察辛鵝鼻用溫敏原位凝膠經鼻給藥后的體內過程，為制劑的開發(fā)提供參考，本項目建立了辛鵝溫敏原位凝膠經鼻給藥后大鼠血漿中木蘭脂素的液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry， LC-MS/MS）檢測方法，并開展了其藥動學研究。

1 材料

1.1? 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)6460三重四級桿質譜儀（美國安捷倫科技有限公司）;TG16MW臺式高速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）;UGC-24CF防腐型24位圓形氮吹儀（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）。

辛鵝鼻用溫敏原位凝膠（實驗室自制）;木蘭脂素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110882-201708，純度：96.5%）;托特羅定（上海紫霞生物科技有限公司，批號：E013520，純度：94%）;甲醇（美國斯百全公司，批號：3HG0013，純度：99.9%）;乙腈（美國天地公司，批號：21125090，純度：99.9%）為色譜純;甲酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號：40023774，純度：99.5%）為分析純。

1.2? 實驗動物

雄性SD大鼠66只，體質量230～270 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2016-0002，實驗動物使用環(huán)境合格證號SYXK（湘）2013-0005。

2 方法

2.1? 辛鵝鼻用溫敏原位凝膠的制備

課題組前期已開展辛鵝鼻用溫敏原位凝膠的制備工藝與處方的優(yōu)選[10]，具體操作如下：稱取處方量2%辛夷與鵝不食草復方提取物、0.4%混合揮發(fā)油、1%吐溫-80、15% 1，2-丙二醇、0.04%苯扎溴銨溶于雙蒸水中，加入處方量15%泊洛沙姆P407、1% P188作為基質，補加雙蒸水至總處方量，置于4 ℃冰箱中冷藏過夜，即得凝膠。

2.2? 大鼠血漿中木蘭脂素LC-MS/MS測定

2.2.1? 色譜與質譜條件? 色譜柱為Zorbax RRHD Extend-C（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A相）-乙腈（B相），柱溫35 ℃，體積流量0.3 mL/min，進樣量2 μL，梯度洗脫程序見表1。

質譜檢測采用電噴霧離子化正離子（ESI+）模式，多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring， MRM）方式。毛細管電壓為4 kV，離子源干燥氣溫度為345 ℃，干燥氣氣流12 L/min，霧化氣50 psi。待測化合物檢測離子對見表2。

2.2.2? 對照溶液的配制? 木蘭脂素對照品母液：精確稱取0.010 1 g木蘭脂素對照品（純度為96.5%）置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得0.974 7 mg/mL的木蘭脂素對照品母液。內標托特羅定對照品母液：精確稱取0.005 0 g托特羅定對照品（純度為94.0%）置25 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得0.188 0 mg/mL的內標托特羅定對照品母液。

2.2.3? 大鼠血漿樣品的處理? 取大鼠血漿，精確吸取100 μL血漿樣品于EP管中，加入20 μL托特羅定溶液作為內標（3 μg/L），再加入370 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋振蕩3 min，超聲15 min，以12 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm），取上清液400 μL至EP管，置于氮吹儀中，用氮氣吹干后加入160 μL乙腈復溶，渦旋震蕩5 min，12 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm），過0.22 μm有機膜，上機檢測。

2.2.4? 方法學考察[11-13]? （1）專屬性考察：取大鼠空白血漿，除不加內標溶液外，其余按“2.2.3”項下方法處理，上機檢測，獲得空白血漿MRM圖;將一定濃度托特羅定內標溶液和木蘭脂素對照品溶液加入大鼠空白血漿中，同法操作，上機檢測，獲得空白血漿加內標與木蘭脂素對照品的MRM圖;取大鼠給藥后的血漿，同法操作，上機檢測，獲得給藥后大鼠含藥血漿的MRM圖。

（2）線性關系和定量下限的考察：精確吸取100 μL空白血漿，加入20 μL托特羅定作為內標（3 μg/L）和10 μL含有不同質量木蘭脂素對照品的單標，再加入370 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋3 min，超聲15 min，12 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm），取出上清液400 μL，氮氣吹干后加入160 μL乙腈復溶，渦旋5 min，12 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm），配制成含木蘭脂素不同質量濃度（2、5、10、25、50、125、250、500 ng/mL）的基質單標溶液。分別進樣測定，記錄峰面積。

（3）精密度考察：取“2.2.4（2）”項下制備的低、中、高3個質量濃度（5、50、500 ng/mL）的基質單標溶液，分別在24、48 h內重復進樣6次，進樣檢測，記錄峰面積，計算各濃度峰面積的RSD值。

（4）加樣回收與基質效應試驗：取大鼠空白血漿，按“2.2.4（2）”項下方法處理，分別加入含不同濃度的木蘭脂素乙腈溶液，配制成濃度為5、50、500 ng/mL的樣品，計算各化合物的實際質量濃度和理論質量濃度的比值作為加樣回收率。

精確吸取100 μL空白血漿于EP管中，加入400 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋3 min，超聲15 min，12 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm），得到基質提取液，再用基質提取液稀釋木蘭脂素標準儲備液至低、中、高3個質量濃度（5、50、500 ng/mL），每個濃度平行6份，進樣檢測記錄峰面積。此外，將木蘭脂素標準儲備液用乙腈稀釋得5、50、500 ng/mL 3個濃度，每個濃度平行6份。以基質提取液稀釋的木蘭脂素峰面積與乙腈稀釋的木蘭脂素峰面積的比值計算基質效應。

（5）穩(wěn)定性試驗：取“2.2.4（2）”項下制備的低、中、高3個質量濃度（5、50、500 ng/mL）的基質單標溶液，每個濃度平行6份，分別考察4 ℃放置0、12、24 h，樣品-70 ℃冰凍21 d以及凍融穩(wěn)定性。在設定的考察時間進樣檢測，記錄峰面積，計算RSD值。

2.3? 大鼠滴鼻給予辛鵝鼻用溫敏原位凝膠藥動學實驗

2.3.1? 給藥方法? 受試大鼠隔夜禁食后，每只大鼠兩鼻各滴鼻給予辛鵝鼻用溫敏原位凝膠1.5 mL/kg。

2.3.2? 樣品采集? 每6只大鼠分為一平行時間組，分別于給藥后0、5、15、30 min及1、1.5、2、4、8、12、24 h腹主動脈取血，置于肝素化的離心管中，3 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm），分離上層血漿，置

-70 °C冰箱中保存待測。

2.3.3? 血藥濃度測定? 采用LC-MS/MS技術，按所建立的血藥濃度檢測方法測定大鼠經滴鼻給予辛鵝鼻用溫敏原位凝膠后血漿中的木蘭脂素濃度。

2.3.4? 數(shù)據(jù)處理? 主要藥動學參數(shù)達峰濃度（Cmax）、達峰時間（T）為實測值，藥-時曲線下面積（AUC）、半衰期（T）、清除率（CL）、體內平均駐留時間（MRT）經DPS 15.10擬合計算。

3 結果

3.1? 方法學考察

3.1.1? 方法的專屬性? 在本實驗所采用的色譜條件下，木蘭脂素的保留時間約為4.82 min，內標托特羅定的保留時間約為2.65 min。木蘭脂素、內標托特羅定峰形良好，無雜峰干擾測定，基線平穩(wěn)，分析方法具有良好的專屬性。產物離子質譜圖及MRM圖分別見圖1、圖2。

3.1.2? 標準曲線、線性范圍及定量下限? 以對照品與內標的峰面積之比為縱坐標（Y），對照品濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，木蘭脂素在2～500 ng/mL范圍內線性關系良好，標準曲線方程為：Y=0.4494X+5.134 1（R=0.999 8），權重系數(shù)W為1/c。血漿中木蘭脂素最低定量限為2 ng/mL。

3.1.3? 精密度試驗結果? 木蘭脂素的低、中、高3個質量濃度（5、50、500 ng/mL）的基質單標溶液在24 h內峰面積的RSD值分別為2.35%、3.20%、2.57%;48 h內峰面積的RSD值分別為5.58%、2.11%、1.47%。

3.1.4? 加樣回收與基質效應試驗結果? 木蘭脂素在低、中、高3個質量濃度下（5、50、500 ng/mL）的基質效應分別為97.43%、84.15%、83.45%，均在80%～120%范圍之內，表明本方法可有效避免基質對木蘭脂素測定的影響。同時，木蘭脂素的低、中、高3個質量濃度的加樣回收率分別為120%、105%及102%，符合生物樣品分析要求，加樣回收與基質效應結果見表3。

3.1.5? 穩(wěn)定性試驗結果? 木蘭脂素的低、中、高3個質量濃度（5、50、500 ng/mL）的基質單標溶液4 ℃放置峰面積的RSD值分別為4.23%、3.51%、4.21%，表明木蘭脂素在該條件下穩(wěn)定;-70 ℃短期冰凍低、中、高3個質量濃度測定結果RSD分別為1.59%、2.75%、2.54%，表明樣品在-70 ℃冰凍環(huán)境下可短期穩(wěn)定存放;低、中、高3個質量濃度在反復3次凍融后的測定結果RSD分別為3.70%、1.48%、2.17%，表明樣品在反復凍融3次后仍保持穩(wěn)定。

3.2? 血藥濃度時間曲線

大鼠兩鼻經滴鼻給予辛鵝鼻用溫敏原位凝膠（1.5 mL/kg）后30 min左右達最大吸收，Cmax約為230 ng/mL，木蘭脂素的平均血藥濃度時間曲線見圖3。

3.3? 藥動學參數(shù)

DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)一室模型擬合決定系數(shù)為94.02%（>90%），且擬合系數(shù)較其他模型更高，故采用一室模型擬合計算大鼠給藥后的藥動學參數(shù)，所得藥動學參數(shù)見表4。

4 討論

溫敏原位凝膠劑是一種具有臨界相轉變溫度的原位凝膠，其在臨界相轉變溫度附近，可由液體狀態(tài)突變?yōu)榘牍腆w狀態(tài)，形成凝膠黏附于鼻黏膜表面，具有延長藥效、工藝簡單、生物相容性好等優(yōu)點，是一種具有良好應用前景的新型鼻用制劑[14-17]。

木蘭脂素為制劑中辛夷的主要有效成分，本實驗采用LC-MS/MS技術建立了大鼠血漿中木蘭脂素的檢測方法。結合預實驗結果，采用梯度洗脫對組分進行分離，采用MRM模式，以托特羅定為內標[M+H]+（m/z 326.2 /147.1）對血漿中木蘭脂素進行檢測，木蘭脂素、內標托特羅定峰形良好，無雜峰干擾測定，基線平穩(wěn)，專屬性強;分析方法可消除制劑中其他成分及血漿內源性物質的干擾，無明顯的基質效應;在血漿用量100 μL的情況下檢測靈敏度可達2.0 ng/mL，相比于文獻報道[18]的高效液相色譜法更靈敏。精密度及加樣回收率測定結果均符合現(xiàn)行生物分析方法的相關規(guī)定[19-20]。建立的檢測方法可為辛鵝鼻用溫敏原位凝膠在大鼠體內的藥動學分析提供一種有效手段。此外，目前關于木蘭脂素活性單體的系統(tǒng)研究甚少，作為辛夷的主要有效成分，本實驗亦可為辛夷制劑的研究奠定藥動學基礎。

本實驗首次采用LC-MS/MS檢測方法對中藥制劑給藥后大鼠體內的木蘭脂素進行藥動學研究，實驗結果表明大鼠經滴鼻給予辛鵝鼻用溫敏原位凝膠（1.5 mL/kg）后，主要有效成分木蘭脂素在體內的過程符合一室模型，T為（0.46±0.03） h，C為（230.83±55.17） ng/mL，T為（2.98±0.43） h，MRT為（4.30±0.62） h，AUC為（1035.34±200.65） ng·h/mL，CL為（1278.30±226.46） L/（kg·h），以上藥動學實驗結果可為制劑的臨床用藥方案提供實驗依據(jù)。

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