綠萼鳳仙花對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)

劉松 曹孟會(huì) 李芹梅 張?zhí)熘{ 李文祥 黃美娟 黃海泉

摘要：為探析綠萼鳳仙花對(duì)低溫脅迫的生理適應(yīng)性，本研究在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以20℃為對(duì)照，分別在2℃和0℃處理0、12、24、48、72h，測(cè)定其細(xì)胞傷害率（CIR）、葉綠素和丙二醛（MDA）含量、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性及脯氨酸（PRO）等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量等指標(biāo)，并進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為綠萼鳳仙花開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。結(jié)果表明，隨溫度的降低及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花的傷害程度不斷加劇。2℃和0℃低溫脅迫下，綠萼鳳仙花的CIR及MDA、可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）含量均呈上升趨勢(shì)，在脅迫72h時(shí)分別高于對(duì)照3.18倍和5.09倍、80.85%和2.31倍、1.02倍和1.24倍、2.39倍和4.93倍，差異極顯著;POD活性、葉綠素含量呈下降趨勢(shì)，在脅迫72h時(shí)分別顯著低于對(duì)照43%和71%、53%和60%，差異極顯著;SOD、CAT活性及PRO含量均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低趨勢(shì)，溫度越低，越快達(dá)到峰值。相關(guān)性分析結(jié)果表明，CIR、葉綠素含量、MDA含量、SP含量和POD活性可作為綠萼鳳仙花耐寒性鑒定的主要指標(biāo)，SOD和CAT活性、PRO和SS含量可作為輔助指標(biāo)。綜合來(lái)看，綠萼鳳仙花對(duì)2℃低溫具有一定的耐性，在0℃低溫下生長(zhǎng)受抑并表現(xiàn)出一定的寒害特征。本研究結(jié)果可為綠萼鳳仙花的引種馴化、雜交育種及抗寒育種提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：綠萼鳳仙花;低溫脅迫;細(xì)胞傷害率;抗氧化生理指標(biāo);滲透調(diào)節(jié)物質(zhì);相關(guān)性分析

隨著全球氣候變化加劇，極端天氣如極端高溫、極端低溫等氣候事件頻繁發(fā)生[1]。而溫度是決定植物地理分布、影響其品質(zhì)和生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素，因此，探究植物對(duì)低溫和高溫的適應(yīng)性及生理機(jī)制具有重要意義和作用[2]。

低溫脅迫會(huì)引起植物新陳代謝紊亂，通過(guò)探析植物對(duì)低溫的生理響應(yīng)來(lái)研究和評(píng)價(jià)其耐寒性是較常見(jiàn)的方法。Plazek等[3]發(fā)現(xiàn)抗寒植株在低溫脅迫下的細(xì)胞膜變化比低溫敏感植株小，電導(dǎo)率增幅小。低溫脅迫下的細(xì)胞外結(jié)冰現(xiàn)象可使胞內(nèi)水向胞外轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致細(xì)胞受到程度更為嚴(yán)重的滲透脅迫，電導(dǎo)率升高[4]。Airaki等[5]將辣椒葉片在8℃低溫下脅迫1～3d發(fā)現(xiàn)低溫脅迫使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化加重，誘導(dǎo)了氧化脅迫。為此，植物通過(guò)啟動(dòng)一系列抗氧化酶系統(tǒng)來(lái)清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS），從而減低氧化脅迫對(duì)其造成的傷害[6]。另外，低溫脅迫下，植物體內(nèi)也能積累更多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白，從而增強(qiáng)其滲透調(diào)節(jié)能力，提高對(duì)逆境脅迫的耐受性[7，8]。

鳳仙花屬植物種類(lèi)豐富，在我國(guó)分布范圍廣，因花型奇麗、顏色和形態(tài)多樣性高，極具觀賞價(jià)值，但目前在花卉園藝中開(kāi)發(fā)利用的品種還較少。綠萼鳳仙花（ImpatienschlorosepalaHand.Mazz.）為一年生或多年生草本花卉[9]，主要分布于貴州、廣東、廣西等地，常生于疏林溪旁或山谷水旁陰處[10]，具有低矮、分枝能力強(qiáng)、花大色艷、花期長(zhǎng)、一年多次開(kāi)花等特點(diǎn)，是可開(kāi)發(fā)為園林地被植物的優(yōu)良植物材料。因此，研究綠萼鳳仙花在低溫脅迫下的生理適應(yīng)性，對(duì)其引種馴化和抗寒品種選育具有重要指導(dǎo)意義。

目前尚未見(jiàn)有關(guān)綠萼鳳仙花對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)的研究報(bào)道。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，設(shè)置2℃和0℃兩種低溫處理，以20℃為對(duì)照，通過(guò)分析不同處理時(shí)間葉片中相關(guān)抗氧化生理指標(biāo)的變化動(dòng)態(tài)，探析綠萼鳳仙花對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制，以期為其開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用綠萼鳳仙花于2020年7月分株于西南林業(yè)大學(xué)樹(shù)木園。2021年1月選取長(zhǎng)勢(shì)一致且健康的成年植株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)方法

將所選綠萼鳳仙花植株分別在20、2℃和0℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)處理0、12、24、48、72h，以20℃為對(duì)照（CK），共計(jì)15個(gè)處理，每個(gè)處理3盆植株。選取當(dāng)年生莖上的成熟葉洗凈并擦干，用于測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3生理指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1細(xì)胞傷害率（CIR） 參考Chen等[11]的方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式：

CIR（%）=[（R-CK）/（R0-CK）]×100。式中，R為組織殺死前外滲液的電導(dǎo)率值;R0為組織殺死后外滲液的電導(dǎo)率值;CK為處理0h的外滲液電導(dǎo)率值。

1.3.2葉綠素含量 采用直接浸提法進(jìn)行測(cè)定[12]。

1.3.3抗氧化物酶活性和丙二醛（MDA）含量 MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定，過(guò)氧化物酶（POD）活性用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性用過(guò)氧化氫還原法測(cè)定[13]。

1.3.4滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量 脯氨酸（PRO）含量采用酸性茚三酮法測(cè)定，可溶性糖（SS）含量用蒽酮比色法測(cè)定，可溶性蛋白（SP）含量用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法測(cè)定[14]

1.4數(shù)據(jù)處理

用MicrosoftExcel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，用SPSS26.0軟件進(jìn)行多重比較（Duncan’s法）和Spearman相關(guān)分析。

2結(jié)果與分析

2.1低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花細(xì)胞傷害率的影響

由圖1可知，20℃條件下，CIR隨處理時(shí)間延長(zhǎng)緩慢上升，但上升幅度很小，處理72h的CIR僅11%。2℃低溫下，48h內(nèi)的CIR與對(duì)照相當(dāng)，但48h后急劇上升，72h達(dá)到46%，顯著高于對(duì)照。0℃低溫下，CIR在處理后即急劇上升，至12h已上升至37%，之后增幅略緩，至72h達(dá)到67%，與其他兩處理間差異顯著（P<0.05）。可見(jiàn)，綠萼鳳仙花的細(xì)胞傷害率受脅迫溫度和時(shí)間的共同影響。

2.2低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花葉綠素含量的影響

由圖2可知，2℃和0℃低溫處理顯著降低綠萼鳳仙花的葉綠素含量（P<0.05），但兩種低溫處理間差異不顯著;低溫脅迫12～48h內(nèi)各溫度處理的葉綠素含量無(wú)顯著差異，至72h降至最低，分別低于CK（20℃）53%和60%。CK處理下，綠萼鳳仙花葉片中的葉綠素含量波動(dòng)較小，均在12～15μmol·g-1FW。

2.3低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花葉片保護(hù)酶活性的影響

由圖3A可知，除2℃脅迫12h的SOD活性與CK差異不顯著外，兩種低溫脅迫均能使綠萼鳳仙花SOD活性顯著升高（P<0.05），且2℃處理的SOD活性顯著高于0℃處理;隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，2℃和0℃處理的SOD活性先升高，并分別于24、12h達(dá)到最高值，之后逐漸下降，72h時(shí)仍顯著高于CK57%和31%。CK處理的綠萼鳳仙花SOD活性在72h內(nèi)呈下降趨勢(shì)，但降幅很小，為0.89%～17.86%。

與CK相比，0℃低溫脅迫顯著降低綠萼鳳仙花的POD活性，且隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸降低趨勢(shì)，至72h時(shí)低于CK71%;2℃低溫脅迫下48h內(nèi)的POD活性與CK差異不顯著，呈先升后降變化趨勢(shì)，72h時(shí)大幅降低，顯著低于CK43%（P<0.05）。CK的POD活性在72h內(nèi)呈緩慢下降后又緩慢上升狀態(tài)，降幅為0.43%～16.52%，處理48h的值最低（圖3B）。

處理0～12h，2℃和0℃低溫處理對(duì)綠萼鳳仙花CAT活性的影響與CK無(wú)顯著差異，但均在24h顯著提高CAT活性，達(dá)到峰值;處理48h時(shí)，兩低溫處理的CAT活性仍高于CK，其中2℃處理仍顯著高于CK;至72h，兩低溫處理的CAT活性分別低于CK10%和53%，其中，0℃處理與CK間差異顯著（P<0.05）。兩低溫處理間比較，0～12h兩者間CAT活性無(wú)顯著差異，24～72h0℃處理的CAT活性顯著低于2℃處理（P<0.05）。20℃條件下，處理72h內(nèi)綠萼鳳仙花的CAT活性為1.09～1.23U·g-1FW，呈小幅上升趨勢(shì)（圖3C）。

2.4低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花葉片MDA含量的影響

由圖4可知，2℃和0℃低溫處理能夠促進(jìn)綠萼鳳仙花的MDA積累，且積累量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。2℃條件下處理72h的積累量顯著高于CK80.85%;而0℃條件下處理12h的積累量即顯著高于CK（P<0.05），72h時(shí)則高于CK2.31倍。CK處理的MDA含量變化很小，在1.28～1.41μmol·g-1FW范圍內(nèi)波動(dòng)。

2.5低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花葉片細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖5A可知，2℃脅迫12～72h的PRO含量均高于CK，并在脅迫24h后達(dá)到差異顯著水平;0℃脅迫12～24h的PRO含量顯著高于CK，之后逐漸下降，72h時(shí)略低于CK，差異不顯著。隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，2℃和0℃處理的PRO含量均先升高后下降，分別于處理48h和12h達(dá)到峰值。CK的PRO含量在72內(nèi)無(wú)明顯變化，穩(wěn)定在13～14μg·g-1。

由圖5B可知，2℃脅迫0～72h的SS含量先下降后上升，24h時(shí)最低，顯著低于CK24.31%，48～72h則顯著高于CK，尤其72h時(shí)，比CK高1.02倍;0℃處理下，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SS含量呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，12～24h顯著高于CK，48h時(shí)則顯著低于CK，之后快速上升，72h時(shí)顯著高于對(duì)照1.24倍。CK的SS含量在0～72h內(nèi)先降低后上升，在218～255μmol·g-1FW范圍內(nèi)小幅變化。

由圖5C可知，低溫脅迫能夠增加綠萼鳳仙花葉片中的SP含量，2℃處理48h后差異達(dá)顯著水平（P<0.05），尤其處理72h時(shí)達(dá)到CK的3.39倍;0℃條件使SP含量在處理12h時(shí)即顯著高于CK，之后隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，24h后增幅加大，72h時(shí)達(dá)到CK的5.93倍。CK的SP含量在處理的72h內(nèi)變化很小，保持在5.4～6.9μmol·g-1FW。

2.6綠萼鳳仙花葉片各項(xiàng)生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表1可知，CIR與脅迫時(shí)間始終呈極顯著正相關(guān)，表現(xiàn)為隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)顯著上升，且溫度越低，兩者的相關(guān)性越高。2℃和0℃低溫脅迫下，CIR與SP和MDA含量一直呈極顯著正相關(guān)，與葉綠素含量呈極顯著負(fù)相關(guān);POD在2℃低溫下與CIR顯著相關(guān)，在0℃下則與CIR極顯著相關(guān);PRO在2℃低溫下與CIR呈現(xiàn)極顯著正相關(guān);SS和CAT在2℃和0℃低溫脅迫下與CIR相關(guān)不顯著。表明MDA、SP和葉綠素含量及POD活性在綠萼鳳仙花受低溫脅迫的不同階段對(duì)細(xì)胞損傷進(jìn)行有規(guī)律的響應(yīng)，而SOD和CAT活性及PRO和SS含量對(duì)綠萼鳳仙花響應(yīng)低溫脅迫無(wú)明顯規(guī)律。

3討論

膜系統(tǒng)在植物抵御低溫冷害中起重要作用，冷害會(huì)使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，增加細(xì)胞膜透性，使電解質(zhì)滲透率提高[15，16]。有研究表明，隨低溫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，電解質(zhì)滲透率呈“S”形變化[17]。SOD、POD和CAT是植物抗氧化系統(tǒng)中清除活性氧的主要酶，在遭受逆境脅迫后，植物體首先啟動(dòng)SOD，將O·-2轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，POD和CAT則進(jìn)一步將H2O2分解為H2O和O2，從而減輕活性氧對(duì)膜系統(tǒng)的傷害[18-21]。丙二醛（MDA）是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，隨著脅迫溫度的降低其含量會(huì)不同程度地上升，是評(píng)價(jià)植物抗寒性強(qiáng)弱的參考指標(biāo)之一[22-24]。本研究結(jié)果表明，與20℃對(duì)照相比，2℃和0℃低溫處理能提高綠萼鳳仙花葉片中的SOD和CAT活性，溫度越低提高越快，說(shuō)明受到低溫脅迫后，綠萼鳳仙花快速啟動(dòng)活性氧清除系統(tǒng)，以保護(hù)膜系統(tǒng)免受活性氧的傷害，此時(shí)MDA積累量較低，細(xì)胞傷害率（CIR）上升緩慢;但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD、POD和CAT活性均降低，且溫度越低其活性越低，MDA含量顯著提高，CIR急劇上升，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間的低溫脅迫打破了植物體內(nèi)的活性氧“產(chǎn)生—清除”平衡，造成大量的活性氧積累，對(duì)膜系統(tǒng)造成嚴(yán)重傷害。這與在金花茶[25]、南天竹[26]、冰草屬植物[27]、大葉鐵線(xiàn)蓮[28]等中的研究結(jié)果基本一致。

葉綠素含量的高低可反映植物光合能力的強(qiáng)弱[29]。低溫脅迫會(huì)抑制葉綠素合成相關(guān)酶的活性，從而使植物體內(nèi)葉綠素含量降低，影響其光合作用[30]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，2℃和0℃低溫脅迫顯著降低綠萼鳳仙花葉片中的葉綠素含量，且隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)榫G萼鳳仙花對(duì)低溫的應(yīng)激反應(yīng)使體內(nèi)葉綠素合成相關(guān)酶活性快速降低，導(dǎo)致葉綠素含量急劇下降，而長(zhǎng)時(shí)間低溫脅迫使傷害進(jìn)一步加劇，導(dǎo)致葉綠素含量繼續(xù)降低。

脯氨酸（PRO）、可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）是細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。SP在植物體內(nèi)起著維持滲透調(diào)節(jié)及防止原生質(zhì)體脫水的作用[31，32]，低溫冷害會(huì)引起細(xì)胞蛋白質(zhì)的一系列變化，主要表現(xiàn)在SP含量增加，是植物產(chǎn)生抗寒性的重要過(guò)程[33];而冷馴化下，植物的抗寒性可因SS和PRO的累積而提高[34-36]。本研究結(jié)果表明，2℃和0℃低溫脅迫能提高綠萼鳳仙花葉片中的PRO、SP和SS含量。其中，2℃脅迫期間的PRO含量均高于對(duì)照，24h后差異顯著，而0℃脅迫24h內(nèi)的PRO含量顯著高于對(duì)照，之后與對(duì)照差異不顯著;兩低溫處理的PRO含量分別于脅迫12、48h達(dá)到峰值，溫度越低，達(dá)到峰值的時(shí)間越短，PRO含量下降越快。這與李慶華等[34]對(duì)不同基因型日本柳杉的抗寒性研究結(jié)果相似。SS含量在兩種低溫脅迫期間波動(dòng)變化，但均在脅迫72h時(shí)顯著高于對(duì)照，總體呈現(xiàn)溫度越低，SS積累越快，含量越高，這可能是因?yàn)榈蜏孛{迫會(huì)影響淀粉及蛋白質(zhì)分解酶的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的SS含量[37]。SP含量隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，均在脅迫72h時(shí)最高，且溫度越低，SP積累越快，含量越高，可能是因?yàn)榈蜏孛{迫使部分抗寒蛋白質(zhì)合成增加，從而提高植株內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)作用以減輕低溫對(duì)其的傷害。

對(duì)不同溫度下綠萼鳳仙花各生理指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CIR與脅迫時(shí)間始終呈極顯著正相關(guān)，且相關(guān)性隨溫度的降低而升高。進(jìn)一步分析CIR與其他指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MDA、SP和葉綠素含量及POD活性在綠萼鳳仙花受低溫脅迫的不同階段對(duì)細(xì)胞損傷響應(yīng)明顯。

4結(jié)論

2℃和0℃低溫處理72h能對(duì)綠萼鳳仙花造成一定傷害，且溫度越低、脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，傷害越重，0℃脅迫下生長(zhǎng)受抑并表現(xiàn)出一定的寒害特征，因此，綠萼鳳仙花引種時(shí)應(yīng)做好防寒保護(hù)措施，預(yù)防低于0℃的極端溫度傷害。CIR、葉綠素含量、MDA含量、SP含量和POD活性可作為綠萼鳳仙花耐寒性鑒定的主要指標(biāo)，SOD和CAT活性、PRO和SS含量可作為次要指標(biāo)。本研究結(jié)果可為綠萼鳳仙花的引種馴化、花期調(diào)控、抗寒育種等提供參考。