超聲輔助水酶法提取黃秋葵籽油的研究

張雅娜，王辰，吳奇芯，李庚瑤，趙維薇，宋子晴

（1.綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061；2.大理大學工程學院，云南 大理 671003；3.大理大學公共衛(wèi)生學院，云南 大理 671003）

黃秋葵籽含油率為20%左右，其油富含不飽和脂肪酸且比例均衡，是一種潛在的優(yōu)良油料[1-3]。黃秋葵籽油中含有豐富的脂肪酸，其中含量最高的是人體必需的不飽和脂肪酸—亞油酸，其次是油酸、棕櫚酸。其飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸比例合適，接近1∶1∶1的理想模式，具有降低血壓、降低膽固醇、降低血脂、軟化血管以及促進微循環(huán)的作用；此外黃秋葵籽油中還含有豐富的抗氧化物質(zhì)，具有清除自由基、保護肝臟、修復胃黏膜等功效，是一種保健功能和開發(fā)價值較高的油脂[4-6]。

目前黃秋葵籽油的提取方法已有研究，主要包括有機溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、水酶法等，近幾年研究較多的是有機溶劑萃取法，但對于水酶法提取黃秋葵籽油的研究卻較少。水酶法是近年來新興的一種環(huán)保提油技術，油脂科學界將水酶法提油技術稱為“一種油料資源的全利用技術”。與傳統(tǒng)制油技術相比，水酶法可以同時得到黃秋葵籽油和蛋白質(zhì)，縮短工藝路線；操作條件溫和、耗能低、投資低、出油率高；不使用有機溶劑，低碳安全環(huán)保[7]。

超聲波輔助水酶法提取技術是一種新興的提取分離技術，能夠強化植物中油脂的提取，加速傳熱和傳質(zhì)過程[8]。在超聲波作用下，產(chǎn)生的空泡在爆裂時可以產(chǎn)生巨大的剪切力，因此可有效地破壞油料的細胞壁，并使細胞壁內(nèi)的物質(zhì)得到釋放[9]。本試驗對超聲波輔助水酶法提取黃秋葵籽油進行研究，在單因素試驗的基礎上選出最佳的超聲波預處理條件和酶解條件，再利用正交試驗法進行優(yōu)化，得出最佳的黃秋葵籽油提取工藝，為黃秋葵籽油工業(yè)發(fā)展奠定一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵籽：市售。

中性蛋白酶（酶活0.8 AU/g）、堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L（酶活 2.4 AU/g）、磷脂酶（酶活 10 KLU/g）、果膠酶（酶活 3 300 PGNU/g）、纖維素酶（酶活 700 EGU/g）、復合蛋白酶（酶活1.6 AU/g）：丹麥Novo公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

ESJ205-4電子分析天平：普利賽斯國際貿(mào)易有限公司；FW-100高速萬能粉碎機：上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；JY92-IIN型超聲波細胞粉碎機：北京泰亞賽福科技發(fā)展有限責任公司；DW-86L386立式超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；GL-16G-II高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；HZS-H水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子開發(fā)有限公司；PHS-3C型pH計：杭州齊威儀器有限公司；JOYN-H1C1微波化學試驗爐：上海喬躍電子有限公司；KDN-103F自動定氮儀、HYP-10404十孔消化爐：上海纖檢儀器有限公司；SCT-02索氏抽提器：天津玻璃儀器廠；SX-4-10箱式電阻爐：天津市泰斯特儀器有限公司；WSL-2羅維朋比色計：浙江托普儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗工藝流程

水酶法提取黃秋葵籽油工藝流程見圖1。

圖1 水酶法提取黃秋葵籽油工藝流程圖Fig.1 Process for aqueous enzymatic extraction of okra seed oil

1.3.2 黃秋葵籽主要成分的測定

水分根據(jù)GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》測定[10]；粗脂肪根據(jù)GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》測定[11]；粗蛋白根據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》測定[12]；灰分根據(jù)GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》測定[13]。

1.3.3 酶制劑的選擇

本試驗選擇了中性蛋白酶、磷脂酶、果膠酶、纖維素酶、堿性蛋白酶Alcalase 2.4L、復合蛋白酶6種酶。在料液比 1∶6（g/mL）、加酶量 2.0%、酶解時間 4 h、酶解pH值分別為中性蛋白酶pH 6.5、磷脂酶pH 6.0、果膠酶pH5.0、纖維素酶pH5.2、堿性蛋白酶Alcalase2.4LpH 7.7和復合蛋白酶pH 7.0的條件下分別研究酶制劑對黃秋葵籽油提取率的影響，最終確定最佳酶制劑。

1.3.4 超聲波預處理試驗

1.3.4.1 超聲波預處理單因素試驗

分別以料液比[1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g/mL）]、超聲時間（15、25、35、45、55 min）、超聲功率（總功率為500 W）（50%、60%、70%、80%、90%）、超聲溫度（15、25、35、45、55℃）為單因素，考察各因素對黃秋葵籽油提取率的影響。

1.3.4.2 超聲波預處理正交試驗

在單因素試驗基礎上，根據(jù)結果確定正交試驗條件范圍，以料液比、超聲時間、超聲功率和超聲溫度為因素，以黃秋葵籽油提取率為指標，進行四因素三水平正交試驗，確定最佳超聲波預處理條件。超聲波預處理正交試驗因素與水平見表1。

表1 超聲波預處理正交因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for ultrasound pretreatment

1.3.5 酶解條件選擇

1.3.5.1 酶解單因素試驗

分別以加酶量（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）、酶解時間（1、2、3、4、5 h）、酶解 pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）為單因素，考察各因素對黃秋葵籽油提取率的影響。

1.3.5.2 酶解正交試驗

酶解正交試驗因素與水平見表2。

表2 酶解正交因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal test for enzymatic hydrolysis

1.3.6 黃秋葵籽油提取率測定

按照試驗設計加入酶制劑進行酶解，酶解過程用2 mol/L NaOH溶液和2 mol/L HCl溶液調(diào)整酶解過程的pH值。酶解結束后進行離心操作（轉(zhuǎn)速10 000 r/min、時間20 min、溫度4℃），離心后分為4層（游離油1、乳狀液、水解液、殘渣），取出乳狀液進行冷凍、微波解凍處理，進行二次離心，得到游離油2，最后將兩次得到的游離油稱量計數(shù)。黃秋葵籽油提取率計算公式如下。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗至少進行3次，利用Origin 8.5軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 黃秋葵籽的主要成分含量

黃秋葵籽的主要成分含量見表3。

表3 黃秋葵籽的主要成分Table 3 Main components of the okra seeds

如表3所示，本試驗的黃秋葵籽主要成分：水分約為7.34%，粗脂肪約為18.35%，粗蛋白約為24.67%，灰分約為4.46%。

2.2 酶種類的選擇

不同種類酶制劑對黃秋葵籽油提取率的影響見圖2。

圖2 不同種類酶制劑對黃秋葵籽油提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme species on yield of okra seed oil

由圖2可知，在料液比、加酶量、酶解時間相同的情況下，復合蛋白酶的黃秋葵籽油提取率最高，為42.96%，因此，最佳酶制劑是復合蛋白酶。

2.3 超聲波預處理試驗結果

2.3.1 超聲波預處理單因素試驗結果

2.3.1.1 料液比對黃秋葵籽油提取率的影響

不同料液比對黃秋葵籽油提取率的影響見圖3。

圖3 不同料液比對黃秋葵籽油提取率的影響Fig.3 Effects of material-to-liquid ratio on yield of okra seed oil

由圖3可知，隨著溶液體積的增加，黃秋葵籽油提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；當料液比為1∶6（g/mL）時，黃秋葵籽油提取率最高，為42.37%。當料液比較小時，體系黏度較高，不利于酶分子的遷移和油分子的釋放，而當料液比較大時，降低了酶與底物發(fā)生碰撞的幾率[14]。因此，確定最佳料液比為 1∶6（g/mL）。

2.3.1.2 超聲時間對黃秋葵籽油提取率的影響

不同超聲時間對黃秋葵籽油提取率的影響見圖4。

圖4 不同超聲時間對黃秋葵籽油提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on yield of okra seed oil

由圖4可知，當超聲時間小于45 min時，隨著超聲時間的延長，黃秋葵籽油提取率逐漸增加，這是因為在初始階段超聲對細胞的破壞作用相對較大，使得黃秋葵籽油提取率增加；當超聲時間為45 min時，黃秋葵籽油提取率最高，為42.95%；超聲時間在45 min以后，黃秋葵籽油提取率反而下降，其原因一方面是超聲波從黃秋葵籽外部向內(nèi)部擴散，擴散區(qū)域減小，距離增大，擴散率相應減小[15]；另一方面超聲時間長會使體系溫度急劇升高，導致油分解或揮發(fā)，使得黃秋葵籽油提取率下降[16]。因此，最佳超聲時間為45 min。

2.3.1.3 超聲功率對黃秋葵籽油提取率的影響

不同超聲功率對黃秋葵籽油提取率的影響見圖5。

圖5 不同超聲功率對黃秋葵籽油提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on yield of okra seed oil

由圖5可知，當超聲功率小于60%時，由于超聲功率在不斷地增加，使得黃秋葵籽油提取率大幅度升高。這是因為超聲波通過溶液產(chǎn)生大量氣泡，氣泡瞬間破裂形成局部瞬時壓力，產(chǎn)生強大的沖擊作用破壞細胞壁，從而提高出油率[17]；當超聲功率為60%時，黃秋葵籽油提取率最高，為41.91%；超聲功率大于60%時，黃秋葵籽油提取率反而下降，這可能是由于產(chǎn)生了自由基導致油降解[18]。因此，最佳超聲功率為60%。

2.3.1.4 超聲溫度對黃秋葵籽油提取率的影響

不同超聲溫度對黃秋葵籽油提取率的影響見圖6。

圖6 不同超聲溫度對黃秋葵籽油提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on yield of okra seed oil

由圖6可知，當超聲溫度低于45℃時，隨著超聲溫度的增加，黃秋葵籽油提取率逐漸增加，這可能是由于小分子擴散運動和油料空化作用不夠完全，而使黃秋葵籽油提取率較低；當超聲溫度為45℃時，黃秋葵籽油提取率最高，為42.34%；超聲溫度高于45℃后，黃秋葵籽油提取率呈下降趨勢?？赡苁菧囟冗^高導致物料輕微糊化及變性，不利于油脂的釋放，繼而使得提取率降低[19]。因此，最佳超聲溫度為45℃。

2.3.2 超聲波預處理正交試驗結果

超聲預處理正交試驗結果見表4。

表4 超聲預處理正交試驗結果及數(shù)據(jù)分析Table 4 Orthogonal test results for ultrasound pretreatment and data analysis

續(xù)表4 超聲預處理正交試驗結果及數(shù)據(jù)分析Continue table 4 Orthogonal test results for ultrasound pretreatment and data analysis

由表4可知，由正交試驗結果分析最優(yōu)水平為7號組合，即A3B1C3D2；按照極差R值的大小確定各因素的主次順序為RB＞RD＞RA＞RC。即影響黃秋葵籽油提取率因素的主次關系依次是超聲時間、超聲溫度、料液比、超聲功率；再根據(jù)k值分析得出的最佳水平組合為A3B3C2D2未出現(xiàn)在9組試驗中，因此增加驗證試驗，結果見表5。

表5 驗證試驗結果Table 5 Verification results

由表5可知，A3B1C3D2組合更優(yōu)于A3B3C2D2組合，因此得到超聲預處理最佳條件為料液比1∶7（g/mL）、超聲時間35 min、超聲功率70%、超聲溫度45℃，此條件下黃秋葵籽油提取率最高，為46.46%。

2.4 酶解試驗結果

2.4.1 酶解單因素試驗結果

2.4.1.1 加酶量對黃秋葵籽油提取率的影響

加酶量對黃秋葵籽油提取率的影響見圖7。

圖7 加酶量對黃秋葵籽油提取率的影響Fig.7 Effect of enzyme dosage on yield of okra seed oil

由圖7可知，當加酶量小于2.0%時，黃秋葵籽油提取率不斷升高，其原因可能是增加加酶量，酶與底物作用會更加充分，酶會分解細胞中脂蛋白、脂多糖，使油脂從物料中提取出來[20]。當加酶量大于2.0%時，黃秋葵籽油提取率略有下降，這是因為酶與底物反應達到最大平衡，多余的酶反而與油脂吸附，使油脂得率降低。因此，最佳加酶量為2.0%。

2.4.1.2 酶解時間對黃秋葵籽油提取率的影響

酶解時間對黃秋葵籽油提取率的影響見圖8。

圖8 酶解時間對黃秋葵籽油提取率的影響Fig.8 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield of okra seed oil

由圖8可知，隨著酶解時間的延長，黃秋葵籽油提取率逐漸增加；當酶解時間為4 h時，黃秋葵籽油提取率最高為44.67%；當酶解時間在4 h以后，黃秋葵籽油提取率出現(xiàn)下降趨勢。當酶解時間較短時，酶與底物反應不充分，提取率較低。隨著酶解時間的延長，酶與底物長時間進行充分反應，油脂提取率會提高，但持續(xù)延長酶解時間會增加提取成本，過長時間的酶解還會影響油脂的質(zhì)量[21]。因此，最佳酶解時間為4 h。

2.4.1.3 酶解pH值對黃秋葵籽油提取率的影響

酶解pH值對黃秋葵籽油提取率的影響見圖9。

圖9 酶解pH值對黃秋葵籽油提取率的影響Fig.9 Effect of enzymatic hydrolysis pH on yield of okra seed oil

由圖9可知，當酶解pH值小于7.0時，隨著酶解pH值增大，黃秋葵籽油提取率逐漸增加；當酶解pH值為7.0時，酶的活性最高，酶對底物作用效果明顯，黃秋葵籽油提取率最高為44.56%，當酶解pH值大于7.0時，黃秋葵籽油提取率出現(xiàn)下降趨勢。因此，最佳酶解pH值為7.0。

2.4.2 酶解正交試驗結果

酶解正交試驗結果見表6。

表6 酶解正交試驗結果及數(shù)據(jù)分析Table 6 Orthogonal test results for enzymatic hydrolysis and data analysis

由表6可知，由正交試驗結果分析最優(yōu)水平為4號組合，即A2B1C2D3；按照極差R值的大小確定各因素的主次順序為RA＞RB＞RC，即影響黃秋葵籽油提取率因素的主次關系依次是加酶量、酶解時間、酶解pH值；再根據(jù)k值分析得出的最佳水平組合為A2B2C2D3未出現(xiàn)在9組試驗中，因此增加驗證試驗，結果見表7。

表7 驗證試驗結果Table 7 Verification results

由表7可知A2B2C2D3組合更優(yōu)于A2B1C2D3組合，因此得到酶解最佳條件為加酶量2.0%、酶解時間4 h、酶解pH7.0，此條件下黃秋葵籽油提取率最高，為49.98%。

3 結論

試驗得到超聲波預處理條件為料液比1∶7（g/mL）、超聲時間35 min、超聲功率70%（總功率為500 W）、超聲溫度45℃，在此條件下黃秋葵籽油提取率為46.46%；酶解條件為加酶量2.0%、酶解時間4 h、酶解pH7.0，在此條件下黃秋葵籽油提取率為49.98%。