山羊RPL26基因生物信息學(xué)分析及對(duì)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的影響

張 浩，王 永*，李艷艷，羅 成，李 鑫，李志雄，朱江江，林亞秋*

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部/四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

羊肉不但口味鮮美，風(fēng)味獨(dú)特，而且富含蛋白質(zhì)和微量元素，是一種十分優(yōu)質(zhì)健康的肉類。羊肉作為食材，其口感和風(fēng)味是決定其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的關(guān)鍵，因此探究影響羊肉品質(zhì)的因素也成為分子育種的關(guān)鍵。在影響肉質(zhì)的多種因素中，肌內(nèi)脂肪含量占據(jù)著極重要的地位，不但直接影響著肉類的市場價(jià)格[1]，更直接影響到肉的風(fēng)味和嫩度[2]。脂肪沉積決定了肌內(nèi)脂肪含量，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化是肌內(nèi)脂肪沉積的重要途徑，脂肪細(xì)胞分化受多種基因和蛋白質(zhì)共同調(diào)控，而核糖體蛋白作為核糖體的關(guān)鍵組成部分，不僅在基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上發(fā)揮著重要作用，更決定著蛋白質(zhì)表達(dá)水平，在生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，明確山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制對(duì)改善羊肉品質(zhì)和風(fēng)味具有重要意義。

核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成進(jìn)程中的關(guān)鍵細(xì)胞器，由rRNA和核糖體蛋白(ribosomal protein，RP)組成，廣泛存在于多種細(xì)胞中，在細(xì)胞生物體生命進(jìn)程以及病理生理中發(fā)揮著重要作用[3]。核糖體蛋白發(fā)生突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血[4]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白不僅在構(gòu)成核糖體時(shí)發(fā)揮作用，同時(shí)還在細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮著多種生物學(xué)功能，如細(xì)胞增殖[5-7]、細(xì)胞凋亡[8]、DNA損傷[9]、細(xì)胞生長和分化等。李霞[10]發(fā)現(xiàn)，RPL9蛋白與SCD5(stearoyl-coA desaturase，SCD5)結(jié)合，有效地提高了SCD5的活性從而調(diào)節(jié)能量代謝。核糖體蛋白還通過直接影響蛋白質(zhì)的生物合成發(fā)揮其生物學(xué)功能，RPL26作為核糖體蛋白的一員可受UFM1(ubiquitin fold modifier 1，UFM1)泛素化修飾，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的生物合成[11]；同時(shí)，RPL26的泛素化修飾可以通過影響蛋白質(zhì)分泌從而影響血紅蛋白的產(chǎn)生[12]；也有研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白會(huì)直接影響細(xì)胞周期，Li等[13]發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中干擾KRS表達(dá)使核糖體蛋白R(shí)PL26和RPL29的表達(dá)特異性上調(diào)，而干擾RPL26和RPL29的表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯在G0/G1期，活性氧生成也受到抑制，促使細(xì)胞凋亡；目前關(guān)于RPL26的研究主要集中在細(xì)胞增殖和細(xì)胞的功能缺陷，但RPL26可能在山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化過程中所發(fā)揮的生物學(xué)功能仍不明確。

因此，本試驗(yàn)利用RT-PCR等技術(shù)擴(kuò)增山羊RPL26基因序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用RT-qPCR檢測其組織表達(dá)特性，并通過過表達(dá)山羊RPL26等手段明晰其在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化中的調(diào)控作用，為最終闡明脂肪沉積機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DMEM-F12、FBS、雙抗、TurboFect Transfection Reagent、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自賽默飛；pMD-19T、TRIzol、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ、Hind III快切酶、EcoR I快切酶、T4連接酶購自TaKaRa；2×Rapid Taq Master Mix酶、凝膠膠回收純化試劑盒購自南京諾唯贊；DL2000 DNA Mraker、核酸染料、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根；氨芐購自Biosharp。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山羊組織RNA獲取及cDNA反轉(zhuǎn)錄 試驗(yàn)動(dòng)物為3只健康且生長狀態(tài)良好的1周歲簡州大耳羊公羊，體重約50 kg，購自大哥大牧業(yè)。本試驗(yàn)取實(shí)驗(yàn)室前期凍存的心、肝、脾、肺、腎、背部皮下脂肪、腹部皮下脂肪、小腸、背最長肌、股二頭肌和臂三頭肌等組織，TRIzol法提取組織總RNA，電泳驗(yàn)證RNA完整性，測定RNA濃度及純度，取1 μg 總RNA利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄cDNA，5倍稀釋后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 山羊RPL26基因克隆 根據(jù)NCBI山羊RPL26基因預(yù)測序列(XM_005693558.3)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)克隆及定量引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成引物，引物信息見表1。以小腸組織cDNA為模板，PCR反應(yīng)總體系25 μL：2×Rapid Taq Master Mix酶 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA1 μL，ddH2O 9.5 μL；PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性15 s，50 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃完全延伸 5 min；4 ℃保存。電泳鑒定后切取目標(biāo)條帶純化回收，將回收片段連接到pMD-19T載體，連接體轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞：取100 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)涂到含氨芐抗性的固體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)10 h。挑取單一呈圓形的陽性菌落，菌液PCR鑒定單一正確的目的基因條帶后，送至擎科生物科技有限公司測序。

表1 引物信息

1.2.3 山羊RPL26生物學(xué)特性分析 利用ORF Finder預(yù)測山羊RPL26的開放閱讀框，結(jié)合SnapGene對(duì)山羊RPL26編碼的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測，NCBI對(duì)氨基酸進(jìn)行同源性分析，并利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分別用ExPASy、Net Phos3.1、NetNGlyc1.0Server和ExPASy Protscale對(duì)山羊RPL26蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、疏水性進(jìn)行預(yù)測，利用TMHMM、PSORTⅡ、SignaIP4.1 server、NPS@SOPMA、SWISS-MODEL對(duì)山羊RPL26蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)、細(xì)胞定位、信號(hào)肽、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白質(zhì)互作關(guān)系。

1.2.4 qPCR檢測山羊RPL26的組織表達(dá)特性 根據(jù)基因克隆得到的山羊RPL26基因CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)qPCR引物(表1)，qPCR反應(yīng)體系見表2。取“1.2.1”中獲得的組織cDNA樣品作為模板(n=3)，反應(yīng)體系為20 μL：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA1 μL，ddH2O 7 μL；PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，退火15 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。

1.2.5 山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞培養(yǎng) 取7日齡簡州大耳羊公羊背最長肌，剪碎后用膠原酶消化，采用差速貼壁法分離山羊原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，梯度冷凍后液氮中保存。37 ℃水浴迅速復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)室液氮凍存山羊原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，離心棄去凍存液，用含10% FBS和1‰雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基在37 ℃，50 mL·L-1CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時(shí)作為F1代，每48 h換液，細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)傳代，傳至F3接種于培養(yǎng)板，12孔板每孔4×104個(gè)，24孔板每孔2×104個(gè)。

1.2.6 山羊RPL26過表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)山羊RPL26序列，利用SnapGen分析序列中所包含的酶切位點(diǎn)，選擇Hind III和EcoR I作為酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)且克隆產(chǎn)物包含完整CDS區(qū)域的引物，引物見表1，以克隆獲得包含完整RPL26序列的pMD19-T質(zhì)粒為模板，PCR產(chǎn)物純化后與pCMV-eGFP質(zhì)粒分別酶切純化，并將純化產(chǎn)物利用T4連接酶16 ℃連接10 h，連接體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，送至擎科生物科技有限公司測序。

1.2.7 山羊RPL26過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 取構(gòu)建成功的山羊RPL26過表達(dá)載體測量濃度，按照12孔板每孔過表達(dá)載體1 μg、opti 200 μL、轉(zhuǎn)染試劑4 μL，24孔板減半，配置預(yù)混液，室溫孵育15 min后加入孔板，設(shè)置轉(zhuǎn)入pCMV-eGFP空載質(zhì)粒作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染12 h后換液為50 μmol·L-1油酸誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化2 d。

1.2.8 油紅O染色、DAPI染色和Bodipy染色 24孔板棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，孔中加入200 μL油紅染色30 min后PBS洗3遍后拍照，拍照后每孔加入1 mL異丙醇，吹打后轉(zhuǎn)至96孔板測量490 nm OD值；DAPI每孔100 μL，染色10 min后PBS清洗3遍，加入200 μL Bodipy染色后拍照，Bodipy和DAPI染色嚴(yán)格避光。

1.2.9 qPCR檢測RPL26過表達(dá)效率及成脂相關(guān)基因表達(dá)情況 12孔板棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗3遍，利用TRIzol裂解細(xì)胞，提取RNA，驗(yàn)證RNA完整性并反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄樣品5倍稀釋后qPCR檢測RPL26及成脂相關(guān)基因表達(dá)情況，反應(yīng)程序及反應(yīng)體系同“1.2.4”，引物信息和Tm值見表1。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法處理，以UXT為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)以“Mean±SEM”表示，用SPSS 24.0中One-way ANOVA進(jìn)行顯著性分析，P<0.05認(rèn)為差異顯著，P<0.01認(rèn)為差異極顯著，利用Graphpad prism 9.0繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 山羊RPL26基因克隆

以小腸組織的cDNA為PCR模板，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物片段符合預(yù)期目的產(chǎn)物大小，電泳驗(yàn)證結(jié)果見圖1A，目的基因RPL26的片段大小為544 bp，CDS區(qū)為438 bp(圖1B)。

2.2 山羊RPL26基因序列分析

2.2.1 山羊RPL26氨基酸特性分析 通過Expaxy在線分析工具分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼145個(gè)氨基酸，其中賴氨酸(Lys)含量最高，占16.6%(圖2A)。正電荷殘基數(shù)量15個(gè)小于負(fù)電荷殘基數(shù)量40個(gè)；不穩(wěn)定系數(shù)為48.52；脂肪性指數(shù)為72.41；親水性總平均值為-1.107(圖2B)，推測該蛋白質(zhì)為帶負(fù)電的不穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)。利用SignaIP4.1 server對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)無信號(hào)肽。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，包含7個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，一個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)；糖基化位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)6個(gè)O糖基化位點(diǎn)和一個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)。對(duì)山羊RPL26蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)(圖2C)，RPL26蛋白質(zhì)不具備跨膜結(jié)構(gòu)。RPL26蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位分析發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)有60.9%被預(yù)測在細(xì)胞核里，在細(xì)胞質(zhì)里有17.4%，在細(xì)胞骨架上有13.0%，而在線粒體和分泌系統(tǒng)的囊泡里均為4.3%(圖2D)。

2.2.2 山羊RPL26蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過NPS@SOPMA對(duì)山羊RPL26蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(圖3A)，該蛋白的無規(guī)則卷曲比例最大，為39.11%，α-螺旋占31.28%，延伸鏈占21.79%，β-折疊占7.82%。通過SWISS-MODEL預(yù)測的山羊RPL26的三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果(圖3B)印證了二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果。

A.RPL26蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(H代表α-螺旋；t代表β-轉(zhuǎn)角；c代表無規(guī)則卷曲；e代表延伸鏈)；B.山羊RPL26蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.3 山羊RPL26蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測 通過STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測山羊RPL26的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，顯示RPL26主要與RPL家族成員相互作用，包括RPL5、RPL7、RPL14、RPL27、RPL30、RPL34、RPL37和RPL37A(圖4)。

圖4 RPL26蛋白質(zhì)功能互作圖

2.2.4 山羊RPL26的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 山羊RPL26氨基酸序列在NCBI 進(jìn)行BLAST結(jié)果顯示(圖5A)，其與野牦牛(XP_014333435.1)、白尾鹿(XP_020724730.1)、彎角大羚羊(XP_040099330.1)、虎鯨(XP_004266909.2)、人類(AAA60279.1)、倭狐猴(XP_012630788.2)、短嘴鴉(XP_008627221.2)、鼠兔(XP_004594815.1)、田鼠(XP_005356535.1)、狗(XP_038288783.1)、大靈貓(XP_028627957.1)、雙峰駝(XP_010964263.1)、單峰駱駝(KAB1266413.1)、倭黑猩猩(XP_003828880.2)、矛尾魚(XP_006000768.1)的相似性皆大于95%，由此可見，RPL26基因在各物種之間保守性較高。根據(jù)山羊RPL26氨基酸序列，利用MEGA7.0繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5B)顯示，與山羊進(jìn)化關(guān)系最近的是大羚羊和綿羊，符合反芻動(dòng)物歸類的規(guī)律；其次是水牛，關(guān)系最遠(yuǎn)的則是虎鯨。

A.山羊與其它物種之間的RPL26氨基酸序列同源性數(shù)據(jù)；B.RPL26氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 山羊RPL26基因組織表達(dá)差異性分析

對(duì)山羊不同組織中RPL26的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析作圖(圖6)，山羊RPL26在各組織中均有表達(dá)，且表達(dá)水平不同。腹部皮下脂肪的表達(dá)水平最高，背部皮下脂肪略低于腹部皮下脂肪表達(dá)水平且不顯著，腹部皮下脂肪和背部皮下脂肪極顯著高于背最長肌等9種組織(P<0.01)，臂三頭肌、肺和腎的表達(dá)水平極顯著低于背最長肌，股二頭肌、心、肝(P<0.01)。

1.腹部皮下脂肪；2.背部皮下脂肪；3.背最長??；4.股二頭??；5.心；6.肝；7.小腸；8.脾；9.臂三頭肌；10.肺；11.腎

2.4 過表達(dá)RPL26促進(jìn)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化

過表達(dá)載體測序結(jié)果與山羊RPL26序列完全一致，轉(zhuǎn)染后檢測RPL26過表達(dá)效率約為67.4倍(圖7B)。通過油紅O染色與Bodipy染色觀察過表達(dá)RPL26后山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞成脂情況(圖7A)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)山羊RPL26后，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的脂滴明顯增多；分別對(duì)過表達(dá)RPL26后的成脂分化標(biāo)志基因和脂代謝基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RPL26后，成脂分化標(biāo)志基因Pref1表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)，C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01)，脂代謝基因LPL、AP2和FASN的表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01)。

A.Bodipy染色(400×)、DIPI染色(400×)、Merge(400×)、油紅O染色(大圖200×，小圖400×)；B.RPL26過表達(dá)效率；C.油紅O染色OD值；D.過表達(dá)RPL26對(duì)成脂標(biāo)志基因表達(dá)的影響；E.過表達(dá)RPL26對(duì)脂質(zhì)代謝基因表達(dá)的影響

3 討 論

脂肪組織作為生物體關(guān)鍵組成之一，發(fā)揮著供能保暖、分泌激素、減緩機(jī)械沖擊等多種功能[14-16]，同時(shí)，脂肪含量很大程度上決定了肉類的風(fēng)味和嫩度，因此，關(guān)注肌內(nèi)脂肪含量已成為改善肉質(zhì)的關(guān)鍵，脂肪沉積過程其實(shí)質(zhì)是脂肪細(xì)胞分化積聚脂滴的過程，因此，闡明脂肪細(xì)胞分化過程中的調(diào)控機(jī)制是改善肉質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。核糖體作為合成蛋白質(zhì)生物合成過程中的關(guān)鍵細(xì)胞器，廣泛存在于多種細(xì)胞中，同時(shí)與細(xì)胞的增殖和分化過程緊密相關(guān)[17-20]。核糖體蛋白是核糖體的關(guān)鍵組成，Warner和Mcintosh[21]認(rèn)為，核糖體蛋白不僅僅可以通過作為核糖體組成原件發(fā)揮作用，還可以通過與非核糖體發(fā)生互作，從而調(diào)控細(xì)胞的生理功能，而這一過程并不會(huì)影響到蛋白質(zhì)的合成。王家麒等[22]研究發(fā)現(xiàn)，SCD參與綿羊前體脂肪細(xì)胞分化，李霞[10]研究發(fā)現(xiàn)的人體RPL9基因編碼的蛋白與硬脂酰輔酶A去飽和酶5結(jié)合能有效地提高SCD5的活性進(jìn)而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，這兩者提示RPL26對(duì)脂肪沉積可能有著重要調(diào)控作用。本試驗(yàn)克隆得到山羊RPL26基因序列544 bp，其中CDS區(qū)全長為438 bp，共編碼145個(gè)氨基酸。RPL26在山羊和羚羊、綿羊具有高度的同源性，與生物進(jìn)化的規(guī)律相對(duì)應(yīng)。除此之外，與其他動(dòng)物同源性也高，也有研究指出RPL26在釀酒酵母中進(jìn)化十分保守[23]，表明該基因高度保守。山羊RPL26蛋白質(zhì)預(yù)測發(fā)現(xiàn)它沒有跨膜結(jié)構(gòu)；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，RPL26多分布在細(xì)胞核中，少數(shù)分布在細(xì)胞質(zhì)中，該蛋白沒有信號(hào)肽，推測它不是分泌型蛋白質(zhì)[24]；蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，主要以無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈的形式存在，三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白包含7個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)；糖基化位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)6個(gè)O糖基化位點(diǎn)和1個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)。

山羊RPL26組織表達(dá)譜顯示，RPL26在各組織廣泛表達(dá)，其中以腹部皮下脂肪和背部皮下脂肪表達(dá)量最高，極顯著高于背最長肌等9種組織，臂三頭肌、肺和腎的表達(dá)水平極顯著低于背最長肌，股二頭肌、心、肝。曾錦章等[25]在人的正常組織中檢測RPL26蛋白表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，其在大腸和心中表達(dá)量較高，在肌肉、小腸和肝中的表達(dá)量低于其他組織。這一研究結(jié)果與本研究結(jié)果存在相似及不同情況。在NCBI中豬的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(Gene ID: 100627662,)顯示，豬RPL26在脾中表達(dá)量最高，皮下脂肪次之，小腸中表達(dá)量較低。表明RPL26可能存在著物種間的高度保守。

RPL26在山羊腹部皮下脂肪和背部皮下脂肪中顯著高表達(dá)，提示山羊RPL26可能在脂肪組織中發(fā)揮著重要作用，為了明晰其在山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化中是否發(fā)揮作用。本試驗(yàn)過表達(dá)山羊RPL26后，發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂滴明顯增多、變大，并且成脂分化標(biāo)志基因Pref1表達(dá)水平極顯著下降，C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)水平極顯著上升，脂代謝基因LPL、AP2和FASN的表達(dá)水平極顯著上升。Pref1作為前脂肪細(xì)胞標(biāo)志物，在成脂分化前期高表達(dá)并抑制脂肪細(xì)胞分化，在脂肪分化過程中呈下降趨勢(shì)[26]；PPARγ和C/EBPα作為經(jīng)典的成脂分化標(biāo)志基因，在成脂分化過程中起著關(guān)鍵作用[27-29]，PPARγ在脂肪細(xì)胞分化過程中具有正向調(diào)控作用，且參與到機(jī)體的能量代謝以及胰島素抵抗，具有脂肪細(xì)胞專一性[30-31]，C/EBPα可以與多種脂肪分化相關(guān)基因相互作用，從而參與到細(xì)胞的增殖、分化和能量代謝等多個(gè)生物學(xué)進(jìn)程，是脂肪細(xì)胞分化過程中的核心調(diào)控因子[32]；C/EBPβ作為經(jīng)典的成脂分化標(biāo)志基因，可以激活C/EBPα和PPARγ并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，快速激活成脂相關(guān)基因的表達(dá)[28]；LPL的表達(dá)水平與脂質(zhì)沉積息息相關(guān)[33-34]，可以通過水解甘油三酯從而為機(jī)體提供游離脂肪酸[35]，同時(shí)，LPLmRNA表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)[36]。AP2和FASN分別參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)以及甘油三酯水解過程[35,37-39]，是脂肪細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中，青蒿琥酯可以通過抑制C/EBPα、AP2、FASN的表達(dá)水平及其磷酸化水平，從而抑制脂肪分化[40]。結(jié)合成脂分化標(biāo)志基因和脂代謝基因mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，表明過表達(dá)RPL26促進(jìn)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)積累。但山羊RPL26調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合雙熒光素酶系統(tǒng)來進(jìn)行闡明，本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行此部分研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)克隆獲得了山羊RPL26基因序列544 bp，CDS區(qū)長438 bp，編碼145個(gè)氨基酸，是一種定位于細(xì)胞核、沒有跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽、親水性且三級(jí)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì)。山羊RPL26在各個(gè)組織中廣泛表達(dá)，在腹部皮下脂肪表達(dá)量最高。過表達(dá)山羊RPL26促進(jìn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的脂滴聚集，同時(shí)伴隨著成脂相關(guān)標(biāo)志基因Pref1、C/EBPα、C/EBPβ和PPARγ的表達(dá)水平發(fā)生相應(yīng)變化。提示RPL26是山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)因子。