外源性神經(jīng)肽CART對大鼠海馬神經(jīng)元氧化應激的抵抗作用及機制研究

楊成迎，林海爛，黃子晴，王乃秀，汪 鍇，甘 玲,2*

(1.西南大學動物醫(yī)學院，重慶 402460；2.重慶市獸醫(yī)工程研究中心，重慶 402460)

在動物生長過程中，由于環(huán)境、營養(yǎng)及病原感染等因素引起的機體氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡，易導致機體出現(xiàn)氧化應激，從而損傷組織細胞[1]，極大地增加了動物疾病的發(fā)生率。哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化代謝非常活躍，是遭受氧化應激損傷較嚴重的部位，而腦海馬作為腦部結構重要的區(qū)域之一，不僅是應激損傷的重要靶點，同時，也通過表達大量的神經(jīng)肽參與對應激損傷的調(diào)控[2-3]。研究表明，當仔豬發(fā)生氧化應激時，海馬組織中神經(jīng)肽可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉錄因子(cocaine-and amphetamine-regulated transcript, CART)表達顯著下調(diào)[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，CART對中風、腦缺血等神經(jīng)元損傷有保護作用[5-7]。CART可通過促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達來增加神經(jīng)元的存活、增殖、遷移和分化[8-10]。同時，CART通過上調(diào)BDNF基因的表達，抑制了大鼠神經(jīng)元內(nèi)質網(wǎng)應激和神經(jīng)元的凋亡，但trkB免疫抗體可抑制該作用[11]。trkB是定位于線粒體內(nèi)膜上的BDNF受體[12]。由此推測，氧化應激引起仔豬腦海馬中CART的表達下調(diào)，可能會抑制BDNF/trkB信號通路，從而引起神經(jīng)元的凋亡，而補充外源性的神經(jīng)肽CART則可能通過上調(diào)BDNF/trkB通路抵抗氧化應激引起的海馬神經(jīng)元凋亡。為了驗證該假設，本研究擬采用過氧化氫誘導原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，以構建海馬神經(jīng)元氧化應激模型，并添加不同濃度的外源性CART處理海馬神經(jīng)元，通過檢測神經(jīng)元活力和ATP含量，篩選抵抗海馬神經(jīng)元氧化損傷的最佳CART處理濃度。隨后采用JC-1染色法檢測神經(jīng)元線粒體的膜電位，熒光定量PCR和Western blot技術檢測神經(jīng)元凋亡相關因子和trkB基因的表達變化，并分析其相關性，以探索外源性神經(jīng)肽抵抗海馬神經(jīng)元氧化應激的作用效果及分子機制，為神經(jīng)肽類動物應激調(diào)節(jié)劑的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生24 h以內(nèi)的SD大鼠(SPF級)購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑

bcl-2一抗、bax一抗、caspase-3一抗均購自Proteintech公司(中國)；trkB Antibody(一抗)購自于美國R&D SYSTEMS 公司；Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(二抗)購自Affinity公司；FITC Affinipure Goat Anti-mouse IgG(H+L)購自美國Earthox 公司(中國)；DAPI染色液購自北京四正柏公司；MTT試劑盒購自上海生工公司(中國)；ATP試劑盒、JC-1試劑盒購自碧云天公司(中國)；冰乙酸購自重慶川東化工有限公司。CART肽由合肥博肽生物科技有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 原代大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 剝?nèi)?4 h以內(nèi)的SD新生大鼠腦組織，分離其海馬并浸潤在100 mL·L-1FBS-DMEM-F12 培養(yǎng)基中剪碎、反復多次吹打及消化后，采用篩網(wǎng)(200目孔徑)過濾后，用適量 DMEM/F12(含100 mL·L-1FBS 胎牛血清)將單細胞懸液稀釋后，均勻接種在細胞瓶或 6 孔板中，進行海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，待大多數(shù)細胞開始貼壁后(2～4 h)，采用含 20 g·L-1B27、10 g·L-1L-谷氨酰胺及 10 mL·L-1雙抗(100 U·mL-1青霉素、100 g·mL-1鏈霉素)的 neurobasal TM-a培養(yǎng)基進行維持培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞變化，根據(jù)細胞生長情況，每隔2 d更換1/3～1/2的培養(yǎng)液。神經(jīng)元培養(yǎng)2 d 后加入阿糖胞苷(終濃度: 2 μg·mL-1)抑制膠質細胞增殖。采用 MAP2-GFAP 免疫熒光法鑒定神經(jīng)元的純度至少大于95%。

1.3.2 試驗分組和處理 在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7 d后，將神經(jīng)元分為5組，即對照組(Control)、過氧化氫組(H2O2)、H2O2+10 nmol·L-1CART組、H2O2+100 nmol·L-1CART組、H2O2+1 000 nmol·L-1CART組。每組3個重復。對照組不做處理，過氧化氫組用200 μmol·mL-1H2O2處理神經(jīng)元，孵育24 h。各CART組在H2O2處理的基礎上分別添加終濃度為10、100、1 000 nmol·L-1CART的培養(yǎng)液，孵育4 h。

1.3.3 神經(jīng)元活率、ATP含量及線粒體膜電位(ΔΨm)的檢測 將成功培養(yǎng)并處理好的神經(jīng)元，分別嚴格按照試劑盒說明書進行樣品收集并進行下一步檢測。采用MTT法檢測神經(jīng)元活率：將神經(jīng)元置于96孔板上培養(yǎng)，按試驗設計處理神經(jīng)元后，每孔加入10 μmol·L-1的MTT培養(yǎng)基，于37 ℃孵育24 h。移除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL Farmazan solubilization solution 37 ℃孵育10 min,于紫外可見分光光度計570 nm處檢測吸光度并計算神經(jīng)元活率。

采用化學發(fā)光儀檢測ATP含量：將處理好的樣品用ATP裂解液裂解神經(jīng)元，充分裂解后進行離心5 min(12 000 r·min-1，4 ℃)，收集上清液。將200 μL ATP檢測工作液加入檢測孔中消耗孔內(nèi)ATP，3～5 min后每孔加入20 μL待測樣品或稀釋過的ATP標準液，充分混勻并常溫孵育2 min。

采用化學發(fā)光儀測量相對光單位(RLU)的亮度：用熒光顯微鏡觀察JC-1熒光變化以確定ΔΨm：處理好的神經(jīng)元中加入JC-1染色工作，培養(yǎng)箱37 ℃ 孵育20 min。孵育結束后，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，并加入2 mL細胞培養(yǎng)液，在熒光顯微鏡下觀察線粒體膜電位的變化。

1.3.4 熒光定量PCR技術檢測凋亡通路相關基因的轉錄表達水平 采用 TRIzol法提取海馬神經(jīng)元的總RNA，并反轉錄制備cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量 PCR(RT-qPCR)技術檢測神經(jīng)元凋亡通路相關基因的轉錄表達水平，引物序列見表1。Real-Time PCR 的反應體系(20 μL)如下：SYBR Premix Ex Taq 10 μL；ROX Reference Dye 0.4 μL；PCR Forward Primer 0.4 μL；PCR Reverse Primer 0.4 μL；DNA 模板2 μL；ddH2O 6.8 μL。反應程序(兩步法)如下：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40個循環(huán)；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 ℃，15 s。采用 2-ΔΔCt相對定量法計算基因相對表達量。

表1 引物序列

1.3.5 Western blot技術檢測線粒體凋亡通路相關基因的翻譯表達水平 按照1 mL RIRP加入10 μL混合型蛋白抑制劑配制成裂解液，混勻后裂解神經(jīng)元，在冰上充分研磨并靜置30 min，吸取混合液進行離心30 min(12 000 r·min-1，4 ℃)，吸取上清置于1.5 mL EP管，-80 ℃凍存?zhèn)溆茫慌渲艬CA工作液，在OD562 nm下檢測吸光度值，制作標準曲線并計算各個樣品的濃度；加入Loading Buffer于每個待測蛋白樣品中，混合均勻后插在煮樣泡沫板上，于98 ℃熱處理10 min 使蛋白變性；后進行SDS-PAGE電泳(80 V，20 min，120 V，1 h)，然后轉膜至PVDF膜(200 mA，90 min)。采用5%脫脂奶粉室溫慢搖封閉1～2 h后，一抗室溫慢搖2 h或4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次10 min。在二抗室溫慢搖孵育1 h后，TBST漂洗3次，每次10 min，最后采用ECL發(fā)光液顯影。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0(IBM；New York City，NY，USA)軟件進行統(tǒng)計及顯著性及相關性分析，單因素方差分析檢驗進行組間差異比較分析。結果均以“平均值±標準誤(Mean ± SEM)”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 CART對氧化應激海馬神經(jīng)元活率和ATP含量的影響

如圖1，與對照組相比，H2O2組海馬神經(jīng)元活率和ATP含量均極顯著下降(P<0.01)；與H2O2組相比，添加10 nmol·L-1CART可以顯著提高海馬神經(jīng)元活率和ATP含量(P<0.05)，添加100和1 000 nmol·L-1CART組中神經(jīng)元活率和ATP含量均顯著高于H2O2組(P<0.05或P<0.01)，且顯著高于10 nmol·L-1CART添加組(P<0.05)。該試驗結果表明，與H2O2組比較，添加10 nmol·L-1CART能顯著抵抗氧化應激造成的海馬神經(jīng)元損傷，因此后續(xù)試驗添加10 nmol·L-1CART進行處理。

與Control比較，*P<0.05，**P<0.01；與H2O2比較，# P<0.05，## P<0.01；與H2O2+10 nmol·L-1 CART組比較，& P<0.05，&& P<0.01。下同

2.2 CART對氧化應激海馬神經(jīng)元線粒體膜電位的影響

與對照相比，H2O2組中線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)，在添加CART之后，線粒體膜電位顯著高于H2O2組(P<0.05，圖2)，表明氧化應激引發(fā)神經(jīng)元線粒體損傷，從而降低線粒體膜電位，而CART能穩(wěn)定線粒體膜電位，從而防止線粒體損傷引起神經(jīng)元凋亡。

A、B.對照組；C、D.H2O2組；E、F.H2O2+10nmol·L-1 CART組;G.線粒體膜電位柱形圖

2.3 CART對氧化應激海馬神經(jīng)元線粒體凋亡基因表達水平的影響

為進一步考察線粒體凋亡信號通路在CART抵抗氧化應激損傷中的介導作用，本研究采用熒光定量PCR技術檢測海馬神經(jīng)元中線粒體凋亡基因mRNA水平的變化。結果顯示，與對照組相比，H2O2組中抑凋亡基因bcl-2的mRNA水平極顯著降低(P<0.01)，促凋亡基因bax和caspase-3的mRNA 水平均極顯著增加(P<0.01)；與H2O2組比較，添加CART組中bax基因的mRNA水平顯著降低(P<0.05)，caspase-3基因的mRNA水平極顯著降低(P<0.01)，bcl-2基因的mRNA水平極顯著高于H2O2組(P<0.01)(圖3A)。采用Western blot技術進一步考察CART對氧化應激海馬神經(jīng)元凋亡基因蛋白質水平的影響。結果顯示，與對照組相比，H2O2組中caspase-3和bax的蛋白質水平顯著升高(P<0.05)，bcl-2的蛋白質水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2組比較，CART添加組中caspase-3和bax的蛋白質水平顯著降低(P<0.05)，bcl-2的蛋白質水平顯著升高(P<0.05)(圖3B、3C、3D、3E)，與基因轉錄表達水平一致，表明CART可以抑制H2O2誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡。

A.熒光定量PCR技術檢測結果；B、C、D、E.Western blot技術檢測結果

2.4 CART對氧化應激海馬神經(jīng)元trkB表達水平的影響

為考察BDNF/trkB信號通路是否參與了CART抗海馬神經(jīng)元氧化應激損傷的作用，本研究采用熒光定量PCR和Western blot技術檢測了海馬神經(jīng)元trkB的mRNA和蛋白質水平。結果顯示，與對照組相比，H2O2組中trkB的mRNA水平顯著降低(P<0.05)，H2O2+CART組中trkB的mRNA水平顯著高于H2O2組(P<0.05,圖4A)。對trkB的蛋白水平的檢測結果顯示，與對照組相比，H2O2組中trkB的蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+CART組中trkB蛋白水平顯著升高(P<0.05)，與mRNA表達水平變化一致。由此表明，CART可能通過trkB基因的表達調(diào)控凋亡蛋白基因的表達，從而抑制細胞凋亡，緩解氧化應激。

A.熒光定量PCR技術檢測結果；B、C.Western blot技術檢測結果

2.5 海馬神經(jīng)元trkB與凋亡相關蛋白、基因表達水平相關性分析

為了更好地顯示BNDF/trkB信號通路與凋亡信號通路之間的關系，本研究考察了trkB與凋亡信號通路相關的蛋白和基因表達水平之間的相關性。結果如圖5所示，在過氧化氫組，trkB與bax的mRNA及蛋白質水平呈顯著負相關(Pearson系數(shù)=-0.999 7；P=0.015 5)，與bcl-2基因的mRNA 水平呈顯著正相關(Pearson系數(shù)=0.996 9；P=0.049 8)，并與caspase-3的蛋白質水平呈顯著負相關(Pearson系數(shù)=-0.999 1，P=0.026 3)；在H2O2+CART組，trkB與bax的蛋白質水平呈顯著負相關(Pearson系數(shù)=-0.998 1；P=0.039 5)，與trkB與bcl-2的蛋白質水平呈正相關的趨勢(Pearson系數(shù)=0.995 1；P=0.063 3)。以上結果表明，trkB與凋亡相關蛋白和基因的表達呈顯著相關性，進一步提示BNDF/trkB信號通路在CART調(diào)節(jié)凋亡信號路徑抵抗氧化應激損傷中的介導作用。

A～C.在H2O2組，trkB與caspase-3、bax及bcl-2在mRNA水平的相關性; D～F.在H2O2+CART組，trkB與caspase-3、bax及bcl-2在mRNA水平的相關性; G～I.在H2O2組，trkB與caspase-3、bax及bcl-2在蛋白質水平的相關性; J～L.在H2O2+CART組，trkB與caspase-3、bax及bcl-2在蛋白質水平的相關性

3 討 論

氧化應激是引起機體細胞凋亡的重要原因，而線粒體損傷是其中的關鍵因素。線粒體是細胞的能量加工廠，其主要作用是為細胞的各種生命活動提供能量ATP[13]。線粒體膜是否完整對細胞正常發(fā)揮功能至關重要[14]。膜損傷后功能失調(diào)的線粒體產(chǎn)生ATP的效率較低，但產(chǎn)生ROS的效率較高[15-18]。由此可見，ATP是反映機體活細胞新陳代謝的一個重要指標，通過測定培養(yǎng)細胞ATP的含量可反映出細胞的活力和線粒體的完整性[19-20]。因此，本研究中過氧化氫誘導神經(jīng)元后降低的ATP含量及神經(jīng)元活率證實神經(jīng)元的線粒體受到了損傷。眾多研究表明，CART肽在抵抗腦組織的氧化損傷中發(fā)揮了重要的作用[21-23]。體外的研究也顯示，CART肽可降低缺氧和缺糖神經(jīng)元中的ROS水平，增加神經(jīng)元抗氧化性和線粒體活性[24]。與此相似，本研究添加不同劑量外源性神經(jīng)肽CART顯著提高了氧化應激大鼠海馬神經(jīng)元的活力及ATP水平，暗示神經(jīng)肽CART可能通過抵抗氧化應激對神經(jīng)元線粒體造成的氧化損傷來發(fā)揮作用。

線粒體膜電位由線粒體內(nèi)膜和外膜之間的不同離子電化學梯度產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，當細胞出現(xiàn)凋亡的第一個信號便是線粒體膜電位值(MMP)顯著降低[25-26]。JC-1作為一種常用的檢測MMP(ΔΨm)的理想熒光探針，可以檢測組織或細胞的線粒體膜電位。當線粒體膜電位較高時，JC-1呈聚合物狀態(tài)，聚集在線粒體基質中，可以產(chǎn)生紅色熒光；而在線粒體膜電位較低時，JC-1呈單體狀態(tài)，便不在線粒體基質中聚集，而發(fā)出綠色熒光。通過熒光顏色的轉變便可檢測線粒體膜電位的變化。因此，本研究中過氧化氫誘導的神經(jīng)元MMP顯著降低，表明線粒體膜的通透性變小，進一步證實過氧化氫誘導使神經(jīng)元的線粒體遭到損傷。Wang等[27]的研究結果顯示，與對照組相比，氧化應激狀態(tài)下的大鼠海馬神經(jīng)元MMP顯著下降，而他克莫司可以顯著抑制MMP的下降，從而保護神經(jīng)元免于凋亡。1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP +)在誘導SH-SY5Y細胞凋亡的同時，顯著降低了MMP，而經(jīng)過磷酸二酯酶4治療可阻礙MMP的下降，同時抑制細胞凋亡[28]，由此表明，MMP與神經(jīng)元凋亡之間呈正相關。研究發(fā)現(xiàn)，位于線粒體外膜的調(diào)節(jié)因子bcl-2家族蛋白、caspase系列蛋白、細胞色素C與細胞凋亡有密切的關系[29]。氧化應激將伴隨線粒體凋亡途徑關鍵蛋白caspase-3、bax及抗凋亡蛋白bcl-2基因的表達變化[30-32]。番茄紅素(lycopene，LYC)能使細胞中bax和caspase-3基因的表達水平顯著降低，而bcl-2基因的表達水平顯著升高[33]。因此，為了進一步考察神經(jīng)肽CART抵抗神經(jīng)元線粒體氧化損傷的分子機制，本研究考察了凋亡相關基因的表達變化。結果顯示，CART在顯著降低氧化應激海馬神經(jīng)元bax和caspase-3基因表達水平的同時，增加了bcl-2基因的表達，表明CART能顯著抑制神經(jīng)元凋亡，從而緩解海馬神經(jīng)元的氧化應激。

有文獻表明，trkB是腦源性營養(yǎng)因子(BDNF)的受體，位于線粒體內(nèi)膜[12,34]。trkB能通過調(diào)節(jié)細胞線粒體內(nèi)鈣離子的釋放，影響線粒體活性[35]，并且介導apelin-13、N-乙?；?-羥色胺(NAS)及丙咪嗪等多種藥物或抗氧化物質發(fā)揮抗凋亡的調(diào)節(jié)作用[36-38]。因此，為了考察trkB是否也介導了CART抵抗神經(jīng)元氧化損傷的作用過程，本研究檢測了trkB基因的表達變化，并與凋亡相關基因的表達變化做進一步相關性分析。結果發(fā)現(xiàn)，trkB基因與凋亡蛋白基因的表達具有顯著相關性，這相似于前人的研究報道NAS通過調(diào)節(jié)BNDF/trkB信號通路，抑制了bax和caspase-3基因的表達，并增強了bcl-2基因的表達，從而防止谷氨酸誘導HT-22細胞凋亡[38]，因此，進一步提示了trkB在CART調(diào)節(jié)凋亡信號路徑抵抗氧化應激損傷中的介導作用。

4 結 論

在本研究中，添加CART能顯著提高氧化應激海馬神經(jīng)元trkB基因的mRNA和蛋白質水平，且trkB與凋亡/抗凋亡相關基因的表達顯著相關，提示CART可能通過激活BDNF/trkB信號通路來改變膜電位，防止海馬神經(jīng)元凋亡，從而緩減氧化應激。

致謝：本研究感謝西南大學何寧佳和羅義維對qRT-PCR測定的平臺支持