• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    2017—2021年成都市貓細(xì)小病毒的檢測(cè)及其VP2基因的變異分析

    2022-04-24 02:52:04何欣怡
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2022年4期
    關(guān)鍵詞:成都地區(qū)細(xì)小毒株

    周 群,楊 苑,宋 鑫,何欣怡,曹 慧,張 斌,2*

    (1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,成都 610041;2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部/四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041)

    貓細(xì)小病毒(feline parvovirus, FPV)為細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬的成員,是引起貓和其他貓科動(dòng)物病毒性腹瀉的主要病原體之一[1]。臨床特征表現(xiàn)為高熱、嘔吐、腹瀉、白細(xì)胞減少及出血性急性腸炎,具有高發(fā)病率和死亡率[2]。

    FPV是體型最小的DNA病毒[3-4]。其基因組包含兩種蛋白:非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2,結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2[4-5]。VP2是構(gòu)成FPV衣殼蛋白的主要成分,約占病毒粒子的90%[5],決定了FPV在宿主范圍、血凝性和抗原性方面的特點(diǎn),在病毒感染過(guò)程中起關(guān)鍵性作用,常作為疫苗研發(fā)的靶抗原[3]。VP2蛋白氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)的突變常導(dǎo)致細(xì)小病毒感染發(fā)病機(jī)制和細(xì)胞嗜性發(fā)生改變,產(chǎn)生新的變異毒株,同時(shí)也常作為細(xì)小病毒分型的依據(jù)[6]。1965年首次從患病貓中分離出的FPV,目前已在全球范圍內(nèi)廣泛流行[7]。犬貓細(xì)小病毒密切相關(guān),可在各自的宿主中引起疾病[7-8]。VP2蛋白是決定犬細(xì)小病毒(canine parvovirus,CPV)和FPV抗原特性、宿主范圍和受體結(jié)合的關(guān)鍵蛋白,由于CPV VP2蛋白5~6個(gè)關(guān)鍵的氨基酸發(fā)生變化,使CPV新變體毒株(CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)獲得了新的宿主范圍,可同時(shí)感染貓和犬[6, 9-10]。

    目前,商品化的FPV疫苗已在全球各國(guó)廣泛應(yīng)用,但FPV仍然在世界各國(guó)流行,并未得到有效控制[11-14]。國(guó)內(nèi)對(duì)FPV的分子流行病學(xué)相關(guān)的調(diào)查研究較少,F(xiàn)PV在四川地區(qū)的流行情況和流行毒株的分子特征尚不明確[15-16]。本研究收集了來(lái)自成都市的168份貓腹瀉糞便樣本,用PCR方法進(jìn)行FPV檢測(cè),旨在明確成都地區(qū)FPV的流行情況及其分子特征,豐富我國(guó)FPV的流行病學(xué)資料,為研發(fā)新型有效的FPV疫苗提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病料的采集 2017-2021年從成都地區(qū)3家寵物醫(yī)院采集發(fā)病貓糞便樣本168份,病貓均表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、食欲廢絕和雙相熱等臨床癥狀。采樣并記錄發(fā)病貓的性別和年齡等信息(表1),將獲得的糞便樣本加入病毒保存液中,置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    表1 樣本信息及FPV檢出情況

    1.1.2 主要試劑與儀器 Quick Taq Hs DyeMix購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司;STE緩沖液、蛋白激酶K、DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa生物技術(shù)有限公司;E.coliDH5α購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;PCR核酸擴(kuò)增儀購(gòu)自Bio-Red有限公司。

    1.1.3 引物 參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[17],合成用于FPV檢測(cè)的引物FPV-F:GGATGGGTGGAAATCACAGC,F(xiàn)PV-R:ATAACCAACCTCAGCTGGTC。用于FPV VP2基因全基因組擴(kuò)增的引物VP2-F:TTTGAATTCATGAGTGATGGAGCAGTT,VP2-R:GGGCTCGAGTTAATATAATTTTCTAGG。擴(kuò)增片段分別長(zhǎng)度為845和1 755 bp。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 貓糞便樣本總DNA的提取 采用酚-氯仿法分別提取貓糞便樣本中的總DNA,提取完成后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 FPV的檢測(cè)與VP2全基因組擴(kuò)增 利用FPV檢測(cè)引物[17]對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的FPV陽(yáng)性樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物純化后與pMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒由上海生工生物有限公司雙向測(cè)序,將測(cè)序成功的陽(yáng)性質(zhì)粒10倍倍比稀釋至10-4后保存?zhèn)溆?。?68份樣本的DNA為模板,使用Quick Taq Hs DyeMix進(jìn)行FPV的檢測(cè)和VP2全長(zhǎng)的擴(kuò)增,具體操作步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行,每次PCR均設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆和轉(zhuǎn)化后送生工生物有限公司雙向測(cè)序,獲得FPVVP2基因全長(zhǎng)序列。

    1.2.3 細(xì)小病毒VP2基因遺傳進(jìn)化分析 將本研究獲得的細(xì)小病毒VP2基因全長(zhǎng)序列與GenBank中的38株國(guó)內(nèi)外經(jīng)典犬貓細(xì)小病毒株和5株犬貓細(xì)小病毒疫苗株的VP2基因參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用DNAstar中的MegAlign進(jìn)行同源性分析,利用MEGA7.0序列分析軟件,采用鄰近法(Bootstrap自舉值選擇1 000次)構(gòu)建系統(tǒng)遺傳發(fā)育樹。

    1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)卡方分析,使用非參數(shù)方法比較FPV檢出率在品種、年齡和性別方面的差異。通過(guò)Epi InfoTM7.2軟件進(jìn)一步估計(jì)差異的比值比(odds ratio, OR)及其95%置信區(qū)間(95% confidence interval, 95% CI)。雙因素ANOVA分析通過(guò)IBM SPSS Statistics 23.0進(jìn)行分析。相關(guān)P值分別為<0.05或<0.01,則認(rèn)為數(shù)值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性或高度顯著性。

    2 結(jié) 果

    2.1 FPV檢測(cè)結(jié)果與分析

    用PCR方法對(duì)168份貓糞便樣本進(jìn)行FPV檢測(cè)。結(jié)果顯示成都地區(qū)貓群中FPV感染率高,118份樣本檢出FPV陽(yáng)性,陽(yáng)性率為70.2%(95% CI=62.7%~77.0%)。如表2所示,F(xiàn)PV在雄性貓和雌性貓中檢出率分別為70.2%(33/47)、65.7%(23/35)。幼齡貓(≤6月齡)和成年貓(>6月齡)檢出率則分別為80.6%(29/36)和56.3%(27/48)。純種貓和混血貓的檢出率分別為68.5%(37/54)和67.7%(21/31)。結(jié)果顯示(表2),成都地區(qū)FPV的感染率與貓的年齡(P=0.02)顯著相關(guān),但與貓的性別(P=0.81)和品種(P=1)均不相關(guān)。

    表2 FPV的流行率與性別、品種和年齡的相關(guān)性

    2.2 FPV VP2基因同源性分析

    為進(jìn)一步了解成都地區(qū)FPVVP2基因的分子特征和遺傳變異,根據(jù)不同地區(qū)、生活環(huán)境和采樣時(shí)間選取13份FPV陽(yáng)性樣本測(cè)定其VP2基因,獲得13株FPVVP2基因全長(zhǎng)序列(SMU-D3、SMU-D4、SMU-D28、SMU-D18、SMU-D14、SMU-D46、SMU-D50、SMU-D53、SMU-D74、SMU-D87、SMU-F33、SMU-SC20-6和SMU-SC20-2(GenBank No.MZ442302-MZ442314)。本研究中13株毒株之間的核苷酸序列同源性為97.2%~100%,氨基酸序列同源性為97.4%~100%;與GenBank中43株VP2基因參考序列之間的核苷酸同源性為97.1%~100%,氨基酸序列同源性為97.1%~100%。值得注意的是,本研究中SMU-D18和SMU-D14兩株毒株與2株2019年中國(guó)報(bào)道的CPV毒株(GenBank No.MN473464.1、MN473463.1)同源性為100%,而與FPV毒株同源性為97.4%。氨基酸序列分析顯示(圖1),SMU-D18毒株和SMU-D14毒株VP2蛋白的第426位氨基酸為Asn,與new CPV-2a毒株一致;此外,本研究中SMU-D46毒株的VP2蛋白氨基酸序列存在Ser293Phe和Ser297Phe兩處獨(dú)特的突變,另外10株毒株VP2蛋白與參考毒株相比均無(wú)明顯的氨基酸突變。

    圖1 13株FPV毒株部分氨基酸序列比對(duì)圖

    2.3 FPV VP2基因遺傳進(jìn)化分析

    利用MEGA7.0軟件對(duì)13株FPVVP2基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析顯示(圖2),本研究所獲得的毒株11株為貓細(xì)小病毒(FPV),2株為貓?jiān)慈?xì)小病毒(CPV)。SMU-D18毒株和SMU-D14毒株與CPV聚為一個(gè)大的分支,與FPV親緣關(guān)系較遠(yuǎn),與中國(guó)CPV毒株(GenBank No.MN473464.1、MN473463.1)親緣關(guān)系最近,為貓?jiān)慈?xì)小病毒。另外11株FPV與GenBank中已知的細(xì)小病毒VP2基因序列在進(jìn)化樹中聚為3個(gè)不同的分支,本研究暫命名為G1、G2和G3。4株本研究中的毒株(SMU-D3、SMU-SC20-2、SMU-SC20-6和SMU-F33)與6株分別來(lái)自亞洲和歐洲的毒株聚為G1型分支;G2型分支由來(lái)自歐洲、亞洲和美洲的9株毒株組成;7株本研究中的毒株同屬于G3型,SMU-D46毒株單獨(dú)形成一個(gè)分支,SMU-D4和SMU-D53毒株與我國(guó)2019年分離的毒株BJ006(GenBank No.MT270585.1)親緣關(guān)系最近,SMU-D28、SMU-D87、SMU-D50和SMU-D74與4株我國(guó)分離的毒株在進(jìn)化樹的底端聚為一支。值得注意的是,貓細(xì)小病毒疫苗株Cu-4在系統(tǒng)發(fā)育樹中位于G2分支中,與我國(guó)流行的FPV毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

    ●.本研究中的毒株; ■.犬、貓細(xì)小病毒疫苗株

    3 討 論

    FPV具有高度傳染性,是嚴(yán)重危害貓科動(dòng)物所有成員的重大病原之一[7]。全球各國(guó)均有FPV的流行,但各國(guó)FPV的感染率差異較大,在28.4%~94.3%之間[11-14]。自首次分離以來(lái),我國(guó)常有關(guān)于FPV的報(bào)道,但近年來(lái)FPV在我國(guó)西南地區(qū)貓群中的流行情況仍不清楚[15-16]。本研究采集了168份貓腹瀉糞便樣本進(jìn)行FPV檢測(cè),檢出率為70.2%,遠(yuǎn)高于我國(guó)以往報(bào)道的FPV的檢出率(11.4%~38.4%)[16-17]。研究表明,F(xiàn)PV的檢出率與患病貓的臨床癥狀明顯相關(guān),腹瀉貓糞便樣本的檢出率明顯高于臨床健康貓糞便樣本[17],這可能是本研究FPV檢出率明顯高于其他地區(qū)的原因之一。與之前的研究一致,本研究中FPV的檢出率與患病貓的年齡顯著相關(guān),而與患病貓的性別和品種無(wú)顯著相關(guān)性[17]。

    在20世紀(jì)70年代后期,犬細(xì)小病毒2型(canine parvovirus-2, CPV-2)成為犬中的一種新病原體,原型CPV-2最初不能與貓轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合,因而不能感染貓[9]。然而,隨后出現(xiàn)并取代CPV-2的遺傳變異體CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c很快獲得了對(duì)貓的感染性,這些CPV-2新抗原變體VP2蛋白第300殘基均表現(xiàn)由Ala突變?yōu)镚ly,引起的疾病與貓泛白細(xì)胞減少癥無(wú)法區(qū)分[6,9-10]。1987年首次檢測(cè)到原型CPV-2a的一個(gè)新的遺傳變異體,在VP2氨基酸297殘基從Ser到Ala發(fā)生非同義替換,被命名為new CPV-2a型并且在全球范圍內(nèi)流行[6]。而本研究中SMU-D18和SMU-D14毒株與FPV毒株的同源性為97.4%,卻與new CPV-2a毒株同源性為100%,表明兩株毒株為new CPV-2a毒株感染貓,為貓?jiān)慈?xì)小毒株。

    有趣的是,同樣位于VP2氨基酸297殘基,本研究中的SMU-D46毒株發(fā)生了與CPV不同的由Ser到Phe突變,同時(shí)在293殘基處也發(fā)生了從Ser到Phe的獨(dú)特的突變。以往的研究表明,new CPV-2a突變Ser297Ala雖然位于B抗原表位上,但其不會(huì)改變變體的抗原性質(zhì)[6, 8, 18-20],推測(cè)其可能會(huì)影響病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合。然而,本研究SMU-D46毒株在293和297氨基酸位點(diǎn)均發(fā)生了同樣的突變,這是否會(huì)引起FPV抗原類型的改變還有待進(jìn)一步研究。表明new CPV-2a和FPV在我國(guó)貓群中共同流行[7],巨大的進(jìn)化壓力導(dǎo)致CPV和FPV新變體不斷出現(xiàn),提示研究者應(yīng)加強(qiáng)對(duì)CPV和FPV的監(jiān)測(cè)和防控。

    系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,本研究11株FPV毒株均與國(guó)內(nèi)毒株親緣關(guān)系較近,與GenBank中FPV參考毒株在進(jìn)化樹中聚為3個(gè)基因群,成都地區(qū)流行的FPV毒株分別位于G1和G3群中,兩個(gè)基因群遺傳關(guān)系相距甚遠(yuǎn),7株毒株在G3群中又分別聚為兩簇,提示成都地區(qū)FPV不僅流行率高,并且流行的毒株呈多樣性,這更加不利于FPV的防控。與同源性分析結(jié)果一致,SMU-D46毒株在G3群中單獨(dú)形成一個(gè)分支,與其他毒株表現(xiàn)出獨(dú)特的遺傳進(jìn)化關(guān)系。值得注意的是,不論是CPV還是FPV疫苗株均未與我國(guó)流行毒株聚為一支,急需重新評(píng)估市售商品化疫苗對(duì)我國(guó)流行毒株的保護(hù)率,及早研發(fā)針對(duì)我國(guó)新型流行毒株的有效疫苗。

    4 結(jié) 論

    本研究調(diào)查了2017-2021年FPV在四川成都地區(qū)的流行情況,豐富了四川成都地區(qū)FPV的流行病學(xué)資料。FPV在成都地區(qū)貓群中流行率遠(yuǎn)高于我國(guó)其他地區(qū),并且在VP2蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)存在突變,產(chǎn)生了新的變體,同時(shí)存在new CPV-2a毒株的感染。

    猜你喜歡
    成都地區(qū)細(xì)小毒株
    法國(guó)發(fā)現(xiàn)新冠新變異毒株IHU
    成都地區(qū)云水資源分布特征及其與降水的關(guān)系
    豬細(xì)小病毒感染的防治
    成都地區(qū)核桃低效林類型劃分及其改造技術(shù)
    我院及成都地區(qū)血栓通注射液不良反應(yīng)分析
    中成藥(2017年3期)2017-05-17 06:09:18
    成都地區(qū)近30年大霧的氣候特征分析
    犬細(xì)小病毒病(CPV)的診斷與治療
    廣西鴨圓環(huán)病毒流行毒株遺傳變異分析
    為善小 傳播愛(ài)——樂(lè)善好施從細(xì)小處開始
    海峽姐妹(2015年5期)2015-02-27 15:10:46
    牛傳染性鼻氣管炎IBRV/JZ06-3基礎(chǔ)毒株毒力返強(qiáng)試驗(yàn)
    精华霜和精华液先用哪个| 国产精品.久久久| 久久久久久久久久久丰满| 国产在线男女| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美bdsm另类| 一级毛片 在线播放| 我的女老师完整版在线观看| 身体一侧抽搐| 亚洲av二区三区四区| 国产成人精品一,二区| 久久精品国产a三级三级三级| 国产69精品久久久久777片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 久久99热这里只有精品18| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲精品视频女| 久久久久久久久久久免费av| 在线精品无人区一区二区三 | 中文字幕亚洲精品专区| 日本黄色片子视频| 青春草国产在线视频| 99久久精品国产国产毛片| 一二三四中文在线观看免费高清| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产综合精华液| 日韩欧美精品免费久久| 高清在线视频一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| xxx大片免费视频| 丰满少妇做爰视频| 男女那种视频在线观看| 色网站视频免费| 日本午夜av视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产精品久久久久久久久免| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产精品福利在线免费观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产精品一区二区在线观看99| 天堂网av新在线| 国产在线男女| 免费av不卡在线播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一区二区三区精品91| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久久欧美国产精品| 别揉我奶头 嗯啊视频| 婷婷色av中文字幕| 日韩亚洲欧美综合| 国产免费视频播放在线视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 黑人高潮一二区| 欧美bdsm另类| 日日啪夜夜撸| 色网站视频免费| 欧美+日韩+精品| 成年女人在线观看亚洲视频 | 国产成人精品久久久久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 下体分泌物呈黄色| av卡一久久| 综合色av麻豆| 国产精品三级大全| 99热网站在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 成人国产av品久久久| 午夜日本视频在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 大陆偷拍与自拍| 欧美人与善性xxx| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲国产日韩一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩欧美精品免费久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 97在线视频观看| 国产男人的电影天堂91| 亚洲av.av天堂| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美区成人在线视频| 女人久久www免费人成看片| 99re6热这里在线精品视频| 国产伦理片在线播放av一区| 国产淫语在线视频| 在线观看一区二区三区激情| 免费少妇av软件| 免费av观看视频| 精品酒店卫生间| 99视频精品全部免费 在线| 91久久精品电影网| 日本黄大片高清| 久热这里只有精品99| 成人一区二区视频在线观看| 欧美97在线视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲三级黄色毛片| 国产在线男女| 在线看a的网站| 日本与韩国留学比较| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| av在线天堂中文字幕| 亚洲精品日本国产第一区| 内地一区二区视频在线| 91精品一卡2卡3卡4卡| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产成人a区在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 91精品国产九色| 久久99热6这里只有精品| 乱系列少妇在线播放| 亚洲av免费高清在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久久久久国产a免费观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 少妇丰满av| 亚洲自拍偷在线| 成人黄色视频免费在线看| 激情五月婷婷亚洲| 丰满少妇做爰视频| 婷婷色av中文字幕| 夜夜爽夜夜爽视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产av码专区亚洲av| 久久久久久九九精品二区国产| 午夜福利高清视频| 又大又黄又爽视频免费| 欧美日韩在线观看h| 美女国产视频在线观看| 97在线视频观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产老妇伦熟女老妇高清| 干丝袜人妻中文字幕| 成年av动漫网址| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲在久久综合| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av国产av综合av卡| 一级毛片 在线播放| 日本爱情动作片www.在线观看| 99热6这里只有精品| 亚洲国产日韩一区二区| 九色成人免费人妻av| 国产乱来视频区| 免费大片黄手机在线观看| 久久99热这里只有精品18| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 18+在线观看网站| 久久精品国产自在天天线| 午夜老司机福利剧场| 欧美97在线视频| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲国产最新在线播放| 波多野结衣巨乳人妻| 日本色播在线视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 一个人看的www免费观看视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 色视频www国产| 亚洲经典国产精华液单| 一边亲一边摸免费视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 成人亚洲欧美一区二区av| 啦啦啦在线观看免费高清www| 日韩一区二区三区影片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩一区二区视频免费看| 精品人妻视频免费看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 波多野结衣巨乳人妻| 精品久久久久久久久亚洲| 国产在视频线精品| 日韩国内少妇激情av| 少妇人妻久久综合中文| 51国产日韩欧美| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 麻豆国产97在线/欧美| 又爽又黄无遮挡网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美国产精品一级二级三级 | 亚洲人与动物交配视频| 色网站视频免费| 天堂中文最新版在线下载 | 99热这里只有是精品50| av免费观看日本| 2021少妇久久久久久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 97超视频在线观看视频| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日韩欧美 国产精品| 亚洲色图综合在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 最新中文字幕久久久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久精品综合一区二区三区| 美女高潮的动态| 国产有黄有色有爽视频| 久久97久久精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美日韩精品成人综合77777| 男人和女人高潮做爰伦理| av在线亚洲专区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 少妇 在线观看| av天堂中文字幕网| 午夜亚洲福利在线播放| 看黄色毛片网站| 搡女人真爽免费视频火全软件| 男人和女人高潮做爰伦理| 不卡视频在线观看欧美| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产日韩欧美亚洲二区| 婷婷色综合大香蕉| 国产亚洲一区二区精品| 91久久精品电影网| 一区二区三区免费毛片| 内射极品少妇av片p| 精品午夜福利在线看| 久久久久久久大尺度免费视频| 中文天堂在线官网| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产色婷婷99| 男女那种视频在线观看| 色综合色国产| 人妻 亚洲 视频| 国产精品一区二区性色av| 国产亚洲91精品色在线| 在线免费十八禁| 联通29元200g的流量卡| 18+在线观看网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 天美传媒精品一区二区| 成年女人在线观看亚洲视频 | 内地一区二区视频在线| 免费看光身美女| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲精品456在线播放app| 大香蕉久久网| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | av在线蜜桃| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产亚洲一区二区精品| 日韩欧美一区视频在线观看 | 日韩欧美一区视频在线观看 | 伦理电影大哥的女人| 搡女人真爽免费视频火全软件| 色播亚洲综合网| 男人添女人高潮全过程视频| 黄片无遮挡物在线观看| 丝袜脚勾引网站| 国产伦理片在线播放av一区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 精品午夜福利在线看| 美女国产视频在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 少妇人妻久久综合中文| 久久精品人妻少妇| 国产熟女欧美一区二区| 日韩电影二区| 毛片一级片免费看久久久久| 中国三级夫妇交换| 午夜福利在线在线| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 热re99久久精品国产66热6| 在线 av 中文字幕| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 色播亚洲综合网| 91在线精品国自产拍蜜月| 高清av免费在线| 亚洲国产欧美人成| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 街头女战士在线观看网站| 国产黄片视频在线免费观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久久午夜欧美精品| 嫩草影院入口| 日韩成人伦理影院| 五月玫瑰六月丁香| 新久久久久国产一级毛片| 男的添女的下面高潮视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲在线观看片| 日韩伦理黄色片| 99久久精品国产国产毛片| 午夜免费观看性视频| 美女国产视频在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 日韩欧美 国产精品| 亚洲色图综合在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲综合色惰| 99热这里只有是精品在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品女同一区二区软件| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲av男天堂| 国产乱来视频区| 欧美精品一区二区大全| 一二三四中文在线观看免费高清| 特级一级黄色大片| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲最大成人av| 欧美成人午夜免费资源| 午夜日本视频在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久亚洲国产成人精品v| 久久99蜜桃精品久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 成人国产麻豆网| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产免费福利视频在线观看| 毛片女人毛片| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久久久久国产a免费观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 男人舔奶头视频| 老司机影院成人| 精品少妇黑人巨大在线播放| 五月伊人婷婷丁香| 久久精品国产亚洲网站| 成年女人看的毛片在线观看| 美女内射精品一级片tv| 人妻一区二区av| 成人国产麻豆网| 久久精品夜色国产| 高清午夜精品一区二区三区| 97热精品久久久久久| 国产又色又爽无遮挡免| 精品久久国产蜜桃| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影| 最近2019中文字幕mv第一页| 夫妻性生交免费视频一级片| 嫩草影院入口| 国产伦理片在线播放av一区| 久久影院123| 日本一本二区三区精品| xxx大片免费视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 69人妻影院| 联通29元200g的流量卡| 精品久久国产蜜桃| 国产大屁股一区二区在线视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av天堂中文字幕网| 久久久色成人| 两个人的视频大全免费| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 免费大片18禁| av专区在线播放| 国产成人精品婷婷| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩精品有码人妻一区| 国产亚洲一区二区精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 一个人观看的视频www高清免费观看| 在线播放无遮挡| 久久精品综合一区二区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲精品国产成人久久av| videos熟女内射| 国产成人91sexporn| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美 日韩 精品 国产| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久久色成人| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品久久久久久av不卡| 熟女av电影| 有码 亚洲区| 国产综合懂色| 久久久久久伊人网av| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲精品视频女| 99久国产av精品国产电影| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 伦精品一区二区三区| 男女国产视频网站| 精品人妻一区二区三区麻豆| 一级毛片 在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 美女高潮的动态| 黄片无遮挡物在线观看| 午夜激情福利司机影院| freevideosex欧美| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 在线天堂最新版资源| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 热re99久久精品国产66热6| 国内精品宾馆在线| 深夜a级毛片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美区成人在线视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 激情 狠狠 欧美| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久热精品热| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 91精品国产九色| 国产精品偷伦视频观看了| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 成人一区二区视频在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 精品视频人人做人人爽| 大码成人一级视频| 国产又色又爽无遮挡免| 搡老乐熟女国产| 色5月婷婷丁香| 一级毛片电影观看| 亚洲国产精品999| 国国产精品蜜臀av免费| 在线播放无遮挡| 精品久久国产蜜桃| 尾随美女入室| 久久久精品欧美日韩精品| 国产成人一区二区在线| 青春草亚洲视频在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 综合色丁香网| 亚洲成色77777| 欧美zozozo另类| 老司机影院毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产高清不卡午夜福利| 久久人人爽人人爽人人片va| 免费人成在线观看视频色| 久久精品综合一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一级a做视频免费观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 各种免费的搞黄视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 18禁动态无遮挡网站| 日日啪夜夜撸| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 中文欧美无线码| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产黄频视频在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| www.色视频.com| 黄色欧美视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 18+在线观看网站| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产精品国产av在线观看| 一级毛片电影观看| 国产在线男女| av国产精品久久久久影院| 岛国毛片在线播放| 在现免费观看毛片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久精品久久久久久久性| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 在线看a的网站| 亚洲精品第二区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 又爽又黄无遮挡网站| 免费观看a级毛片全部| 国产乱人偷精品视频| 久久久久久久久大av| 国产在线男女| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美最新免费一区二区三区| 午夜福利视频精品| 1000部很黄的大片| 久久久色成人| 欧美精品一区二区大全| 中文字幕制服av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美一区二区亚洲| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 日本爱情动作片www.在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 色播亚洲综合网| 国产高潮美女av| 午夜老司机福利剧场| 亚洲色图av天堂| 精品一区二区免费观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产美女午夜福利| 日韩强制内射视频| 久久99热6这里只有精品| 色综合色国产| 久久影院123| 九草在线视频观看| 婷婷色综合www| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产亚洲精品久久久com| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 免费看日本二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 精品国产三级普通话版| 国产中年淑女户外野战色| 中文天堂在线官网| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲av二区三区四区| 国产成人精品婷婷| 午夜精品国产一区二区电影 | 日本一二三区视频观看| 最近中文字幕2019免费版| 久久久久国产精品人妻一区二区| 51国产日韩欧美| 日日啪夜夜撸| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| www.色视频.com| 波多野结衣巨乳人妻| 在线观看免费高清a一片| 制服丝袜香蕉在线| 色视频www国产| 高清日韩中文字幕在线| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩av免费高清视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 春色校园在线视频观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| videos熟女内射| 久久ye,这里只有精品| 亚洲成人av在线免费| 久久久久网色| 久久精品国产自在天天线| 成年女人在线观看亚洲视频 | 波多野结衣巨乳人妻| 欧美成人a在线观看| 在线看a的网站| 特大巨黑吊av在线直播| 高清av免费在线| 色综合色国产| 最近的中文字幕免费完整| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 美女内射精品一级片tv| 午夜福利在线在线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久影院123| 插逼视频在线观看| 婷婷色av中文字幕| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产毛片a区久久久久| 日韩亚洲欧美综合| 在线观看一区二区三区| 午夜视频国产福利| 好男人视频免费观看在线| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 日本av手机在线免费观看| 日本黄大片高清| 亚洲人成网站在线播| 男女边吃奶边做爰视频| 大陆偷拍与自拍| 国产亚洲一区二区精品| 777米奇影视久久| 精品酒店卫生间| 久久久久国产精品人妻一区二区| 日日撸夜夜添| 特级一级黄色大片| 国产片特级美女逼逼视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| av专区在线播放| av国产久精品久网站免费入址| 免费高清在线观看视频在线观看| av在线老鸭窝| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 在线观看av片永久免费下载| 日日啪夜夜爽| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 久久久久久伊人网av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线观看一区二区三区| 97超碰精品成人国产| 大香蕉97超碰在线| 日韩精品有码人妻一区| 18+在线观看网站| 禁无遮挡网站| 成人国产麻豆网| 日韩成人伦理影院| 精品一区二区三区视频在线|