AK4在大鼠雄性生殖系統(tǒng)中的表達特點及應激反應機制

李 巖,李建遠

(煙臺大學生命科學學院,山東 煙臺 264005)

腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK)是普遍存在于動物、植物及微生物體內的單體酶,通過催化可逆的高能磷?；霓D移反應,維持細胞內腺苷酸組成的穩(wěn)定,并且可實現(xiàn)能量由生成部位向消耗部位傳遞[1-2]。迄今為止,在高等脊椎動物中已經發(fā)現(xiàn)了9種AK家族的同工酶 (AK1—AK9)[3]。AK家族各成員在細胞內的分布、組織表達特性和底物特異性等方面均有差異。

AK家族成員可廣泛參與細胞凋亡和應激反應。AK4是AK家族中唯一不具有催化活性的應激反應蛋白,其過表達可對應激狀態(tài)下的細胞起到保護作用,在應激條件下如缺氧、H2O2處理,AK4的mRNA和蛋白表達水平均顯著上調[4-6],AK4過表達的細胞系在應激狀態(tài)下的成活率明顯高于對照組。免疫共沉淀證明,AK4可能是通過與ADP/ATP轉化酶(ANT)相互作用來實現(xiàn)對細胞的保護作用[6]。此外,AK4基因在耐缺氧、抗腫瘤藥物耐藥、調節(jié)線粒體活性等方面發(fā)揮重要作用,并且AK4基因的表達水平在多種疾病中顯著上調[7-8]。因此,研究AK4在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中的生物學功能可為疾病的治療提供新的藥物靶點。

睪丸和附睪是高等動物精子發(fā)生、成熟并獲得運動和受精能力的重要雄性生殖器官,這些過程需要充足的能量供應[9-10]。本研究系統(tǒng)分析了AK4在成年雄性大鼠各組織及在不同周齡大鼠睪丸和附睪中的表達特點,并探究了AK4在雄性大鼠生殖系統(tǒng)中的應激調控機制,以期為深入探討雄性生殖系統(tǒng)中AK4在應激狀態(tài)下參與的信號通路提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性Sprague-Dawley大鼠(50只,體重均達到350～400 g)購買于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,動物許可證號 SCXK(魯)2019-0003,質量合格證流水號:1107261911003748。實驗動物飼養(yǎng)溫度20.0±2.0 ℃,相對濕度為 40%～70%,采用人工照明,且12 h/12 h 明暗交替的條件下適應7 d,期間自由飲食飲水。本研究動物實驗經過煙臺大學動物倫理委員會審查批準。

1.2 實驗試劑

Bouin′s固定液購自sigma公司。RNA提取試劑盒RNAiso Plus購自TaKaRa公司(D9108A)。ReverTra Ace 反轉錄酶購自日本TOYOBO公司(FSK-100)。PCR擴增試劑盒購自TaKaRa公司(DRR001A)。DL2000 DNA Marker 購于TaKaRa公司(D501A)。AK4抗體購自ProteinTech公司(13206-1-AP)。內參抗體GAPDH購自Santa Cruz公司(sc-25778)。阿霉素(注射用鹽酸多柔比星,國藥準字H20013334)購自輝瑞制藥有限公司。MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所(A003-1)。大鼠β-actin、AK4引物均由primer 5.0軟件設計,由上海生工生物有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列、Tm值及PCR擴增產物長度

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA提取 大鼠處死后迅速分離各組織,于液氮中凍存。各組織總RNA提取嚴格按照說明書步驟操作。分光光度計測定總RNA濃度及純度。

1.3.2 反轉錄及半定量PCR 取1μg總RNA作為反轉錄模板,利用ReverTra Ace試劑盒合成cDNA第一條鏈。以cDNA為模板,使用AK4和β-actin引物進行PCR擴增。操作步驟嚴格按照PCR擴增試劑盒說明書進行。

1.3.3 Western blot 大鼠各組織蛋白質提取步驟嚴格按照BCA蛋白提取試劑盒說明書進行。各組織取50 μg上樣,具體操作步驟參照文獻[11]。

1.3.4 大鼠睪丸、附睪熱應激模型的構建 將大鼠隨機分為兩組,對照組與熱應激組各8只。水合氯醛麻醉后,將熱應激組大鼠陰囊浸于42 ℃水浴中20 min,擦干后回籠,待恢復4 h后處死[12]。取睪丸、附睪組織分別用于RNA和蛋白質提取。對照組大鼠陰囊浸于室溫水浴中20 min,其余操作步驟同實驗組。

1.3.5 大鼠睪丸、附睪氧化應激模型的構建 將大鼠隨機分為3組,分別為對照組、2 mg/kg阿霉素組、3 mg/kg阿霉素組(每組各8只)。實驗組每周腹腔注射阿霉素,對照組注射生理鹽水,連續(xù)處理5周后處死[13]。取兩側睪丸和附睪組織,一側睪丸和附睪用Bouin′s固定液固定,用于組織形態(tài)觀察;另一側睪丸和附睪用于MDA含量的測定及RNA和蛋白質的提取。

1.3.6 蘇木素-伊紅(HE)染色 通過HE染色觀察組織形態(tài)。具體操作步驟參照文獻[13]。

1.3.7 MDA檢測 MDA含量測定方法嚴格按照試劑盒說明書進行。MDA含量計算公式為:MDA含量(nmol/mg)=[(樣本A532-樣本空白管A532)/(標準品A532-標準品空白管A532)]×10 nmol/mg樣品蛋白含量。

1.3.8 統(tǒng)計方法 所有實驗數(shù)據(jù)均采用EXCEL 2019、SPSS 18.0進行統(tǒng)計和初步分析。統(tǒng)計結果用平均數(shù)±標準差表示。未配對t檢驗用于表示組間的差異,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 AK4在成年雄性大鼠各組織中的表達譜

通過半定量RT-PCR方法檢測AK4 mRNA在成年雄性大鼠(18周齡)心、肝、脾、肺、腎、睪丸及附睪組織中的表達譜。如圖1(a)所示,AK4 mRNA在各組織中呈泛在表達模式,且在心臟組織中表達量較其他組織低。如圖1(b)所示,AK4 蛋白水平與mRNA表達譜一致,即在心臟組織中表達略低于其他組織。

圖1 AK4在成年雄性大鼠各組織中的表達譜

2.2 AK4在大鼠睪丸與附睪中的發(fā)育時序表達譜

通過半定量RT-PCR方法檢測AK4 mRNA在2周齡、3周齡、4周齡、5周齡、7周齡、9周齡及18周齡大鼠睪丸、附睪組織中的表達譜,如圖2所示,在睪丸組織中,AK4 mRNA水平從2周齡到4周齡逐漸上調,5周齡后表達趨于穩(wěn)定;在附睪組織中,AK4 mRNA在2周齡大鼠中不表達,從3周齡到4周齡表達逐漸上調,5周齡后表達基本趨于穩(wěn)定。如圖3所示,Western 結果表明,在睪丸組織中,AK4蛋白從2周齡到4周齡逐漸上調,5周齡后表達趨于穩(wěn)定;在附睪組織中,AK4蛋白在2周齡大鼠中不表達,從3周齡到4周齡表達逐漸上調,5周齡后表達基本趨于穩(wěn)定,與AK4 mRNA表達時序相吻合。

2.3 AK4在大鼠睪丸、附睪熱應激模型中的表達變化

采用半定量RT-PCR方法檢測AK4 mRNA和蛋白質在大鼠睪丸、附睪熱應激模型中的表達水平,結果表明,與對照組相比,熱應激大鼠模型中AK4 mRNA和蛋白質的表達水平均在睪丸、附睪組織中顯著上調(圖4)。

圖2 AK4 mRNA在大鼠睪丸與附睪中的發(fā)育時序表達譜

圖3 AK4 蛋白在大鼠睪丸與附睪中的發(fā)育時序表達譜

與對照組相比,*P<0.05。

2.4 AK4在大鼠睪丸、附睪氧化應激模型中的表達變化

通過腹腔注射阿霉素建立大鼠睪丸、附睪的氧化應激模型。HE染色對睪丸和附睪組織的氧化損傷程度進行了初步判斷。如圖5(a)所示,HE染色結果表明,與對照組相比,以2 mg/kg和3 mg/kg劑量連續(xù)腹腔注射阿霉素五周后,大鼠的睪丸組織形態(tài)受到嚴重破壞,且隨著注射劑量的增加，損傷程度增強。對照組大鼠睪丸精曲小管排列緊密,管壁有5～7層細胞,從管外側到中央分別為精原細胞、初級精母細胞、圓型精子細胞和長型精子細胞等不同發(fā)育期的生精上皮細胞,且細胞排列緊密,成熟精子豐富,間質和間質細胞無異常。隨著注射劑量的加大,睪丸廣泛性精曲小管生精細胞排列松散,結構紊亂,呈條索狀,僅剩2或3層細胞;部分精曲小管內見大量脫落細胞,且成熟精子數(shù)目減少。而附睪組織的形態(tài)結構未發(fā)生明顯變化(圖片不顯示)。

與對照組相比,*P<0.05。

脂質過氧化的產物MDA也可反映睪丸、附睪組織的氧化損傷程度。如圖5(b)、(c)所示,與對照組相比,2 mg/kg劑量組大鼠睪丸和附睪組織MDA含量增加近2倍,與對照組相比差異顯著(P<0.05);當注射劑量增加到3 mg/kg時,睪丸和附睪組織中MDA含量均升高2倍以上,與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

半定量RT-PCR及Western結果表明,與對照組相比,AK4 mRNA和蛋白在睪丸組織中的表達量隨注射劑量增加而顯著上調(P<0.05)(圖6),而在附睪組織中表達無明顯差異(圖片不顯示)。

與對照組相比,*P<0.05。

3 討 論

睪丸和附睪作為精子發(fā)生和成熟的場所，必須需要充足的能量來保證功能性精子的產生和正常的激素分泌。然而迄今為止,有關AK家族的成員在睪丸、附睪中的研究卻很少有文獻報道。因此系統(tǒng)地開展AK家族各成員在睪丸、附睪中的研究將有助于闡明其在精子發(fā)生和成熟過程中的生物學功能。本研究結果表明,AK4 mRNA和蛋白質在雄性成年大鼠各組織中呈泛在表達模式,推測AK4可能在各組織中起到一定的保護作用。AK4在大鼠睪丸與附睪中的表達水平隨發(fā)育過程的進行呈現(xiàn)出規(guī)律性變化:在睪丸組織中,AK4 mRNA和蛋白質從2周齡開始表達,至5周齡后表達趨于穩(wěn)定;在附睪組織中,AK4 mRNA和蛋白質從3周齡開始表達,至5周齡后表達趨于穩(wěn)定,推測激素水平是影響發(fā)育進程中AK4表達趨勢變化的主要因素,有待深入研究。

AK4作為應激調節(jié)蛋白可廣泛參與應激反應過程。小鼠ATDC5細胞在缺氧條件下,AK4 mRNA的表達量上調[4]。另外通過cDNA陣列分析發(fā)現(xiàn),AK4 mRNA的表達量上調的現(xiàn)象也同樣存在于氧化應激狀態(tài)下的血管平滑肌細胞中[14]。此外有文獻報道四種肝臟毒性藥物(撲熱息痛、胺碘酮、四環(huán)素,氯仿)可導致AK4蛋白表達水平上調[3]。越來越多的數(shù)據(jù)表明,AK4在惡性腫瘤中過表達,雖然其表達特點與大多數(shù)腫瘤的分期尚無明確關系,但AK4的過表達可顯著促進腫瘤的增殖、侵襲和遷移,并且改變腫瘤對治療的敏感性,且過表達多提示預后不良和生存期較短。故AK4可以作為判斷惡性腫瘤預后的指標并有望成為治療腫瘤的潛在靶點,其臨床價值值得深入研究[15]。

在雄性生殖系統(tǒng)中存在著眾多嚴重影響精子質量的應激狀態(tài),如氧化應激、熱應激等。在氧化應激條件下,高水平的自由基可以直接氧化損傷精子的質膜,大大降低精子的運動及精卵結合能力,并破壞精子頭部DNA的完整性,引起遺傳缺陷,最終將會導致雄性不育[16]，而長期暴露于高溫環(huán)境中可造成精子數(shù)目減少、活力降低且畸形精子數(shù)目增多[17-18]。為了確定AK4是否是雄性生殖系統(tǒng)中的應激狀態(tài)下的標志蛋白,本研究選擇高溫和阿霉素作為引起生殖系統(tǒng)應激狀態(tài)的誘導因素,分別建立了雄性大鼠睪丸和附睪的熱應激模型和氧化應激模型。在熱應激模型中,與對照組相比,AK4 mRNA和蛋白質表達量在睪丸和附睪組織中明顯上調。阿霉素是一種蒽環(huán)類抗腫瘤類藥物,在消滅腫瘤細胞的同時具有較強的細胞毒性,特別是對于睪丸組織,因其含有大量細胞分裂旺盛的精原細胞和各級精母細胞等。已有文獻報道阿霉素造成生殖系統(tǒng)毒性主要是通過產生大量氧自由基導致,而大量的自由基可導致生殖系統(tǒng)嚴重的氧化損傷[19-20]。在氧化應激模型中,睪丸組織形態(tài)受到嚴重破壞,且隨注射劑量的增加損傷程度增強。另外,脂質過氧化的產物MDA也可反映組織的氧化損傷程度。在模型中,睪丸和附睪組織中MDA水平均顯著增加。與此同時,AK4 mRNA和蛋白在睪丸組織中的表達量隨注射劑量的增加而明顯上調。而附睪組織的形態(tài)和AK4的表達水平與對照組相比未發(fā)生明顯變化。因此推測在大鼠雄性生殖系統(tǒng)中,熱應激及氧化應激條件下AK4的過表達可降低外界不利因素對睪丸中生殖細胞的有害影響,對生殖細胞起到一定的保護作用。應激狀態(tài)下AK4參與保護細胞的生物學機制有待于深入研究。

本研究對AK4在大鼠雄性生殖系統(tǒng)中的表達特點及應激反應中的表達變化進行了系統(tǒng)性研究,為闡明AK4在雄性生殖系統(tǒng)中功能以及在應激狀態(tài)下參與的信號通路提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。