豬ANXA2 基因多態(tài)性及組織表達(dá)差異分析

盧 鴻，李新荻，王 宇，羅布白珍，段夢(mèng)琪，葉幼榮，張 健，商 鵬

（1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2. 西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏林芝 860000；3. 林芝市巴宜區(qū)畜牧獸醫(yī)總站，西藏 林芝 860000）

隨著對(duì)食品健康營養(yǎng)安全的重視，人們對(duì)肉品質(zhì)的要求越來越高，脂肪組織是影響豬肉品質(zhì)的一大因素[1]，直接影響豬生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益[2]。因此，對(duì)豬脂肪組織的生長發(fā)育及代謝調(diào)控研究具有重要意義。

膜聯(lián)蛋白是一種與Ca2+和脂質(zhì)結(jié)合密切相關(guān)的蛋白質(zhì)家族[3]，存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的不同位置[4]，與多種膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用，參與鈣離子通道形成、細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等細(xì)胞生理活動(dòng)[5?6]。膜聯(lián)蛋白家族由12 個(gè)進(jìn)化保守且結(jié)構(gòu)相關(guān)的Ca2+和磷脂結(jié)合蛋白組成，所有的膜聯(lián)蛋白都具有一個(gè)高度保守的中心結(jié)構(gòu)域，可以通過Ca2+介導(dǎo)的方式與細(xì)胞磷脂可逆的結(jié)合[7]。膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2，ANXA2）屬于膜聯(lián)蛋白（Annexins）家族A 亞家族的成員之一，包含一個(gè)中央域和一個(gè)N端中央域，其中包含與鈣離子、磷脂等其他物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)[8?11]。近年來，ANXA2基因?qū)χ居绊懛矫娴难芯恐饾u凸顯。付睿倚[12]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究北京油雞肌肉發(fā)育和肌內(nèi)脂肪沉積的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ANXA2基因是調(diào)控脂類代謝的關(guān)鍵基因；周揚(yáng)[13]利用二代高通量測序技術(shù)分別對(duì)胎牛、成年公牛、成年母牛和成年閹牛皮下脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，ANXA2基因在脂肪組織內(nèi)表達(dá)量較高。此外，ANXA2基因還在人類和嚙鼠的脂肪組織中表達(dá)[14?16]。另有研究表明，在豬的輸卵管中，ANXA2基因與精子結(jié)合有關(guān)[17]；ANXA2蛋白與豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP9 的相互作用有益于病毒復(fù)制[18]。

藏豬是我國特有的能適應(yīng)高原環(huán)境的一個(gè)重要品種[19]，有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性、抗病力強(qiáng)、耐粗飼、肉嫩味美，素有“高原之珍”的美譽(yù)[20]。有研究表明，藏豬和大約克豬的背膘厚、瘦肉率、肌內(nèi)脂肪含量等存在明顯差異[21?22]。鑒于此，對(duì)ANXA2基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）及組織表達(dá)差異分析，探究ANXA2基因?qū)Σ刎i脂肪沉積的影響，旨在為藏豬的分子育種研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 以西藏農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實(shí)習(xí)牧場和林芝宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司養(yǎng)殖基地飼養(yǎng)的藏豬（TP）、大約克豬（YY）為研究對(duì)象。采集藏豬和大約克豬的耳組織樣品，置75%乙醇中，-20 ℃保存，用于DNA 提取。屠宰180 日齡的藏豬和大約克豬，分別采集肝臟、腹脂及背脂組織，立即放入RNA保存液，液氮速凍，返回西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室放于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)RNA提取。

1.1.2 主要試劑與儀器 RNase-Free ddH2O、Fastking cDNA 第 一 鏈 合 成 試 劑 盒、2×PowerTaqPCR Master Mix（Bioteke Gorporation 公 司 生 產(chǎn)）、Super Real PreMix Plus（SYBR Green）等均購自天根生化科技（北京）有限公司；Trizol 試劑購自Thermo Fisher Scientific公司（美國）。

PCR 儀購自北京奧秘佳得醫(yī)藥科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自上海土森視覺科技有限公司。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA制備

采用苯酚-氯仿法從藏豬和大約克豬的耳組織樣品中提取DNA，將其溶解在RNase-Free ddH2O中，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證DNA 的質(zhì)量，用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)檢測DNA 的濃度，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Trizol 法提取肝臟、腹脂及背脂組織的RNA，將其溶解在RNase-Free ddH2O 中，用Nano?Drop 2000 分光光度計(jì)檢測RNA 的濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA 的質(zhì)量，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Fastking cDNA 第一鏈合成試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)檢測cDNA的濃度，所得cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

1.3.1 SNP 篩選引物設(shè)計(jì)與合成 登錄GenBank，下載ANXA2基因（登錄號(hào):NC_010443）序列。采用Primer Premier 5.0 軟件和NCBI 在線引物設(shè)計(jì)相結(jié)合的方式設(shè)計(jì)ANXA2基因5′側(cè)翼區(qū)的引物，序列見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，4 ℃保存。

表1 豬ANXA2基因SNP篩選引物信息Tab.1 The primer information for SNP screening in pig ANXA2 gene

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的引物設(shè)計(jì)與合成

首先在NCBI官網(wǎng)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載豬ANXA2基因的mRNA 序列，選取DRAP1（登錄號(hào)：XM_0031225183）作為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì)，信息見表2。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，于4 ℃保存。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物信息Tab.2 The primer information for real-time fluorescence quantitative PCR

1.4 ANXA2基因PCR擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增體系20 μL：DNA 模板1 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL，上、下 游 引 物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×PowerTaqPCR Master Mix 10 μL。

PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共36 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測合格的PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.5 基因頻率與基因型頻率檢測、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

選取藏豬和大約克豬各10頭，采用Sanger測序法對(duì)ANXA2基因的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行混池測序，采用DNAMAN 6.0、Chromas Pro 軟件相結(jié)合的方式對(duì)混池測序結(jié)果進(jìn)行分析，篩選SNP 位點(diǎn)；針對(duì)所篩選出的SNP 位點(diǎn)擴(kuò)大個(gè)體測序，計(jì)算基因型頻率與基因頻率。應(yīng)用在線預(yù)測軟件JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）對(duì)ANXA2基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

以ANXA2基因cDNA 為模板，選用DRAP1為內(nèi)參基因，每個(gè)待測的藏豬和大約克豬樣品各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

PCR 反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算ANXA2基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Sigma plot 軟件對(duì)ANXA2基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行雙因素（品種和組織）分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差作圖，并利用SPSS 25.0 軟件對(duì)ANXA2基因表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析；運(yùn)用Excel 軟件計(jì)算各個(gè)突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率，使用卡方檢驗(yàn)對(duì)ANXA2基因的基因型頻率和基因頻率進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ANXA2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，有長約915 bp 的清晰條帶（圖1），與目的條帶片段大小相符，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物滿足后續(xù)測序質(zhì)量要求。

圖1 藏豬和大約克豬ANXA2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification products of ANXA2 gene from Tibetan pigs and Yorkshire pigs

2.2 不同組織ANXA2基因相對(duì)表達(dá)量變化

ANXA2基因在藏豬和大約克豬的肝臟、腹脂、背脂的mRNA 相對(duì)表達(dá)量結(jié)果見圖2。在肝臟中，ANXA2基因在藏豬和大約克豬上的表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）；在背脂和腹脂中，ANXA2基因在藏豬中的表達(dá)量均極顯著低于大約克豬（P<0.01）。

圖2 ANXA2基因在藏豬、大約克豬的肝臟、腹脂和背脂中mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative mRNA expression levels of ANXA2 gene in liver，abdominal fat and back fat of Tibetan pigs and Yorkshire pigs

2.3 ANXA2基因型頻率和等位基因頻率分布

測序結(jié)果（圖3）顯示，ANXA2基因共有g(shù).111574291G>A、g.111574499C>T、g.111574522G>C和g.111574638A>G 4個(gè)突變位點(diǎn)。

圖3 ANXA2基因5′側(cè)翼區(qū)SNP篩選Fig.3 SNP screening of ANXA2 gene in 5′flanking sequencing

突變位點(diǎn)g.111574291G>A，在藏豬中存在GG型、GA 型，在大約克豬中存在GG 型、GA 型、AA 型，G基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因；突變位點(diǎn)g.111574499C>T，在藏豬中存在CC 型、CT 型，在大約克豬中存在TT型、CT 型、CC 型，C 基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因；突變位點(diǎn)g.111574522G>C，在藏豬和大約克豬中均存在GG型、GC 型，G基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因；突變位點(diǎn)g.111574638A>G，在藏豬中存在GG 型、AA 型和AG型，G 基因優(yōu)勢(shì)等位基因，在大約克豬中存在GG型、GA型、AA型，A基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。

基因型頻率、基因頻率及卡方檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示，ANXA2基因4 個(gè)突變位點(diǎn)（g.111574291G>A、g.111574499C>T、g.111574522G>C 和g.111574638 A>G）均符合哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡，在藏豬和大約克豬中，g.111574291G>A 突變位點(diǎn)存在顯著差異（P<0.05），g.111574499C>T、g.11157452 2G>C 和g.111574638A>G 這3 個(gè)突變位點(diǎn)存在極顯著差異（P<0.01）。

表3 ANXA2基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率Tab.3 ANXA2 gene polymorphism loci genotype frequency and gene frequency

2.4 ANXA2基因轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測結(jié)果

通過在線預(yù)測軟件JASPAR 分析可知，ANXA2基因g.111574291G>A 位點(diǎn)突變前存在6 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，突變后存在1 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，有5 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子消失；g.111574638A>G 位點(diǎn)突變前存在1 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，突變后消失；g.111574522G>C 位點(diǎn)突變前后轉(zhuǎn)錄因子無變化；g.111574499C>T 位點(diǎn)突變前存在3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，突變后有2 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子消失，新增3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，為Arid3a、CUX1和CUX2。

3 結(jié)論與討論

本研究在ANXA2基因5′側(cè)翼區(qū)篩選到4 個(gè)新的SNP 位點(diǎn)（g.111574291G>A、g.111574499C>T、g.111574522G>C和g.111574638A>G）。轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測發(fā)現(xiàn)，g.111574499C>T 位點(diǎn)堿基突變后出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄因子Arid3a、CUX1、CUX2。其中，Arid3a 蛋白為ARID 家族的一員，是序列特異性的轉(zhuǎn)錄因子，有靶向結(jié)合啟動(dòng)子的功能，在細(xì)胞生長發(fā)育和分化中有重要作用[23]。CUX 又稱為Cut-like（CUTL），屬于轉(zhuǎn)錄因子同源結(jié)構(gòu)域CCAAT 置換蛋白（CCAAT displacement protein，CDP）家族的成員，常常作為轉(zhuǎn)錄激活因子或轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用[24]。在高等脊椎動(dòng)物體內(nèi)，CUX 存在CUX1 和CUX2 兩種基因[25]。CUX1 是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，參與許多細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄抑制[26]，可以調(diào)節(jié)與脂肪質(zhì)量相關(guān)基因的表達(dá)[27]。還有研究表明，Arid3a與CUX相互作用，通過結(jié)合促進(jìn)劑和增強(qiáng)子相關(guān)基質(zhì)附著區(qū)域（MARS）來調(diào)節(jié)免疫球蛋白重鏈（IGH）基因轉(zhuǎn)錄[28]。推測Arid3a 與CUX 也有可能相互作用，通過某種機(jī)制調(diào)控ANXA2基因的表達(dá)，從而影響豬的脂肪代謝。

本研究中，ANXA2基因在藏豬背脂和腹脂中的表達(dá)量均極顯著低于大約克豬（P<0.01），推測ANXA2基因促進(jìn)豬的脂肪代謝。有研究表明，在白色脂肪組織的內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中，ANXA2蛋白能結(jié)合抑制素和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體CD36，從而提高機(jī)體對(duì)脂肪酸的攝取，而且還能使脂肪酸從內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)輸?shù)街炯?xì)胞，ANXA2基因的表達(dá)與脂肪沉積有關(guān)[29]，與本研究結(jié)果一致。另有研究表明，ANXA2基因在奶牛脂肪組織代謝調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[30?31]。藏豬是脂肪型豬種，大約克豬是瘦肉型豬種。本研究中，ANXA2基因在藏豬背脂和腹脂中的表達(dá)量均極顯著低于大約克豬，可能是因?yàn)榇蠹s克豬作為非高原豬種，長期處于高原環(huán)境下，由于體力活動(dòng)的變化增加了所需的Ca2+水平，促進(jìn)了ANXA2基因的表達(dá)，有利于ANXA2 蛋白與其他分子結(jié)合[32]。據(jù)此推測，g.111574499C>T 位點(diǎn)可能是調(diào)控ANXA2基因表達(dá)的關(guān)鍵功能位點(diǎn)，突變導(dǎo)致ANXA2基因負(fù)向調(diào)控脂肪沉積。與本研究中ANXA2基因在藏豬的腹脂和背脂中的表達(dá)情況一致，但具體調(diào)控機(jī)制和功能仍需進(jìn)一步研究。

綜上，ANXA2基因在藏豬和大約克豬的背脂和腹脂的表達(dá)量存在極顯著差異，對(duì)篩選出的突變位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，發(fā)現(xiàn)突變后產(chǎn)生了新的轉(zhuǎn)錄因子，新的轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞生長發(fā)育和分化中發(fā)揮重要作用。推測ANXA2基因可能是調(diào)控脂肪沉積和脂肪代謝的重要候選基因。