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    硫化氫對(duì)植物根系生長(zhǎng)及組蛋白去乙酰化酶的影響

    2022-04-23 02:42:36裴鋅鋅陳虹宇劉華杰
    河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:主根乙?;?/a>擬南芥

    裴鋅鋅,陳虹宇,李 曉,劉華杰,李 華

    (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州450002)

    硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后被發(fā)現(xiàn)的第3 種氣體信號(hào)分子,高濃度的H2S 可抑制線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶的活性,是細(xì)胞代謝的毒性物質(zhì),低濃度H2S 對(duì)細(xì)胞生理功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[1?2]。YANG 等[1]研究發(fā)現(xiàn),H2S 在動(dòng)物體內(nèi)可以內(nèi)源產(chǎn)生,并且可通過(guò)血管平滑肌細(xì)胞上的三磷酸腺苷敏感性鉀通道(Adenosine triphosphate?sensitive potassium,KATP)調(diào)節(jié)血壓。在植物中,H2S 可調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)、種子萌發(fā)、根系發(fā)育、衰老、果實(shí)后熟等[3]諸多種生理過(guò)程,還能響應(yīng)各種生物和非生物(干旱、鹽、重金屬、高溫等)脅迫[4?5]。在植物根系中,H2S 對(duì)植物根系的調(diào)節(jié)一般具有濃度依賴性,隨著NaHS(H2S 供體)濃度的不斷增加,黃瓜根系長(zhǎng)度和數(shù)目均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)[6],番茄的側(cè)根長(zhǎng)度和密度也具有相同趨勢(shì)[7],并且H2S對(duì)番茄側(cè)根生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用與過(guò)氧化氫和甲烷信號(hào)途徑有關(guān)[8?9]。

    組蛋白乙酰化修飾被認(rèn)為是基因表達(dá)調(diào)節(jié)中重要且普遍存在的表觀遺傳標(biāo)記[10]。組蛋白乙酰化可以削弱組蛋白與DNA 之間的相互作用,改變核小體的表面結(jié)構(gòu),使染色質(zhì)伸展,有助于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的形成。因此,一般來(lái)說(shuō),組蛋白乙酰化可誘導(dǎo)基因激活,相反,組蛋白去乙?;ǔ?huì)導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮并抑制基因轉(zhuǎn)錄[11]。組蛋白去乙?;福℉istone deacetylases,HDACs)是一個(gè)家族,其功能是將組蛋白去乙酰化,與組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferases,HATs)共同維持組蛋白乙?;揎椀姆€(wěn)態(tài)。近年來(lái)研究顯示,HDACs基因也介導(dǎo)根系生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。通過(guò)丁酸鈉和曲古抑菌素處理抑制HDACs活性,可抑制擬南芥的主根生長(zhǎng)[12],在擬南芥中過(guò)表達(dá)白楊組蛋白去乙?;富騊tHDT902可促進(jìn)主根伸長(zhǎng)[13]。

    H2S 和HDACs 基因?qū)χ参锔稻姓{(diào)節(jié)作用,二者在調(diào)節(jié)根系生長(zhǎng)過(guò)程中的作用關(guān)系尚不明確,因此,采用不同濃度NaHS 處理后,測(cè)定小麥和擬南芥根系中HDACs 活性及其基因表達(dá)情況,以探討H2S 對(duì)植物根系生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)與組蛋白去乙?;傅南嗷プ饔藐P(guān)系,豐富對(duì)植物根系生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

    1 材料和方法

    1.1 材料培養(yǎng)及處理

    擬南芥種子表面消毒滅菌后,播種到1/2MS 培養(yǎng)基上,4 ℃放置3 d 后,在22 ℃/20 ℃(光照16 h/黑暗8 h)條件下生長(zhǎng),4 d后將其轉(zhuǎn)移到含0(CK)、50、100、150、200 μmol/L NaHS 的1/2MS 培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng),6 d后測(cè)其根長(zhǎng),-80 ℃保存,用于測(cè)定HDACs活性及基因表達(dá)。

    將小麥(鄭麥366,ZM366)種子用5%H2O2消毒3 min,清水沖洗5 次,蒸餾水浸泡4~6 h 后,把種子放在濕潤(rùn)的濾紙上催芽,3 d 后將其移至含0(CK)、50、100、200、400 μmol/L NaHS 的1/4Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為25 ℃/20 ℃(光照14 h/黑暗10 h),相對(duì)濕度70%。3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液,6 d后測(cè)量根系長(zhǎng)度,并取根系樣品于-80 ℃保存,用于測(cè)定HDACs活性及基因表達(dá)。

    1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

    1.2.1 根長(zhǎng) 在根系旁放置標(biāo)尺并拍照,將圖片置入Photoshop 7.0,使用標(biāo)尺工具進(jìn)行根長(zhǎng)測(cè)定,每個(gè)處理測(cè)量5~10株。

    1.2.2 HDACs 活性 分別取0.1 g 擬南芥和小麥樣品,用液氮研磨后,加1 mL 提取液[50 mmol/L Tris-HCl,pH 值為7.5,150 mmol/L NaCl、2%十二烷基鈉硫酸(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和蛋白酶抑制劑],4 ℃、12 000×g離心10 min,取上清待用。按照植物組蛋白去乙酰化酶ELISA 試劑盒(Mlbio,中國(guó)上海)操作說(shuō)明測(cè)定HDACs活性。

    1.2.3 HDACs 基因表達(dá) 擬南芥和小麥根系總RNA 用Trizol 試劑提取,使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。參照LI 等[14]的方法采用qRT-PCR 分析擬南芥和小麥根系的HDACs基因表達(dá)情況,使用引物具體見(jiàn)表1,擬南芥和小麥分別以AtACT-2和TaACT-1作為內(nèi)參基因。

    表1 qRT-PCR分析使用引物Tab.1 The primers used for qRT-PCR analysis

    1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

    所有定量結(jié)果均為至少3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)。使用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 H2S對(duì)擬南芥和小麥根系生長(zhǎng)的影響

    用不同濃度NaHS 處理擬南芥和小麥發(fā)現(xiàn),H2S可顯著調(diào)節(jié)擬南芥和小麥根系生長(zhǎng)(圖1—2)。與CK(0 μmol/L NaHS)相比,50~200 μmol/L NaHS 可使擬南芥主根伸長(zhǎng)減少16.0%~51.1%(圖1),50~400 μmol/L NaHS 可使小麥主根伸長(zhǎng)減少10.0%~20.1%(圖2A)。除對(duì)主根產(chǎn)生影響外,H2S 還可調(diào)節(jié)小麥側(cè)根的生長(zhǎng),50~200 μmol/L NaHS 可促進(jìn)小麥側(cè)根生長(zhǎng),側(cè)根長(zhǎng)度比CK 增加7.2%~13.5%,但高濃度NaHS(400 μmol/L)抑制了側(cè)根生長(zhǎng)(圖2B)。

    圖1 H2S對(duì)擬南芥主根生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of H2S on the primary root growth of Arabidopsis

    圖2 H2S對(duì)小麥主根(A)和側(cè)根(B)生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of H2S on the primary and lateral root growth of wheat

    2.2 H2S對(duì)擬南芥和小麥根系HDACs活性的影響

    不同濃度NaHS 處理后,對(duì)擬南芥和小麥根系HDACs 活性進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不管擬南芥還是小麥中,NaHS處理均誘導(dǎo)了HDACs活性,但具有濃度依賴性(圖3)。擬南芥中較低濃度NaHS(50~100 μmol/L)對(duì)HDACs 活性無(wú)顯著影響,但較高濃度NaHS(150~200 μmol/L)可 使HDACs 活 性 提 高48.0%~50.0%(圖3A);50~400 μmol/L NaHS 處理均能顯著誘導(dǎo)小麥HDACs 活性,100 μmol/L 濃度下達(dá)到最大,HDACs活性較CK提高76.6%(圖3B)。

    圖3 H2S對(duì)擬南芥(A)和小麥(B)根系HDACs活性的影響Fig.3 Effect of H2S on the HDACs activity in Arabidopsis(A)and wheat(B)

    2.3 H2S對(duì)擬南芥和小麥HDACs基因表達(dá)的影響

    HDACs 是由多個(gè)基因組成的基因家族,在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有18 個(gè)HDACs 基因[15],前期通過(guò)全基因組分析已從小麥中鑒定出53 個(gè)HDACs 基因[16],現(xiàn)進(jìn)一步分析不同濃度NaHS 處理下擬南芥和小麥HDACs基因的表達(dá)模式。

    由于AtHDA10、AtHDA17基因與AtHDA9的N 端相似度可達(dá)97%[15],通過(guò)RT-PCR 不能從轉(zhuǎn)錄水平區(qū)分AtHDA10和AtHDA17各自的表達(dá)情況,因此,只探討其他16個(gè)AtHDACs基因在NaHS處理下的表達(dá)變化。結(jié)果(圖4)顯示,有4個(gè)AtHDACs基因不受NaHS 影響,這4 個(gè)基因(AtHDT1、AtHDT2、AtHDT3、AtHDT4)均屬于HD2 亞家族,其余12 個(gè)AtHDACs均響應(yīng)NaHS 處理,但表達(dá)模式不同,且具有濃度依賴性。如AtHDA2、AtHDA7、AtHDA8和AtHDA14表達(dá)水平在50 μmol/L NaHS 處理下均顯著下調(diào),AtHDA5、AtHDA6、AtHDA19和AtSRT1表達(dá)水平僅在150 μmol/L NaHS 處 理 下 顯 著 上 調(diào),AtHDA15、AtHDA18和AtSRT2在較高濃度NaHS 處理下可被持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá),而AtHDA8和AtHDA14的表達(dá)在低濃度NaHS處理下被抑制,而較高濃度下被誘導(dǎo)。

    圖4 H2S對(duì)擬南芥HDACs基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of H2S on HDACs gene expression in Arabidopsis

    由于六倍體小麥的A、B 和D 基因組在mRNA水平上極為相似,因此將TaHDACs-A、TaHDACs-B和TaHDACs-D 視為一個(gè)組合基因,分析了19 個(gè)TaHDACs在不同濃度NaHS 處理下的表達(dá)水平(圖5)。19 個(gè)TaHDACs基因中有2 個(gè)基因(TaHDA5和TaSRT1)不受NaHS 影響,其余17 個(gè)TaHDACs對(duì)NaHS 的響應(yīng)模式各有不同。與CK 相比,TaHDA9和TaHDA19在100 μmol/L NaHS 處理下被顯著誘導(dǎo)表達(dá),TaHDA20在200 μmol/L NaHS 處理下上調(diào)表達(dá),TaHDA21和TaHDA22的表達(dá)量在50、100、400 μmol/L NaHS 處 理 下 均 顯 著 上 升,TaHDA2、TaHDA6、TaHDA8、TaHDA18、TaSRT2、TaHDT1和TaHDT2均在100、200 μmol/L NaHS 處理下顯著下調(diào)表達(dá),TaHDA14和TaHDT3的表達(dá)量在50~400 μmol/L NaHS處理下均顯著下降。

    圖5 H2S對(duì)小麥HDACs基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of H2S on HDACs gene expression in wheat

    3 結(jié)論與討論

    在擬南芥[17]、黃瓜[18]、番茄[19]等雙子葉植物中的研究均顯示,H2S 可調(diào)節(jié)植物根系生長(zhǎng),但在單子葉植物中H2S對(duì)根系的調(diào)控作用及機(jī)制是否與雙子葉植物一致尚不清楚。本研究比較了H2S對(duì)擬南芥和小麥根系生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用。與擬南芥中的結(jié)果一致,NaHS 可顯著抑制小麥主根生長(zhǎng),但隨NaHS 濃度增加,小麥側(cè)根長(zhǎng)度表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì),說(shuō)明H2S 對(duì)單子葉植物和雙子葉植物根系生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用相似,H2S 對(duì)其主根和側(cè)根均有調(diào)節(jié)作用,且具有濃度依賴性。

    在擬南芥中已有研究顯示,H2S 抑制主根生長(zhǎng)的作用依賴于ROS-MPK6-NO 信號(hào)途徑[20],即外源H2S 誘導(dǎo)了ROS 的產(chǎn)生,而后ROS 激活絲裂原活化蛋白激酶MPK6,MPK6 通過(guò)MAPK 途徑促使NO 產(chǎn)生,NO 再抑制生長(zhǎng)素的分布及降低根尖分生細(xì)胞的分裂潛能,最終表現(xiàn)出H2S 對(duì)主根生長(zhǎng)的抑制作用。在番茄中,H2S 對(duì)側(cè)根生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)由H2O2信號(hào)介導(dǎo),H2S 可通過(guò)誘導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生促使細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因(如SlCYCA2;1、SlCYCA3;;1、SlCDKA1)及側(cè)根形成相關(guān)microRNAs(miR390a和miR160)的表達(dá),最終促進(jìn)側(cè)根生長(zhǎng)[21]。近來(lái),組蛋白去乙?;笇?duì)根系的調(diào)節(jié)也有研究報(bào)道,如水稻組蛋白去乙?;富騉sHDAC1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)根系生長(zhǎng)[22];組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDIs)通過(guò)促進(jìn)PIN1 蛋白降解抑制擬南芥主根伸長(zhǎng)[23];HDA19突變降低了低磷對(duì)根毛數(shù)量及長(zhǎng)度的誘導(dǎo)[24];擬南芥HDT1/2雙突變體的主根長(zhǎng)度顯著短于野生型[25]。H2S 調(diào)節(jié)植物根系生長(zhǎng),組蛋白去乙酰化酶也介導(dǎo)根系生長(zhǎng),那么H2S與組蛋白去乙酰化酶在調(diào)節(jié)根系生長(zhǎng)作用中是否有相關(guān)性,這個(gè)問(wèn)題在植物中尚未有探討。但在動(dòng)物體中已發(fā)現(xiàn)H2S 可調(diào)節(jié)組蛋白去乙?;?,如H2S 可誘導(dǎo)大鼠細(xì)胞中組蛋白去乙酰化酶基因SIRT1表達(dá)來(lái)緩解甲醛誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[26];H2S 以組蛋白去乙酰化酶SIRT3依賴的方式改善小鼠心肌肥大細(xì)胞線粒體功能[27];H2S 也可通過(guò)誘導(dǎo)HDACs活性,抑制炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的表達(dá),最終保持骨骼穩(wěn)態(tài)[28]。本研究發(fā)現(xiàn),不管在擬南芥還是小麥中,H2S 均可誘導(dǎo)組蛋白去乙?;富钚员磉_(dá),并且對(duì)HDACs家族基因表達(dá)也有不同的調(diào)控模式,由此說(shuō)明,H2S 對(duì)植物根系的調(diào)控與組蛋白去乙?;赶⑾⑾嚓P(guān)。

    與CK 相比,H2S 處理下,擬南芥和小麥根系HDACs 基因都有不同程度的表達(dá)差異。部分HDACs基因在擬南芥和小麥中的表達(dá)趨勢(shì)不一致,如HDA6、HDA15和HDA18在擬南芥中被H2S 上調(diào)表達(dá),而在小麥中則被H2S下調(diào)表達(dá),HDT1—4在擬南芥中不響應(yīng)H2S,而在小麥中則被H2S 抑制表達(dá),這可能是因?yàn)檫@些基因在雙子葉植物和單子葉植物根系存在不同的響應(yīng)機(jī)制。值得關(guān)注的是,同源基因AtHDA2和TaHDA2的表達(dá)分別在50 μmol/L NaHS 和100 μmol/L NaHS 下被顯著抑制,而同源基因AtHDA19和TaHDA19分別在150 μmol/L NaHS 和100 μmol/L NaHS 下被顯著誘導(dǎo)表達(dá),整體而言,隨H2S濃度增加,擬南芥和小麥根系HDA2的相對(duì)表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢(shì),HDA19的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。根據(jù)前人研究[22?25]報(bào)道,增加組蛋白的去乙?;纱龠M(jìn)根系生長(zhǎng),相反,降低組蛋白的去乙?;梢种聘瞪L(zhǎng)。在小麥和擬南芥中均發(fā)現(xiàn)H2S 可抑制HDA2的表達(dá),說(shuō)明H2S對(duì)植物根系的調(diào)節(jié)可能與HDA2基因有關(guān)。而H2S對(duì)HDA9和HDA19基因的誘導(dǎo)作用可能與逆境脅迫調(diào)節(jié)有關(guān),因?yàn)樵趧?dòng)物應(yīng)激反應(yīng)中,H2S 誘導(dǎo)組蛋白去乙酰化酶表達(dá)[26?28]。

    總的來(lái)說(shuō),H2S 對(duì)HDACs 具有顯著的調(diào)節(jié)作用,但H2S 可能通過(guò)不同HDACs 基因介導(dǎo)不同的生長(zhǎng)過(guò)程或逆境脅迫。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn),HDA2可能參與H2S 信號(hào)調(diào)節(jié)根系生長(zhǎng),HDA9和HDA19可能參與H2S 信號(hào)介導(dǎo)植物逆境脅迫,但H2S 對(duì)這些HDACs 的調(diào)節(jié)機(jī)制及介導(dǎo)HDACs 調(diào)節(jié)根系生長(zhǎng)的下游基因都需進(jìn)一步研究和鑒定。

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