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    EMS處理對(duì)尾葉紫薇種子萌發(fā)的影響及半致死劑量的研究

    2022-04-22 10:20:12王景蕓吳宜靜張一鳴朱梓寧潘會(huì)堂張啟翔
    種子 2022年3期
    關(guān)鍵詞:尾葉致死率紫薇

    續(xù) 言, 王景蕓, 吳宜靜, 張一鳴, 朱梓寧, 蔡 明, 潘會(huì)堂, 張啟翔

    (北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院, 北京 100083)

    紫薇(Lagerstroemiaindica)是千屈菜科紫薇屬的重要木本花卉,為我國原產(chǎn)樹種,有較為悠久的栽培歷史,自唐代就被作為觀賞花木栽培。紫薇屬植物在夏季少花季節(jié)開花,花色豐富、花期長(zhǎng)達(dá)3個(gè)多月,是良好的園林綠化樹種[1]。花香是園林植物重要的觀賞性狀之一,但有色少香是紫薇觀賞性狀的一個(gè)缺憾。尾葉紫薇(L.caudata)是紫薇屬中具有明顯花香的品種,常被用作香花育種的重要親本。但尾葉紫薇為小喬木,花色單一,花徑小,且尾葉紫薇與其他紫薇品種的雜交后代香味減弱。因此,仍需通過多種育種手段選育綜合性狀優(yōu)良的香花紫薇新品種。

    化學(xué)誘變育種是利用化學(xué)藥劑改變植物的遺傳物質(zhì),并將優(yōu)良的突變材料培育成為新品種的育種方法[2]。甲基黃酸乙酯(EMS)誘變劑是化學(xué)誘變劑中烷化劑的典型代表,具有高效低毒,可誘導(dǎo)高密度的系列等位基因點(diǎn)突變的特點(diǎn),被公認(rèn)為世界上最有效和廣泛使用的化學(xué)誘變劑之一。利用EMS誘變技術(shù)已經(jīng)成功構(gòu)建了非洲菊[3]、菊苣[4]、觀賞辣椒[5]、長(zhǎng)春花[6]、春蘭[7]、大花萱草[8]、旱柳[9]、木槿[10]等觀賞植物的突變體庫。

    紫薇EMS誘變開始于美國,1998年Whitcomb利用EMS技術(shù)誘導(dǎo),獲得了顏色鮮紅、復(fù)色花及可持續(xù)開花等8個(gè)各具特色的優(yōu)良紫薇品種[11]。國內(nèi)對(duì)紫薇的EMS誘變育種研究開始較晚,伍漢斌等[12]以南紫薇種子為材料,用不同濃度EMS溶液對(duì)南紫薇種子進(jìn)行處理,研究了EMS處理對(duì)紫薇種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響,得到EMS誘變紫薇種子的半致死濃度為3%處理6 h。

    本研究用EMS對(duì)尾葉紫薇的成熟種子進(jìn)行處理,研究在不同處理濃度和時(shí)間下EMS對(duì)尾葉紫薇種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響,篩選EMS誘變尾葉紫薇的最佳條件,為香花紫薇優(yōu)良品種的選育奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    實(shí)驗(yàn)材料為尾葉紫薇成熟種子,2020年8月采摘于北京市昌平區(qū)國家花卉工程中心小湯山基地。EMS誘變劑采購自SIGMA公司。

    1.2 方 法

    將尾葉紫薇的成熟種子用蒸餾水浸泡一夜進(jìn)行預(yù)處理。以不含誘變劑的蒸餾水為對(duì)照組,設(shè)置濃度梯度分別為0.5%、1%、2%、4%的EMS溶液,處理時(shí)間分別為4 h、8 h、12 h。使用大而飽滿的尾葉紫薇成熟種子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理,每個(gè)重復(fù)50粒種子,3組重復(fù),共45個(gè)處理。將處理后的種子用5%的硫代硫酸溶液沖洗30 min后再用蒸餾水沖洗2 h,將清洗后的種子均勻播于墊有濕潤(rùn)試紙的培養(yǎng)皿中,在25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。再次重復(fù)上述處理,將清洗后的種子點(diǎn)播在國家花卉工程中心小湯山基地溫室內(nèi),進(jìn)行正常的養(yǎng)護(hù)管理。

    1.3 指標(biāo)測(cè)定

    1.3.1種子萌發(fā)的測(cè)定

    定時(shí)觀察播種后的萌發(fā)情況,以種子露白作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn),每天按時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理的發(fā)芽數(shù),連續(xù)3 d發(fā)芽數(shù)不再變化時(shí)視為發(fā)芽結(jié)束。測(cè)定種子的發(fā)芽勢(shì),統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。計(jì)算公式如下:

    發(fā)芽勢(shì)(%)=(處理后9 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/種子總數(shù))×100%;

    發(fā)芽率(%)=(處理后14 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù))×100%。

    1.3.2根長(zhǎng)測(cè)定

    將誘變后的尾葉紫薇種子培養(yǎng)至10 d,使用游標(biāo)卡尺測(cè)量尾葉紫薇根長(zhǎng),每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇10株測(cè)量,重復(fù)3次,取根長(zhǎng)的平均值。

    1.3.3EMS誘變半致死劑量的確定

    相對(duì)發(fā)芽率(%)=(處理組的發(fā)芽率/對(duì)照組的發(fā)芽率)×100%;

    相對(duì)發(fā)芽勢(shì)(%)=(處理組的發(fā)芽勢(shì)/對(duì)照組的發(fā)芽勢(shì))×100%。

    半致死劑量(Lethal concentration 50,LC50)以EMS處理尾葉紫薇種子的相對(duì)致死率確定,相對(duì)致死率為50%時(shí)獲得半致死劑量。

    1.3.4紫薇幼苗形態(tài)學(xué)指標(biāo)的觀測(cè)

    待幼苗正常生長(zhǎng)120 d后統(tǒng)計(jì)植株的分枝數(shù)、葉片數(shù)、莖粗、株高、冠幅,選取3片成熟葉片測(cè)量葉長(zhǎng)、葉寬并計(jì)算葉面積,葉形指數(shù)用“葉片長(zhǎng)/葉片寬”表示,成熟葉片面積使用Adobe Photoshop CC 2019軟件處理后獲得。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    采用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)用平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用matlab 2018軟件對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,通過數(shù)學(xué)建模獲得尾葉紫薇EMS誘變處理的理論半致死劑量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同處理對(duì)尾葉種子萌發(fā)的影響

    將尾葉紫薇種子播種在培養(yǎng)皿6 d后,對(duì)照組的種子最先開始萌發(fā)(最早出苗的是蒸餾水處理4 h和蒸餾水處理12 h);第7天起,0.5%和1%處理4 h、處理8 h組和0.5%處理12 h組開始萌發(fā),第8天除4%處理組外其余處理組均開始萌發(fā)。隨著EMS濃度升高和處理時(shí)間延長(zhǎng),萌發(fā)時(shí)間推遲越長(zhǎng),到第9天,萌發(fā)起始完全結(jié)束;直至第14天,各處理組萌發(fā)數(shù)基本確定。結(jié)果表明,EMS處理能夠抑制尾葉紫薇種子的萌發(fā),且EMS的濃度越高,處理時(shí)間越長(zhǎng),抑制作用越明顯。與對(duì)照組相比,誘變組尾葉紫薇種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率隨EMS濃度的升高都呈逐漸下降的趨勢(shì),且EMS濃度越高,萌發(fā)數(shù)值越低,與對(duì)照組差異極顯著。

    注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。下同。圖1 各處理組種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)Fig.1 Germination rate and germination potential of seeds in each treatment group

    由圖1可知,不同濃度的EMS誘變劑對(duì)尾葉紫薇種子浸泡4 h后的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)都有顯著影響,且表現(xiàn)出一定的規(guī)律。與對(duì)照組相比,發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率均隨EMS濃度的升高而降低,且濃度越高,發(fā)芽率下降越快。低濃度的EMS溶液處理對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用不明顯,0.5%處理的相對(duì)發(fā)芽率達(dá)80%以上,且與對(duì)照組的差異不顯著;高濃度的EMS溶液處理抑制作用明顯,2%~4%梯度下,相對(duì)發(fā)芽率下降了32.73%,下降速率最快。且隨著濃度的升高,發(fā)芽勢(shì)也呈降低趨勢(shì),發(fā)芽勢(shì)的變化規(guī)律與發(fā)芽率基本相同。與4 h處理的變化規(guī)律相同,8 h、12 h的EMS溶液處理對(duì)尾葉紫薇種子的萌發(fā)具有抑制作用,經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的EMS處理后,不同組別間的差異極顯著(p<0.01)。且隨著濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng),抑制作用逐漸增強(qiáng)。在4%濃度下處理8 h、12 h種子全部致死。

    2.2 不同EMS處理對(duì)尾葉紫薇根長(zhǎng)的影響

    觀察發(fā)現(xiàn),EMS處理對(duì)尾葉紫薇根的形態(tài)造成了影響。相同處理濃度下,處理時(shí)間越長(zhǎng),根長(zhǎng)越短,EMS處理濃度與根長(zhǎng)關(guān)系也呈相同的變化規(guī)律。從圖2可知,不同處理時(shí)間對(duì)尾葉紫薇種子幼苗根長(zhǎng)影響達(dá)極顯著(p<0.01),不同處理濃度對(duì)尾葉紫薇根長(zhǎng)也存在極顯著影響,處理濃度和處理時(shí)間相互作用時(shí),根長(zhǎng)變化也呈顯著差異。

    圖2 各處理組根長(zhǎng)Fig.2 Root length of each treatment group

    2.3 尾葉紫薇EMS處理半致死劑量的初步選擇

    由表1可知,EMS處理抑制了尾葉紫薇的萌發(fā),處理時(shí)間越長(zhǎng),濃度越高,相對(duì)致死率越高。低濃度處理4 h對(duì)尾葉紫薇種子的萌發(fā)效應(yīng)不顯著,0.5%處理4 h后相對(duì)致死率與對(duì)照組沒有顯著差異,但4%處理后相對(duì)致死率顯著增加,達(dá)到80.91%。方差分析結(jié)果顯示,隨著處理時(shí)間的增加,各組別之間差異極顯著(p<0.01),說明不同的處理濃度和處理時(shí)間對(duì)尾葉紫薇種子萌發(fā)的相對(duì)致死率有極顯著影響。半致死劑量通常作為有效誘發(fā)植物產(chǎn)生突變的適宜誘變劑量。本實(shí)驗(yàn)表明,2%濃度處理4 h的相對(duì)致死率為48.18%,1%濃度處理12 h的相對(duì)致死率為58.25%,以上2種處理最接近半致死劑量,經(jīng)過比較初步確定EMS處理尾葉紫薇的半致死劑量為2%處理4 h。

    表1 不同處理對(duì)尾葉紫薇萌發(fā)相對(duì)致死率的影響Table 1 Effects of different treatments on the germination relative lethal rate of Lagerstroemia caudata

    2.4 尾葉紫薇EMS處理理論半致死劑量的選擇

    相對(duì)致死率的變化受處理濃度和處理時(shí)間的影響,但本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為分散,無法準(zhǔn)確估計(jì)半致死劑量。插值函數(shù)被廣泛應(yīng)用于數(shù)據(jù)分析中,指在離散數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上補(bǔ)插連續(xù)函數(shù),使得這條連續(xù)曲線通過全部的離散數(shù)據(jù)點(diǎn)[13]。采用“雙線性插值”的方法對(duì)實(shí)異極顯著(p<0.01)。下同。

    驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,既可以保證插值結(jié)果在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)上的誤差為零,又可以保證插值結(jié)果符合之前定性分析中得出的相對(duì)致死率隨處理濃度和處理時(shí)間的變化趨勢(shì)。本次試驗(yàn)利用matlab軟件自帶的插值函數(shù)interp 2在matlab軟件內(nèi)編程實(shí)現(xiàn)。最終通過線性插值的方法得到如圖3所示的模型,揭示了處理時(shí)間、處理濃度和相對(duì)致死率的變化規(guī)律,可以快速獲得大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。將相對(duì)致死率(z)=50%代入模型中,可以得到處理濃度和處理時(shí)間的具體值。本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)處理濃度為0.78%、處理時(shí)間為12 h時(shí),取得EMS最低濃度下誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量;當(dāng)處理濃度為2.11%、處理時(shí)間為4 h時(shí),取得最短處理時(shí)間下的誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量。

    圖3 使用matlab得到的不同處理組尾葉紫薇半致死率的函數(shù)Fig.3 The function of half-lethal rate of Lagerstroemia caudata in different treatment groups obtained using matlab

    2.5 不同濃度處理對(duì)尾葉紫薇幼苗生長(zhǎng)的影響

    不同濃度EMS溶液處理4 h后,正常養(yǎng)護(hù)管理生長(zhǎng)120 d的植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)量,結(jié)果見表2。由表2可知,經(jīng)過不同濃度的EMS處理后,尾葉紫薇幼苗的生長(zhǎng)受到了一定的影響,4%處理下,尾葉紫薇的分枝數(shù)明顯多于其他處理組,與其他處理組的差異極顯著,說明高濃度的EMS處理可促進(jìn)尾葉紫薇分枝。隨著EMS處理濃度的增加,尾葉紫薇幼苗的株高呈先升后降的趨勢(shì),2%處理組的株高最高,達(dá)48.79 cm。莖粗和冠幅對(duì)EMS處理的響應(yīng)不明顯,各處理組間沒有表現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律。同時(shí),由表3可知,4%處理組的葉片數(shù)、葉形指數(shù)、葉面積都大于其他處理組,表現(xiàn)為促進(jìn)作用,且與其他處理組的差異極顯著。但是在低濃度的EMS處理后,葉形指數(shù)在2.0~2.2之間,葉面積在11~13 cm2之間波動(dòng),處理組的葉片形態(tài)與對(duì)照組沒有明顯的差異。

    表2 不同濃度處理對(duì)尾葉紫薇幼苗生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of different concentrations on the growth of Lagerstroemia caudata seedlings

    表3 不同濃度處理對(duì)尾葉紫薇幼苗葉片的影響Table 3 Effects of different concentration treatments on the leaves of Lagerstroemia caudata seedlings

    3 結(jié)論與討論

    EMS誘變簡(jiǎn)單高效,對(duì)植物染色體的損傷較小,被用于植物體各個(gè)部位組織、器官的誘變。吸脹后的種子吸收誘變劑的速率非常高,能夠使更多的誘變劑以更快的速度進(jìn)入胚組織,成為實(shí)驗(yàn)中最常見的誘變材料之一[14-15]。

    不同處理濃度和處理時(shí)間對(duì)尾葉紫薇種子的發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)以及幼苗根的生長(zhǎng)都有顯著的影響。處理濃度和處理時(shí)間是決定EMS誘變的關(guān)鍵因素,且經(jīng)EMS溶液處理后,尾葉紫薇種子的發(fā)芽起始時(shí)間和發(fā)芽進(jìn)程都出現(xiàn)了一定程度的延緩,說明EMS處理能夠抑制種子的萌發(fā)。幼苗對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收情況與根的長(zhǎng)度有關(guān),根的長(zhǎng)度過于短小不利于幼苗吸收營(yíng)養(yǎng),高濃度EMS誘變下尾葉紫薇幼苗成活率較低可能與此有關(guān)。有研究證明,低濃度的EMS處理可以促進(jìn)部分植物種類的種子萌發(fā),如醉魚草[16]、知母[17]、無芒雀[18]等,這可能與不同物種種皮的透水性、種子的大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及種子的休眠機(jī)制有關(guān)。

    在本次試驗(yàn)中,2%濃度處理4 h尾葉紫薇成熟種子的相對(duì)致死率為48.18%,1%濃度處理12 h的相對(duì)致死率為58.25%,以上2種處理最接近半致死濃度。在進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)時(shí)可以選擇2%處理4 h作為處理方式。本試驗(yàn)采用“雙線性插值”的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,通過數(shù)學(xué)分析得出,當(dāng)處理濃度為0.78%、處理時(shí)間為12 h時(shí),取得EMS最低濃度下誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量;當(dāng)處理濃度為2.11%、處理時(shí)間為4 h時(shí)取得最短處理時(shí)間下的誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量。

    當(dāng)前紫薇屬植物的EMS誘變研究較少,伍漢斌等[12]在對(duì)南紫薇種子進(jìn)行EMS誘變?cè)囼?yàn)時(shí)得出,3.0%EMS濃度處理6 h為誘變南紫薇種子的半致死劑量,本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與之有較大差異,可能是尾葉紫薇與南紫薇的種間差異性。在其他木本觀賞植物中,慎家輝等[19]探索了EMS對(duì)杜梨的誘變效應(yīng),得到0.3%處理24 h為杜梨誘變的最佳劑量,Dhakshanamoorthy等[20]得到EMS誘變麻風(fēng)樹的半致死劑量為3%處理8 h;孫慧[21]根據(jù)萌發(fā)率和成苗率確定海濱木槿種子的適宜誘變濃度為1.5%,誘變處理時(shí)間4 h;朱翠翠等[22]對(duì)青檀種子的研究發(fā)現(xiàn),1.2%~1.5%EMS濃度處理48 h為青檀種子的半致死劑量。這說明不同植物對(duì)EMS處理的敏感性不同,誘變效果存在很大差異。

    研究發(fā)現(xiàn),浸種時(shí)間越長(zhǎng),尾葉紫薇的萌發(fā)率越高。對(duì)照組處理12 h,發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)明顯高于4 h處理組。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),EMS誘變處理尾葉紫薇種子時(shí),較高的環(huán)境溫度可以提高萌發(fā)率。結(jié)果表明,在一定溫度范圍內(nèi),溫度升高有利于突變頻率提高??勺鳛榻窈髮?shí)驗(yàn)的探索依據(jù)。

    EMS處理對(duì)尾葉紫薇后期的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的影響。高濃度的EMS處理可以促進(jìn)尾葉紫薇分枝和葉片增大,較低濃度的EMS處理可以促進(jìn)株高增長(zhǎng)。在冠幅、莖粗等方面,EMS處理的效應(yīng)不明顯。但誘變效應(yīng)具有很大的隨機(jī)性,處理組間個(gè)體差異性較大,具體變化規(guī)律仍需加大實(shí)驗(yàn)量再次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

    本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了不同的濃度梯度,在3個(gè)不同處理時(shí)間下使用EMS溶液對(duì)尾葉紫薇進(jìn)行浸種,通過對(duì)各處理組發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)以及幼苗根的長(zhǎng)度、苗期生長(zhǎng)狀況等指標(biāo)進(jìn)行研究分析,最終獲得了尾葉紫薇種子各種指標(biāo)在EMS處理?xiàng)l件下的變化規(guī)律,使用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析獲得了處理時(shí)間和處理濃度的相互作用關(guān)系。通過對(duì)半致死劑量的初步估計(jì),確定了尾葉紫薇EMS誘變的適宜劑量為2%濃度處理4 h。同時(shí)使用matlab軟件建造模型預(yù)測(cè)了EMS誘變尾葉紫薇種子的理論半致死組合,對(duì)播種后的幼苗進(jìn)行了初步的形態(tài)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)。試驗(yàn)結(jié)果可為尾葉紫薇的誘變體庫建立及誘變育種提供參考。

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