藍(lán)桉實(shí)生瓶苗繁育技術(shù)體系的建立

李 艷， 耿金鳳， 曹現(xiàn)富， 鄒廣權(quán)， 曹子林， 王曉麗

(1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 云南 昆明 650224； 2.西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院， 云南 昆明 650224)

藍(lán)桉(EucalyptusglobulusLabill.)生長迅速，經(jīng)營周期短，是桉樹中少有的油、材兼用樹種，經(jīng)濟(jì)價(jià)值顯著[1-3]，在云南省較早引種栽植和分布[3]。目前藍(lán)桉人工林培育的材料來源主要是種子和實(shí)生苗，但良種資源少，種源不足，導(dǎo)致種子價(jià)格畸高且種苗質(zhì)量良莠不齊，造林后林木分化明顯[4-6]。因此，藍(lán)桉良種無性快繁技術(shù)體系的構(gòu)建成為解決該問題的關(guān)鍵。組培以其生產(chǎn)效率高等特點(diǎn)成為林木良種快繁的主要技術(shù)之一[7]。外植體的來源和質(zhì)量是組培成敗的關(guān)鍵因素之一，室外和開放環(huán)境下的外植體由于帶菌嚴(yán)重，導(dǎo)致組培過程中污染嚴(yán)重，提高了組培的成本[8-9]。藍(lán)桉超級苗組培快繁技術(shù)體系研究中，以室外栽植的實(shí)生超級苗的半木質(zhì)化莖段為外植體，接種后外植體的污染率高達(dá)43.88%[10]。健壯的實(shí)生瓶苗本身是無菌的，可以從源頭上控制組培過程中的污染，降低組培的成本，因此，健壯實(shí)生瓶苗的培育是藍(lán)桉高效組培技術(shù)體系構(gòu)建的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，但目前未見其相關(guān)研究報(bào)道。

pH值為5.0～8.0時(shí)，瓊脂濃度是影響固體培養(yǎng)基凝固等級的重要因素，瓊脂量過多，培養(yǎng)基較硬，不利于種子坐落，且種子和幼苗難以吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)；瓊脂量過少，培養(yǎng)基較稀，不能很好固化[11]。固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度對植物繁育影響研究主要集中在植物組培體系構(gòu)建方面[10，12-14]，崔廣榮等[14]研究表明，隨著瓊脂濃度的增大，文心蘭(Oncidiumhybridum)芽誘導(dǎo)時(shí)間延長，增殖數(shù)量下降，當(dāng)瓊脂用量達(dá)到6.0 g/L時(shí)，有較多的根形成。目前未見植物實(shí)生瓶苗繁育中固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度對種子萌發(fā)和幼苗生長影響的相關(guān)研究報(bào)道。

適宜的外源激素處理，可打破種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)[15-16]。令狐昱慰等[17]用添加不同濃度GA3、6-BA和IBA的MS培養(yǎng)基，對山白樹(Sinowilsoniahenry)種子進(jìn)行無菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)外源激素GA3、6-BA和IBA均可提高山白樹種子的發(fā)芽率和幼苗的生長速率；一定濃度的GA3顯著促進(jìn)種子萌發(fā)；一定濃度的6-BA在促進(jìn)種子萌發(fā)的同時(shí)，還可促進(jìn)胚根的伸長和側(cè)根數(shù)量的增多。Zhai等[18]以梧桐(Firmianasimplex)種子為試材，研究不同濃度GA3、水楊酸和NAA對梧桐幼苗生長的影響，發(fā)現(xiàn)0.05 g/L和0.075 g/L的NAA可分別顯著促進(jìn)幼苗主根和主莖的生長。外源激素調(diào)控藍(lán)桉實(shí)生瓶苗培育的研究未見報(bào)道。

本研究以藍(lán)桉種子為試材，采用3因素5水平的均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討瓊脂用量和外源激素(6-BA和NAA)濃度對藍(lán)桉實(shí)生瓶苗培育的影響效應(yīng)，篩選試驗(yàn)最佳處理組合和理論最優(yōu)處理組合，構(gòu)建藍(lán)桉實(shí)生瓶苗培育的技術(shù)體系，以期獲得健壯無菌的實(shí)生瓶苗，為藍(lán)桉組培技術(shù)體系的構(gòu)建提供充足且理想的外植體材料來源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藍(lán)桉種子采自昆明呼馬山的藍(lán)桉人工林，采種母樹年齡30年左右，生長健壯，干形通直。

1.2 研究方法

參考杜永光等[12]、黃迪等[13]、令狐昱慰等[17]和Zhai等[18]的方法并根據(jù)藍(lán)桉種苗培育的特點(diǎn)加以調(diào)整，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(pH=5.8)，采用3因素(瓊脂、NAA和6-BA濃度)5水平(選用均勻設(shè)計(jì)表U5(53)和其配套的使用表完成本試驗(yàn)設(shè)計(jì))的均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1和表2)，篩選藍(lán)桉實(shí)生瓶苗培育的試驗(yàn)最佳處理組合，分析其主導(dǎo)因素和理論最優(yōu)處理組合。本試驗(yàn)共計(jì)5個(gè)處理組合，每個(gè)處理組合3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10瓶，每瓶接種5粒藍(lán)桉種子。

表2 藍(lán)桉實(shí)生瓶苗培育均勻試驗(yàn)Table 2 Uniform design of experiment for obtaining of aseptic seedlings of E. globulus

試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基、鑷子、雙純水、吸水紙等均需121 ℃高壓滅菌20 min；超凈工作臺先噴75%酒精，而后紫外線照射30 min滅菌。將藍(lán)桉種子置于流水下沖洗30 min，然后瀝干水分，把種子放入超凈工作臺上，先用75%的酒精消毒15 s，再用0.1%的升汞消毒2 min，最后用無菌水清洗6次，備用。取少量種子平鋪于吸水紙上以吸收種子外表多余水分，然后將種子接種于培養(yǎng)瓶中。接種當(dāng)天為第1天，30 d時(shí)記錄種子發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率；60 d時(shí)，將幼苗整株從培養(yǎng)基中取出，測定幼苗的苗高(用直尺測量從幼苗胚軸處至最高處的距離)、地徑(用游標(biāo)卡尺測量幼苗胚軸上方莖的直徑)、主根長(用直尺測量從幼苗胚軸處至主根根尖的距離)及鮮重(用千分之一天平稱量幼苗的重量)，每個(gè)處理組合每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取10株幼苗。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

通過Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 17.0軟件對5個(gè)處理組合藍(lán)桉種子的發(fā)芽率和幼苗的苗高、地徑、主根長以及鮮重分別進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)分析、方差分析和回歸分析[19]，從而獲得最優(yōu)試驗(yàn)處理組合、回歸方程、因素的主次順序、理論最優(yōu)處理組合及其相應(yīng)測定指標(biāo)效果,進(jìn)而得到經(jīng)濟(jì)有效的處理或處理組合用于指導(dǎo)藍(lán)桉實(shí)生瓶苗的培育。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組合對藍(lán)桉種子萌發(fā)和幼苗生長影響的描述統(tǒng)計(jì)分析

由表3可知，5種處理組合對藍(lán)桉種子的發(fā)芽率和幼苗的苗高、地徑、主根長以及鮮重等測定指標(biāo)的具體影響程度雖然不同，但其效應(yīng)規(guī)律基本一致，即每個(gè)測定指標(biāo)的不同處理組合間的極差均較大(極差/均值最小為41.07%，最大為116.99%)，認(rèn)為試驗(yàn)處理對測定指標(biāo)的作用效應(yīng)明顯。5個(gè)處理組合中，處理組合3的藍(lán)桉種子發(fā)芽率最大(66.42%)，處理組合4的發(fā)芽率次之(64.10%)；處理組合4的藍(lán)桉幼苗的苗高(14.333 cm)、地徑(9.820 mm)、主根長(6.954 cm)和鮮重(2.101 g)皆最大。5個(gè)處理組合中，處理組合3和處理組合4的發(fā)芽率皆大于其均值(53.93%)；僅處理組合4的苗高大于其均值(9.351 cm)；處理組合4和處理組合5的地徑皆大于其均值(5.736 mm)；處理組合3、4和處理組合5的主根長皆大于其均值(5.530 cm)；處理組合4和處理組合5的鮮重皆大于其均值(1.471 g)。從描述統(tǒng)計(jì)分析角度來看，處理組合3(A3B1C2)、4(A4B3C1)和5(A5B5C5)對藍(lán)桉種子萌發(fā)和幼苗生長的促進(jìn)效果較好。

表3 各處理組合對藍(lán)桉種子萌發(fā)和幼苗生長影響的描述統(tǒng)計(jì)分析和方差分析Table 3 Descriptive statistical analysis and variance analysis of the effects of different treatment combinations on the seeds germination and seedlings growth of E. globulus

2.2 不同處理組合對藍(lán)桉種子萌發(fā)和幼苗生長影響的方差分析

由表3可知，不同處理組合對種子發(fā)芽率(p=0.035)及幼苗苗高(p=0.000)、地徑(p=0.000)、主根長(p=0.044)和鮮重(p=0.016)5個(gè)測定指標(biāo)均具不同效應(yīng)；不同處理組合對苗高和地徑皆具極顯著差異，不同處理組合對發(fā)芽率、主根長和鮮重皆具顯著差異。多重比較結(jié)果(表3)表明，處理組合3和處理組4的發(fā)芽率均顯著大于處理組合1、2和處理組合5，處理組合3和處理組合4間無顯著差異，處理組合1、2、5兩兩間亦無顯著差異；處理組合4的苗高極顯著大于其他4種處理組合，處理組合3和處理組合5的苗高均極顯著大于處理組合1，處理組合2為過渡組；處理組合4的地徑極顯著大于處理組合1、2和處理組合3，處理組合4和處理組合5間無極顯著差異，處理組合5和處理組合3間亦無極顯著差異，處理組合3極顯著大于處理組合1，處理組合2為過渡組；處理組合3和處理組合4的主根長均顯著大于處理組合1和處理組合2，處理組合3和處理組合4間無顯著差異，處理組合1和處理組合2間亦無顯著差異，處理組合5為過渡組；處理組合4的鮮重顯著大于處理組合1、2和處理組合3，處理組合4和處理組合5間無顯著差異，處理組合5和處理組合3均顯著大于處理組合2，處理組合1為過渡組。從方差分析和多重比較角度來看，利于藍(lán)桉種子萌發(fā)的優(yōu)處理組合為處理組合3和處理組合4；利于幼苗生長的優(yōu)處理組合為處理組合3、4和處理組合5；既利于種子萌發(fā)又利于幼苗生長的試驗(yàn)最優(yōu)處理組合為處理組合4(A4B3C1)。

2.3 不同處理組合對藍(lán)桉種子萌發(fā)和幼苗生長影響的回歸分析

由表4、表5可知，5個(gè)測定指標(biāo)(發(fā)芽率、苗高、地徑、主根長和鮮重)均求得其相應(yīng)的回歸方程；從方差分析結(jié)果可以看出，所求的5個(gè)回歸方程均顯著(苗高、地徑和鮮重的3個(gè)方程極顯著，發(fā)芽率和主根長的2個(gè)方程顯著)，因此該5個(gè)回歸方程是可信的；5個(gè)回歸方程的R值為0.762～0.878，說明測定指標(biāo)與試驗(yàn)因素相關(guān)性較高，回歸方程的擬合度較好；由發(fā)芽率回歸方程的系數(shù)及其p值可知，C因素(p=0.703)不能引入發(fā)芽率回歸方程，由標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)可知因素的主次順序?yàn)锽(5.410)>A(2.852)>C(1.271)；由苗高回歸方程的系數(shù)及其p值可知，C因素(p=0.552)不能引入苗高回歸方程，由標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)可知因素的主次順序?yàn)锽(4.033)>A(2.606)>C(0.614)；由地徑回歸方程的系數(shù)及其p值可知，B因素(p=0.801)和C因素(p=0.168)均不能引入地徑回歸方程，由標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)可知因素的主次順序?yàn)锳(4.829)>C(1.476)>B(0.258)；由主根長回歸方程的系數(shù)及其p值可知，C因素(p=0.831)不能引入主根長回歸方程，由標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)可知因素的主次順序?yàn)锽(2.932)>A(2.099)>C(0.444)；由鮮重回歸方程的系數(shù)及其p值可知，B因素(p=0.778)和C因素(p=0.222)均不能引入鮮重回歸方程，由標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)可知因素的主次順序?yàn)锳(3.785)>C(1.295)>B(0.288)。

表4 試驗(yàn)因素對藍(lán)桉種子萌發(fā)和幼苗生長影響的回歸方程及其擬合度和方差分析Table 4 Regressione quation, fitting degree and variance analysis of the regressione quation of effects of experimental factors on seeds germination and seedlings growth of E. globulus

表5 試驗(yàn)因素對藍(lán)桉種子萌發(fā)和幼苗生長影響的回歸方程的系數(shù)及其檢驗(yàn)結(jié)果Table 5 Coefficient and tested result of the regression equation of effects of experimental factors on seeds germination and seedlings growth of E. globulus

因素A、B對發(fā)芽率、苗高、主根長的影響均有顯著性，且因素A和因素B的系數(shù)均為正，表明發(fā)芽率、苗高、主根長均隨因素A、B的增加而增加，因此因素A、B的取值皆應(yīng)偏上限，即瓊脂8.8 g/L和NAA 0.8 mg/L，將上述各值分別帶入發(fā)芽率、苗高、主根長回歸方程，得y發(fā)芽率=72.20、y苗高=15.963、y主根長=8.468，這些計(jì)算結(jié)果均分別好于5種試驗(yàn)處理組合所得到的最高發(fā)芽率(66.42)、最大苗高(14.333)、最大主根長(6.954)，故從種子萌發(fā)、幼苗苗高和主根長生長來說，理論最優(yōu)處理組合為A5B5(瓊脂8.8 g/L，NAA 0.8 mg/L)。

因素A對地徑、鮮重的影響均有顯著性，且因素A的系數(shù)為正，表明地徑、鮮重均隨因素A的增加而增加，因此因素A的取值應(yīng)偏上限，即瓊脂8.8 g/L，將上述值分別帶入地徑、鮮重回歸方程，得y地徑=8.691、y鮮重=2.278。地徑計(jì)算結(jié)果次于5種試驗(yàn)處理組合所得到的最大地徑(9.820)，故從地徑來說，雖可得其理論最優(yōu)處理為A5(瓊脂8.8 g/L)，但該理論最優(yōu)處理的促生效應(yīng)不如試驗(yàn)最優(yōu)處理組合(A4B3C1)。鮮重計(jì)算結(jié)果好于5種試驗(yàn)處理組合所得到的最大鮮重(2.101)，故從鮮重來說，理論最優(yōu)處理為A5(瓊脂8.8 g/L)。

因素C對發(fā)芽率、苗高、主根長、地徑、鮮重的影響均無顯著性，故針對這5個(gè)測定指標(biāo)，因素C可任取，為簡化試驗(yàn)操作，降低試驗(yàn)成本，因素C取0 mg/L。因素B對地徑、鮮重的影響均無顯著性，故針對這2個(gè)測定指標(biāo)，因素B可任取；因素B對發(fā)芽率、苗高、主根長的影響均有顯著性，且因素B取NAA 0.8 mg/L；綜合因素B對5個(gè)測定指標(biāo)的影響和取值，認(rèn)為因素B取NAA 0.8 mg/L是適宜的。綜上所述，利于藍(lán)桉種子萌發(fā)和幼苗生長的理論最優(yōu)處理組合為A5B5C1(瓊脂8.8 g/L，NAA 0.8 mg/L，6-BA 0 mg/L)。

3 結(jié)論與討論

本研究以不同瓊脂用量的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并在其中添加不同濃度的6-BA和NAA，對藍(lán)桉種子進(jìn)行無菌培養(yǎng)，描述統(tǒng)計(jì)分析認(rèn)為，較高濃度的瓊脂用量(6.8～8.8 g/L)、一定濃度的NAA(0、0.4、0.8 mg/L)及6-BA(0、0.2、0.8 mg/L)配合使用，可促進(jìn)藍(lán)桉種子萌發(fā)和幼苗生長。

方差分析和多重比較發(fā)現(xiàn)，既利于藍(lán)桉種子萌發(fā)又利于幼苗生長的試驗(yàn)最優(yōu)處理組合為A4B3C1(瓊脂7.8 g/L，NAA 0.4 mg/L，6-BA 0 mg/L)，本研究結(jié)果與前人就其他植物種子無菌培養(yǎng)激素調(diào)控的研究結(jié)果有所不同，例如令狐昱慰等[17]對山白樹種子無菌培養(yǎng)認(rèn)為，GA3、6-BA和IBA均可提高山白樹種子的發(fā)芽率和幼苗的生長速率，一定濃度的6-BA在促進(jìn)種子萌發(fā)的同時(shí)，還可促進(jìn)胚根的伸長和側(cè)根數(shù)量的增多；Zhai等[18]認(rèn)為，0.05 g/L和0.075 g/L的NAA可分別顯著促進(jìn)梧桐幼苗主根和主莖的生長，可見針對不同的植物種，其種子無菌培養(yǎng)激素調(diào)控的適宜激素種類和濃度需進(jìn)行具體的篩選。

通過回歸分析，發(fā)芽率、苗高、地徑、主根長和鮮重等5個(gè)測定指標(biāo)均求得其相應(yīng)的、可信的回歸方程，對回歸方程中因素的顯著性、主次順序、系數(shù)及其檢驗(yàn)分析認(rèn)為，瓊脂用量和NAA濃度的取值偏上限(瓊脂8.8 g/L，NAA 0.8 mg/L)、6-BA濃度任取時(shí)，可更好地促進(jìn)藍(lán)桉種子萌發(fā)和幼苗生長，由此得到理論最優(yōu)處理組合為A5B5C1(瓊脂8.8 g/L，NAA 0.8 mg/L，6-BA 0.0 mg/L)。

本研究的試驗(yàn)最優(yōu)處理組合和理論最優(yōu)處理組合不一致，綜合考慮處理措施對藍(lán)桉種子萌發(fā)和幼苗生長的促進(jìn)效果以及處理措施的經(jīng)濟(jì)節(jié)約性，推薦試驗(yàn)最優(yōu)處理組合A4B3C1(瓊脂7.8 g/L，NAA 0.4 mg/L，6-BA0.0 mg/L)為藍(lán)桉實(shí)生瓶苗培育的瓊脂用量和外源激素用量。本研究構(gòu)建了藍(lán)桉實(shí)生瓶苗培育技術(shù)體系，并獲得健壯無菌的實(shí)生瓶苗，可為藍(lán)桉組培技術(shù)體系的構(gòu)建提供充足且理想的外植體材料來源。