解淀粉芽胞桿菌TR2對草莓土壤酶活性的影響與防病促生作用

趙雨萌，繆佩佩，王旭東，高坦坦，史曉藝，賈紹雷，任爭光，趙曉燕

（北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206）

草莓原產(chǎn)于南美洲，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，草莓果實味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受百姓喜愛。中國是世界上草莓生產(chǎn)大國之一，自1994年起產(chǎn)量始終居于世界第一，占全世界總產(chǎn)量的1/3[1]。隨著草莓種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，草莓病害頻頻發(fā)生，如草莓根腐病、草莓白粉病、草莓炭疽病等，草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)受到不同程度的影響[2]。正確運用化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治、生物防治等技術(shù)，能夠有效預(yù)防和控制病害的發(fā)生[3]。試驗報道，枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis按 4050 g/hm2用量單獨使用，對草莓白粉病的防治效果達92.09%[4]。貝萊斯芽胞桿菌B. velezensisZZBV-3可有效防治草莓根腐病，盆栽防治效果可達 77.96%和81.18%[5]。以生防菌為產(chǎn)品的生物防治已經(jīng)成為備受關(guān)注且有明顯效果的技術(shù)之一[6]。

解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens作為一種被廣泛應(yīng)用的生防菌，具有抑菌譜廣、防病效果好等特點[7]，解淀粉芽胞桿菌能夠分泌多種酶類如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等，也能分泌一些抗菌肽等抑菌物質(zhì)，可以拮抗多種病原物[8]。同時，解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物不僅能夠影響土壤中微生物的種群結(jié)構(gòu)，促進根際微生物趨向有利生長的方向轉(zhuǎn)變，還能夠改善土壤酶活性，增強土壤肥力，有利于土壤環(huán)境的健康發(fā)展[9]。

良好的土壤環(huán)境條件能夠促進植物的生長和發(fā)育，是植物生存發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是整個生態(tài)系統(tǒng)的樞紐[10]。土壤酶參與各種養(yǎng)分的合成和釋放、有機質(zhì)的循環(huán)利用以及不同方向的生理生化反應(yīng)過程，土壤酶活性的高低直接影響土壤肥力的大小和土壤微生態(tài)環(huán)境，進而影響植物的生長發(fā)育[11]。

為了探究解淀粉芽胞桿菌對土壤酶活性的影響以及對草莓的防病促生作用，本試驗通過解淀粉芽胞桿菌TR2對草莓的田間灌根處理，在不同時期采集土壤進行酶活測定，監(jiān)測酶活的變化趨勢和差異，同時對草莓根長、根重、葉面積、新葉數(shù)和果實數(shù)量、最大單果重等生長相關(guān)數(shù)據(jù)進行測量，調(diào)查生長階段草莓根腐病的發(fā)生率，為闡明生防解淀粉芽胞桿菌對土壤酶活性的影響及其防病促生作用機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciensTR2由北京農(nóng)學(xué)院植物病理實驗室保存。

草莓品種：紅顏；栽培方式：溫室起壟栽培。

LA（固體）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，水1000 mL。

LB（液體）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 生防菌的發(fā)酵 取出-80 ℃冰箱中保存的解淀粉芽胞桿菌TR2，在LA平板上進行劃線分離活化，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。取活化后的TR2單菌落在裝有5 mL 液體LB培養(yǎng)基的試管中進行小量過夜搖培，溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速220 r/min，然后按1:100的比例接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中進行大量搖培發(fā)酵，條件同前，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，使菌液濃度達到2×108CFU/mL。

1.2.2 田間灌根處理 溫室草莓定植一周（2020年9月18日）后，將發(fā)酵菌液稀釋成60倍液進行灌根處理。溫室為東西向起壟，共8壟，中間的6壟為試驗區(qū)域（如圖1所示），分為TR2處理區(qū)與對照處理區(qū)，每壟為一個重復(fù)，共6個重復(fù)，每個重復(fù)25株，處理之間間隔區(qū)為10株苗。每株灌根稀釋后的菌液100 mL，對照組澆灌同樣稀釋60倍的LB培養(yǎng)基100 mL。在第7 d重復(fù)灌根一次加強處理。

圖1 田間處理圖示Fig. 1 The design of the field trial

1.2.3 樣品采集 分別在第一次灌根后的第1、7、15、30、60 d進行樣品采集，取樣時每壟取兩株草莓，包括植株與根系周圍直徑5 cm范圍，深至主根系末端的土壤，隨后在4 ℃冰箱內(nèi)妥善保存。

1.2.4 土壤酶活測定 試驗共測定4種草莓土壤酶活性，其中土壤脲酶活性測定采用苯酚納比色法，土壤過氧化氫酶活性測定采用高錳酸鉀滴定法，土壤蔗糖酶進行活性測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法，土壤磷酸性酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法，分為酸性磷酸酶和堿性磷酸酶兩種活性[12-14]。

1.2.5 草莓生長指標(biāo)測定 充分清洗植株根系后，測量草莓的根長、根重、葉面積和新葉數(shù)（指除移栽前的老葉之外的葉片）等相關(guān)生長數(shù)據(jù)。

草莓葉面積采用吐德拉草莓葉面積法進行估算，取每個植株最大的葉片測量葉片寬度，計算公式[15]如下：葉面積y＝7.0918x－13.4784，x為葉寬，單位cm。

待果實成熟后（定植后90 d）采收，記錄單株草莓中已成熟的果實數(shù)量，并利用電子天平稱量單株草莓的最大單果重量。

1.2.6 草莓根腐病發(fā)病率和防效調(diào)查 在第一次施藥后第7、15、30和60 d時調(diào)查田間TR2處理區(qū)和對照區(qū)草莓根腐病的發(fā)病情況，統(tǒng)計草莓死苗數(shù)量計算發(fā)病率，并計算解淀粉芽胞桿菌TR2對草莓根腐病的防治效果。死苗率（%）＝死苗株數(shù)/總調(diào)查株數(shù)×100，防效（%）＝（對照死苗率－處理死苗率）/對照死苗率×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用ANOVA單因素（LSD法）進行TR2處理組和對照組的差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽胞桿菌TR2對土壤酶活性的影響

解淀粉芽胞桿菌TR2處理對草莓土壤酶活性的影響如圖2所示，在60 d的試驗過程中，土壤的各種酶活性都呈上升的趨勢，包括脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶、磷酸酶等，而且TR2處理的土壤酶活高于對照，說明解淀粉芽胞桿菌TR2處理對草莓土壤的4種酶活性都有促進作用。

圖2 解淀粉芽胞桿菌TR2對土壤酶活性的影響Fig. 2 Effect ofBacillus amyloliquefaciensTR2 on soil enzyme activity

解淀粉芽胞桿菌TR2處理對草莓土壤脲酶活性和蔗糖酶活性的促進作用較好。其中對脲酶的促進作用表現(xiàn)最早且延續(xù)時間長，在第7、15、30和60 d，TR2處理的草莓土壤脲酶活性與對照有顯著差異，比對照分別高出148%、44%、215%和39%，其中第30 d時的促進作用最好（圖2A）。解淀粉芽胞桿菌TR2處理從第15 d開始表現(xiàn)對草莓土壤蔗糖酶活性的明顯促進作用，在第15、30和60 d，TR2處理的草莓土壤蔗糖酶活性比對照分別高出33%、124%和44%，差異顯著，其中第30 d時的促進作用最好（圖2B）。

解淀粉芽胞桿菌TR2處理對草莓土壤過氧化氫酶活性的促進作用表現(xiàn)比較晚，從第30 d開始處理與對照的差異具有顯著性，第30 d和第60 d比對照組分別高出38%和43%，其中在第60 d時的促進作用最好（圖2C）。

土壤磷酸酶分酸性磷酸酶和堿性磷酸酶兩種形式，在第15 d和第60 d時，解淀粉芽胞桿菌TR2處理對草莓兩種土壤磷酸酶活性的促進作用具有顯著性。在第15 d時，TR2處理的土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性分別比對照高出69%和45%；在第60 d時，TR2處理的土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性分別比對照高出27%和49%。綜合來看，TR2處理在第15 d時對土壤磷酸酶的促進作用最好（圖2D）。

2.2 解淀粉芽胞桿菌TR2對草莓生長的影響

解淀粉芽胞桿菌TR2對草莓生長的影響如圖3和表1所示，在60 d的試驗過程中，處理組草莓的各種生長指標(biāo)都大于對照組，包括草莓根長、根重、草莓新葉數(shù)和最大葉面積，草莓的單株成熟果實數(shù)量和最大單果重量等，說明解淀粉芽胞桿菌TR2對草莓的生長具有促進作用。

圖3 解淀粉芽胞桿菌TR2對草莓植株生長的影響Fig. 3 Effect ofBacillus amyloliquefaciensTR2 on strawberry growth

表1 解淀粉芽胞桿菌TR2對草莓果實生長的影響Table 1 Effect ofB.amyloliquefaciensTR2 on strawberry fruit growth

在定植后90 d試驗調(diào)查時，單株成熟果實數(shù)與最大單果重都與對照有顯著差異，處理組單株的成熟果實平均比對照多將近4個，平均最大單果重是對照的兩倍（表1），說明解淀粉芽胞桿菌TR2能夠有效促進果實的成熟，提前果實的成熟時間，也能夠有效增加果實的重量。

解淀粉芽胞桿菌TR2處理從第7 d開始就表現(xiàn)對草莓根部生長的促進作用，第7、30、60 d的根長和7～60 d的根重都與對照有顯著差異，對根長的促進作用在20%左右；對根重的促進作用更好，第60 d時，處理組根重比對照組高出92%。解淀粉芽胞桿菌TR2處理對地上部分生長的促進作用從第15 d以后開始顯現(xiàn)，第15 d和第30 d的最大葉面積和新葉數(shù)都與對照有顯著差異，15 d時平均最大葉面積比對照大10 cm2，第30 d時平均每株比對照多長出1.2個新葉。

2.3 解淀粉芽胞桿菌TR2對草莓根腐病的防病作用

在試驗過程中，田間草莓根腐病的發(fā)生率在20%以內(nèi)，解淀粉芽胞桿菌TR2處理組草莓根腐病的發(fā)病率始終低于對照組，在15～60 d處理組的死苗率與對照組都有顯著差異，防效在25%左右（表2）。說明解淀粉芽胞桿菌TR2灌根處理可以減少草莓根腐病的發(fā)生，具有較好的防病作用。

表2 解淀粉芽胞桿菌TR2對草莓根腐病的防病作用Table 2 Control effect ofB.amyloliquefaciensTR2 on strawberry root rot

3 討論

土壤酶活性是土壤的重要理化指標(biāo)，一般認(rèn)為，土壤環(huán)境中土壤酶的活性程度越高，土壤肥力越高[16,17]。本研究結(jié)果表明，解淀粉芽胞桿菌TR2處理后對草莓根際周圍土壤的脲酶、淀粉酶、過氧化氫酶及磷酸酶等4種酶活性均具有促進作用，同時表現(xiàn)出對根長、根重、葉片生長以及果實生長與成熟的促進作用，說明解淀粉芽胞桿菌TR2的促生作用可能與其能夠提高土壤酶活性，從而提高了土壤的肥力有關(guān)。

土壤酶活性與土壤中的氮素循環(huán)、碳素循環(huán)、微生物的量及活性密切相關(guān)[18-21]。本研究結(jié)果表明，解淀粉芽胞桿菌TR2從第7 d開始就陸續(xù)對脲酶、淀粉酶、過氧化氫酶及磷酸酶等4種酶活性表現(xiàn)明顯促進作用，并且到第60 d時仍然對4種酶活性具有明顯的促進作用，促進作用的持續(xù)時間較長。趙艷等[22]研究表明施用膠質(zhì)芽胞桿菌菌劑對黑麥草根際土壤脲酶、磷酸酶及過氧化氫酶活性在苗期、中期和收獲期均高于對照，也表現(xiàn)出比較長期的促進作用。而高吉坤等[23]研究的枯草芽胞桿菌B29對黃瓜根際土壤脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶和磷酸酶活性的促進作用僅在0～20 d期間內(nèi)比較明顯，到第30 d或40 d時與對照沒有明顯差異。由此可見，生防菌的施用能有利于土壤酶活性的提高，但是不同菌株對土壤酶活的促進能力不同。

解淀粉芽胞桿菌TR2是一株對多種病原菌具有抑菌活性的菌株，前期研究表明該菌株能夠減輕西瓜枯萎病的發(fā)生，并且具有較好的解磷解鉀能力[24]；本研究進一步證明了該菌株可以促進草莓土壤的酶活性和草莓的生長，減少田間草莓根腐病的發(fā)生，因此該菌株是一株具有良好潛力的土傳病害生防菌株，具有較好的應(yīng)用前景。一般認(rèn)為，生防菌對植物病害的防病機制主要有拮抗作用、促生作用、誘導(dǎo)抗性作用以及對微生物群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用[25]。本研究雖然明確了解淀粉芽胞桿菌TR2對土壤酶活性的促進作用，但對于與土壤酶活性密切相關(guān)的土壤中微生物的量與群落結(jié)構(gòu)的變化，以及之間的關(guān)系并不清楚。因此，繼續(xù)開展該菌株在草莓根際的定殖動態(tài)以及對微生物群落結(jié)構(gòu)調(diào)控作用的研究，進一步明確該菌株的生防機制，為更好地開發(fā)和應(yīng)用該菌株打下基礎(chǔ)。