獨(dú)立于常規(guī)抗菌活性的生防新機(jī)制
——產(chǎn)酶溶桿菌OH11的故事與啟示

王冰鑫，申 希，沈丹宇，林 龍，錢國(guó)良

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095）

抗菌活性和誘導(dǎo)抗性是兩種熟知的生防機(jī)制，其中基于抗菌活性的平板拮抗也是目前國(guó)內(nèi)外常用且有效的生防菌篩選與評(píng)價(jià)的指標(biāo)[1]。例如，放線菌、芽胞桿菌和假單胞菌等主要植物病害生防細(xì)菌均可合成和外泌結(jié)構(gòu)多樣的次生抗菌活性物質(zhì)來(lái)抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、真菌、卵菌和線蟲等多種植物病原物的生長(zhǎng)[2,3]?；诳咕钚缘暮Y選，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)成功分離鑒定了數(shù)十至數(shù)百種生防微生物，并且從中開發(fā)了多種基于抗菌活性物質(zhì)的生物農(nóng)藥，如井岡霉素、阿維菌素和申嗪霉素[2,4,5]。

溶桿菌是一類在自然生態(tài)環(huán)境中廣泛存在的革蘭氏陰性細(xì)菌，目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的溶桿菌種已超過40多種，它們分離于復(fù)雜多樣的自然生境，包括溫泉、深海、農(nóng)田、根際土壤和植物葉片等[6,7]。目前至少5個(gè)溶桿菌的種或菌株被報(bào)道具有植物病害生物防治活性。例如國(guó)內(nèi)外報(bào)道的產(chǎn)酶溶桿菌菌株N4-7、3.1T8、C3、OH11；抗生素溶桿菌菌株MAD009、13-1、HS124、HY；辣椒溶桿菌菌株YC5194T、PG4、YS1215、AZ78；膠狀溶桿菌菌株OH17和變棕溶桿菌菌株OH23等[8-12]。這些生防溶桿菌均可產(chǎn)生次生抗菌代謝產(chǎn)物來(lái)拮抗植物病原細(xì)菌、真菌、卵菌或線蟲[13]。

產(chǎn)酶溶桿菌OH11是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院于2009年從辣椒根際土壤中分離鑒定的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，也是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道的一株產(chǎn)酶溶桿菌菌株[14]。該菌株能合成并外泌一種新結(jié)構(gòu)、低毒性、廣譜高效的大環(huán)內(nèi)酰胺類的抗真菌活性物質(zhì)，稱為熱穩(wěn)定抗真菌因子——HSAF[15]。HSAF對(duì)植物病原真菌和卵菌具有廣譜抗菌活性[15]。然而HSAF對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌缺乏抑菌活性，加之菌株OH11在室內(nèi)對(duì)植物病原細(xì)菌也沒有抑菌活性或活性較弱，因此過去長(zhǎng)期認(rèn)為菌株OH11不能通過代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的常見抗菌活性來(lái)防控植物病原細(xì)菌病害。

近期，本研究組以產(chǎn)酶溶桿菌OH11為對(duì)象報(bào)道了一種獨(dú)立于常見平板抗菌活性的生防新機(jī)制[16]。我們發(fā)現(xiàn)菌株OH11可以通過“零距離”（接觸依賴）的方式迅速“殺死”接觸者（其他細(xì)菌）。OH11為何擁有這種能力？我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)OH11的基因組中編碼了一套完整的細(xì)菌四型蛋白分泌系統(tǒng)（T4SS）。該系統(tǒng)在革蘭氏陰性細(xì)菌中過去主要認(rèn)為是轉(zhuǎn)運(yùn)DNA和非毒性蛋白[17]。殺菌型T4SS首次在植物病原細(xì)菌——柑橘潰瘍病菌中被發(fā)現(xiàn)，隨后動(dòng)物病原細(xì)菌——嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌中被證實(shí)也擁有該系統(tǒng)[18,19]。與轉(zhuǎn)運(yùn)DNA和非毒性蛋白的典型T4SS系統(tǒng)不同，殺菌型T4SS主要通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸的方式向鄰近細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)N端含有XVIPCD碳端保守結(jié)構(gòu)域的毒素蛋白來(lái)抑制對(duì)方的生長(zhǎng)[18]。值得一提的是，接觸型殺菌系統(tǒng)是近年來(lái)動(dòng)植物病原細(xì)菌中廣泛研究的一種新系統(tǒng)，其中以六型分泌系統(tǒng)（T6SS）為主流。與殺菌型T4SS類似，絕大多數(shù)T6SS也是通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸的方式向同生態(tài)位的細(xì)菌或真菌細(xì)胞中注射毒性效應(yīng)蛋白來(lái)抑制對(duì)方的生長(zhǎng)[20]?？上У氖?，T6SS目前在生防細(xì)菌中只有一項(xiàng)研究報(bào)道：惡臭假單胞通過T6SS可以在植物（煙草）細(xì)胞內(nèi)殺死多種植物病原細(xì)菌[21]。

如何確認(rèn)菌株 OH11是通過 T4SS來(lái)發(fā)揮接觸依賴的殺細(xì)菌活性的？我們發(fā)現(xiàn)在濾膜隔離的情況下，OH11則不能殺死參試的細(xì)菌，表明接觸依賴是OH11發(fā)揮殺細(xì)菌活性的關(guān)鍵。同時(shí)只有通過敲除OH11中T4SS的合成/組裝基因，破壞OH11的T4SS組裝才能抑制該菌株通過接觸依賴的方式來(lái)殺死細(xì)菌。同時(shí)，OH11基因組中包含了16個(gè)具有典型XVIPCD結(jié)構(gòu)域的T4SS效應(yīng)蛋白，并且其中數(shù)個(gè)效應(yīng)蛋白被證明具有殺細(xì)菌活性，進(jìn)一步佐證了菌株OH11通過T4SS來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴的殺細(xì)菌行為[16]。

OH11擁有T4SS有何優(yōu)勢(shì)？研究發(fā)現(xiàn)，OH11的T4SS在攻擊對(duì)象上不能區(qū)分有益和病原細(xì)菌。OH11利用 T4SS能攻擊生防假單胞菌。通過這種攻擊（生長(zhǎng)抑制），OH11能排斥生防假單胞菌去捕食病原真菌或細(xì)菌，進(jìn)而通過自身的 HSAF或 T4SS去殺滅真菌或細(xì)菌，從而獨(dú)享“美食”[16]。OH11利用 T4SS還能抑制細(xì)菌性軟腐病菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而作為一種重要且獨(dú)特的生防機(jī)制保護(hù)植物（胡蘿卜）免受軟腐病菌的侵染[16]。

產(chǎn)酶溶桿菌OH11利用T4SS實(shí)現(xiàn)接觸依賴殺細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)不僅揭示了一種獨(dú)立于常規(guī)平板拮抗活性之外的生防新機(jī)制，也為后續(xù)利用這種“零距離”殺菌活性作為新（額外）的生防菌篩選新指標(biāo)奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。這一發(fā)現(xiàn)不僅有利于挖掘新的生防微生物資源，同時(shí)也能重新審視那些過去沒有平板抗菌活性的農(nóng)業(yè)有益微生物，拓寬農(nóng)用微生物資源的利用途徑。同樣，本研究的新發(fā)現(xiàn)也為復(fù)合微生物菌劑或菌肥的研發(fā)提供了新觀點(diǎn)：本研究的發(fā)現(xiàn)揭示在液體培養(yǎng)時(shí)（細(xì)胞-細(xì)胞接觸的概率低）如果兩種性能優(yōu)良且功能互補(bǔ)的生防細(xì)菌沒有發(fā)現(xiàn)相互拮抗時(shí)，也不能意味著這兩種生防細(xì)菌就可以兼容并被研發(fā)為復(fù)合微生物菌劑或菌肥，因?yàn)檠邪l(fā)常用的固體型復(fù)合微生物菌劑或菌肥過程中，這兩種生防細(xì)菌之間會(huì)發(fā)生細(xì)胞-細(xì)胞接觸，這會(huì)誘發(fā)接觸型殺菌系統(tǒng)T4SS或T6SS的啟動(dòng)，進(jìn)而會(huì)大幅度降低其中一種或兩種生防細(xì)菌的數(shù)量，顯著降低復(fù)合生防微生物菌劑或菌肥的性能。