基于殼聚糖/氧化石墨烯/硅藻土固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定茶葉中多種農(nóng)藥殘留

胡高華，曹建榮，楊蕾文宣，王晨，周蘇娟，劉新，魯成銀，陳紅平，馬桂岑

基于殼聚糖/氧化石墨烯/硅藻土固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定茶葉中多種農(nóng)藥殘留

胡高華1,2,3,4，曹建榮1,3,4，楊蕾文宣1,2,3,4，王晨1,3,4，周蘇娟1,3,4，劉新1,3,4，魯成銀1,3,4，陳紅平1,3,4，馬桂岑1,3,4*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（杭州），浙江 杭州 310008

利用前期合成的殼聚糖/氧化石墨烯/硅藻土固相萃取柱高效吸附茶葉基質(zhì)，結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS），建立了茶葉中46種農(nóng)藥殘留的分析方法。茶葉樣品經(jīng)乙腈提取，固相萃取柱凈化，乙腈淋洗等樣品前處理，UPLC-MS/MS分析46種農(nóng)藥殘留。結(jié)果表明，該新型固相萃取凈化柱可以高效吸附去除茶葉基質(zhì)，大大降低基質(zhì)效應(yīng)，綠茶、紅茶和烏龍茶中農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)分別下降了4.7%～66.5%，3.2%～35.5%和4.4%～42.8%。在3個(gè)加標(biāo)水平下，46種農(nóng)藥回收率在61.5%～118%線性良好，相關(guān)系數(shù)（2）均大于0.98。所建立方法具有吸附劑用量少、省時(shí)、無需基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、可以檢測(cè)不同茶類多農(nóng)殘和定量限低等優(yōu)點(diǎn)。

殼聚糖/氧化石墨烯/硅藻土；基質(zhì)凈化；農(nóng)藥殘留；茶葉；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

農(nóng)藥在提高茶葉產(chǎn)量上有著重要作用，然而，因其被大量的使用所帶來的殘留，可能對(duì)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生威脅[1-2]。隨著人們對(duì)美好生活的向往，對(duì)茶葉質(zhì)量安全也提出了更高的要求。目前，政府不斷地加強(qiáng)對(duì)茶葉中農(nóng)藥殘留的監(jiān)管力度。茶葉中痕量農(nóng)藥殘留的直接檢測(cè)十分困難，茶葉中含有大量茶多酚、生物堿、色素等物質(zhì)會(huì)嚴(yán)重干擾痕量農(nóng)藥殘留的分析[3]。對(duì)于茶葉復(fù)雜基質(zhì)來說，必須進(jìn)行有效地凈化前處理，以降低基質(zhì)對(duì)農(nóng)藥檢測(cè)的干擾。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜具有高的靈敏度和選擇性，被廣泛應(yīng)用于痕量農(nóng)藥殘留的定性和定量分析[4]。然而基質(zhì)對(duì)電噴霧電離（ESI）具有很強(qiáng)的信號(hào)干擾作用，這種作用被稱為基質(zhì)效應(yīng)[5-6]。基質(zhì)效應(yīng)是被分析物在其他化合物存在下電離效率的變化，表示為殘留農(nóng)藥在基質(zhì)中相對(duì)于溶劑中的信號(hào)響應(yīng)。對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)來說，如茶葉基質(zhì)，往往表現(xiàn)出非常強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)[7]。為了最大限度地降低這種基質(zhì)效應(yīng)，研究人員嘗試提高色譜的選擇性，將痕量農(nóng)藥與基質(zhì)干擾物分離[8]或使用不同的流動(dòng)相[9]，改變前處理方法[10]等。對(duì)于一些非常強(qiáng)的、基質(zhì)效應(yīng)不能降低的農(nóng)藥，可采用一些方法進(jìn)行補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，如使用同位素標(biāo)記[11]、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液[12]、稀釋補(bǔ)償[13-14]等。然而同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價(jià)格昂貴，且有些農(nóng)藥沒有同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液是目前應(yīng)用最多的一種補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的方法，但是其需要較多空白樣品，且基質(zhì)不同，需要配制不同的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。稀釋補(bǔ)償往往需要稀釋上百倍來降低基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)儀器的靈敏度提出了更高的要求。目前，克服茶葉基質(zhì)效應(yīng)仍然是一個(gè)難題。

本研究利用本實(shí)驗(yàn)室合成得到的新型殼聚糖/氧化石墨烯/硅藻土（CS/GO/DM）復(fù)合材料，分析其對(duì)不同茶類（綠茶、紅茶、烏龍茶）基質(zhì)的凈化效果。以茶園中使用或茶葉樣品中可能檢出的農(nóng)藥包括新煙堿類、有機(jī)磷、氨基甲酸酯和除草劑等46種農(nóng)藥為研究對(duì)象，使用CS/GO/DM復(fù)合材料填充固相萃取凈化小柱，嘗試開發(fā)一種改良的QuEChERS方法的前處理過程，并結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，旨在建立一種簡(jiǎn)單可靠、能克服基質(zhì)效應(yīng)的茶葉多農(nóng)藥殘留分析方法，并為其他多酚類植物、咖啡等樣品多農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供了一種新的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-30A超高效液相色譜系統(tǒng)（日本，島津公司），AB Sciex TQ 5500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國，SCIEX公司），HYQ-2121A渦旋混勻器（中國，蘇州捷美電子有限公司），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（中國，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），KQ-500B超聲波清洗器（中國，昆山市超聲儀器有限公司），DGG-9240B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（中國，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），TW12通用水浴鍋（德國，JULABO公司），SIM凍干機(jī)（中國，金西盟儀器有限公司），SHZ-DⅢZ循環(huán)水真空泵（中國，鞏義市予華儀器有限公司）；離心機(jī)（德國，Sigma公司）。

46種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司和上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，石墨粉（光譜純）、濃硫酸（分析純）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，硝酸鈉、高錳酸鉀、乙酸（分析純）和30%過氧化氫（分析純）均購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，硅藻土、殼聚糖（脫乙酰度≥95%，黏度100～200?mPa·s）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 茶樣

茶葉樣品均來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 CS/GO/DM固相萃取凈化柱的制備

本研究以氧化石墨烯（GO）、硅藻土（DM）和殼聚糖（CS）為原料，通過一步水熱合成法結(jié)合冷凍干燥技術(shù)得到CS/GO/DM復(fù)合材料[15]。具體步驟如下：首先通過改進(jìn)的Hummers等[16]方法合成得到氧化石墨烯材料。將150?mg氧化石墨烯與200?mg硅藻土分散在5?mL去離子水中，混合攪拌15?min，混合均勻后超聲1?h。超聲結(jié)束后，向上述溶液中加入1?mL 1%的殼聚糖溶液并繼續(xù)攪拌1?h。隨后100℃水浴加熱3?h，冷凍干燥24?h，即得到CS/GO/DM復(fù)合材料。將該復(fù)合材料填充到6?mL注射器中，制備CS/GO/DM固相萃取凈化柱。取10?mL去離子水和2?mL乙腈分別通過該凈化柱，進(jìn)行預(yù)處理，備用。

1.3.2 樣品前處理

稱取2.00?g（精確至0.01?g）粉碎的茶葉試樣于50?mL離心管，加入5?mL去離子水和20?mL乙腈，渦旋振蕩30?min，加入5?g氯化鈉，以10?000?r·min-1離心10?min。吸取1?mL上清液通過CS/GO/DM固相萃取凈化柱凈化，并用4?mL乙腈淋洗，濾液和淋洗液合并，經(jīng)尼龍濾器過濾，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析。

1.3.3 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)單標(biāo)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10?mg于10?mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成1?000?mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，裝入棕色瓶中并在4℃下保存。

標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲(chǔ)備溶液：取80?μL各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到同一個(gè)10?mL容量瓶中，再用乙腈稀釋定容至10?mL，配置成8?mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，裝入棕色瓶中并在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100?μg·L-1和200?μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用茶葉空白樣品經(jīng)CS/GO/DM固相萃取凈化柱處理得到基質(zhì)溶液，稀釋至1?mL，配制濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100?μg·L-1和200?μg·L-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.4 儀器條件

色譜條件：ACQUITY UPLC? HSS T3(2.1?mm×100?mm，1.8?μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸＋1?mmol·L-1甲酸銨水溶液；B為0.1%甲酸＋1?mmol·L-1甲酸銨甲醇。梯度洗脫程序：0～1.0?min，90% A；1.0～1.5?min，90%～50% A；1.5～7.0?min，50%～2% A；7.0～11.0?min，2%～2% A；11.0～11.1?min，2%～90% A。流速：0.25?mL·min-1；進(jìn)樣量：1.0?μL。

質(zhì)譜條件：離子源和掃描方式：CPF（CPF-D10）和TCP分別采用電噴霧正離子掃描方式（ESI+）；檢測(cè)方式：可同時(shí)進(jìn)行不同時(shí)間段多種分析物檢測(cè)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（sMRM）；離子源：電噴霧離子源（ESI），溫度500℃，電壓5?500?V（ESI+）；霧化氣（GS1）壓力：50.0?kPa；輔助氣（GS2）壓力：50.0?kPa；氣簾氣（Curtain gas）壓力：35.0?kPa。定性與定量離子對(duì)、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）及保留時(shí)間如表1所示。

表1 46種農(nóng)藥的UPLC-MS/MS參數(shù)

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2.1 CS/GO/DM固相萃取凈化柱用于茶葉樣品前處理

以殼聚糖、氧化石墨烯、硅藻土為原料，在較溫和的條件下，通過一步水熱法合成得到CS/GO/DM復(fù)合材料。將該復(fù)合材料填充成固相萃取凈化柱，用于茶葉樣品前處理。具體前處理步驟如下：粉碎后的茶葉經(jīng)水潤濕、乙腈渦旋提取，加入氯化鈉除水，上清液經(jīng)CS/GO/DM固相萃取凈化柱凈化，用乙腈淋洗物理吸附在凈化柱上的農(nóng)藥，收集合并凈化液，過膜備用。茶葉樣品前處理流程如圖1所示。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 淋洗劑的選擇

當(dāng)茶葉提取液直接通過CS/GO/DM固相萃取凈化柱時(shí)，除了會(huì)大量吸附茶葉中的茶多酚、咖啡堿和色素等干擾成分之外，還會(huì)吸附一部分農(nóng)藥殘留，因此需要對(duì)淋洗劑進(jìn)行優(yōu)化。選擇乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）、乙腈/甲醇混合液（ACN∶MeOH=2∶1）為淋洗液，考察其淋洗能力。結(jié)果如圖2-a所示，當(dāng)以甲醇為淋洗劑時(shí)，46種農(nóng)藥的回收率在54.8%～79.7%，其中13種農(nóng)藥的回收率低于70%。以乙腈/甲醇為淋洗劑時(shí)，農(nóng)藥回收率在58.1%～88.5%，其中40種農(nóng)藥的回收率低于70%。然而以乙腈為淋洗劑時(shí)，46種農(nóng)藥的回收率在83%～120%，表明乙腈對(duì)物理吸附在CS/GO/DM固相萃取凈化柱上的農(nóng)藥具有很好的淋洗效果，因此選擇乙腈作為本試驗(yàn)的淋洗劑。

2.2.2 淋洗劑體積的優(yōu)化

選擇乙腈為淋洗劑時(shí)，對(duì)淋洗體積進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)茶葉提取液直接通過CS/GO/DM固相萃取凈化柱時(shí)，有29種農(nóng)藥的回收率在50%～85%。選擇回收率小于50%的17種農(nóng)藥對(duì)淋洗劑體積進(jìn)一步優(yōu)化。當(dāng)茶葉提取液通過CS/GO/DM固相萃取凈化柱后，用乙腈淋洗5次，每次1?mL。結(jié)果如圖2-b所示，隨著淋洗劑體積的增加，農(nóng)藥被乙腈淋洗下來，回收率逐漸增加。當(dāng)淋洗劑體積從1?mL增加到4?mL時(shí)，17種農(nóng)藥的回收率從52.8%～101.0%增加至89.6%～117.2%。進(jìn)一步增加淋洗劑體積，農(nóng)藥回收率保持穩(wěn)定。因此選擇4?mL作為本試驗(yàn)淋洗劑的體積。

2.3 降低不同茶類基質(zhì)效應(yīng)

在農(nóng)藥殘留提取的過程中，茶葉中的茶多酚、咖啡堿、色素等物質(zhì)會(huì)伴隨著痕量農(nóng)藥殘留被提取出來，對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)造成干擾。不同茶類之間，茶葉基質(zhì)成分及含量有所不同，對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)造成的干擾程度不同[14]。通常我們把這種干擾稱之為基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式如下：

基質(zhì)效應(yīng)=（A/B－1）×100%

其中A為目標(biāo)物在基質(zhì)中峰面積，B為目標(biāo)物在溶劑中的峰面積。基質(zhì)效應(yīng)值等于0表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。正負(fù)值分別表示基質(zhì)化合物對(duì)分析物信號(hào)的增強(qiáng)和抑制作用。

根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)值的大小，基質(zhì)效應(yīng)被分為強(qiáng)、中、弱基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)值大于50%或小于–50%是強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，在–50%～–20%或20%～50%的稱為中基質(zhì)效應(yīng)，位于–20%～20%的是弱基質(zhì)效應(yīng)[13]。

不同茶類對(duì)不同農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)不同。如圖3-a所示。綠茶基質(zhì)對(duì)46種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)在–74.7%～–3.19%，其中強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥有8種，分別為噻蟲胺、吡蟲啉、氯噻啉、乙草胺、滅多威、硫環(huán)磷、3-羥基克百威和異丙威，中基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥有19種，弱基質(zhì)效應(yīng)有19種；紅茶基質(zhì)對(duì)46種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)在–63.4%～–0.8%，其中強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥有4種，分別為噻蟲胺、氯噻啉、吡蟲啉和敵敵畏，中基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥有8種，弱基質(zhì)效應(yīng)有34種；烏龍茶基質(zhì)對(duì)46種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)在–69.7%～–18.1%，其中強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥有4種，分別為氯噻啉、噻蟲胺、敵敵畏和吡蟲啉，中基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥有36種，弱基質(zhì)效應(yīng)有6種。這些結(jié)果表明，茶葉基質(zhì)對(duì)46種農(nóng)藥殘留具有較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)。相對(duì)于紅茶和烏龍茶，綠茶基質(zhì)對(duì)46種農(nóng)藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)最強(qiáng)；綠茶、紅茶和烏龍茶基質(zhì)都會(huì)對(duì)噻蟲胺、氯噻啉和吡蟲啉3種農(nóng)藥造成強(qiáng)基質(zhì)干擾。

CS/GO/DM固相萃取凈化柱對(duì)不同茶類茶葉基質(zhì)具有較好的凈化效果，能大大降低基質(zhì)效應(yīng)。如圖3-a所示，當(dāng)綠茶基質(zhì)經(jīng)過CS/GO/DM固相萃取凈化柱凈化過后，農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)為–27.5%～21.9%（3種）和–13.0%～14.2%（43種），8種強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥下降最為明顯，其中噻蟲胺的基質(zhì)效應(yīng)從–74.7%下降到–22.5%，吡蟲啉的基質(zhì)效應(yīng)從–69.8%下降到–27.5%，氯噻啉的基質(zhì)效應(yīng)從–67.9%下降到–13.0%，乙草胺的基質(zhì)效應(yīng)從–64.4%下降到2.2%，滅多威的基質(zhì)效應(yīng)從–64.0%下降到–0.67%，硫環(huán)磷的基質(zhì)效應(yīng)從–55.7%下降到–0.04%，3-羥基克百威的基質(zhì)效應(yīng)從–55.2%下降到–6.4%，異丙威的基質(zhì)效應(yīng)從–51.6%下降到0.75%。中基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥數(shù)量從19種減少為3種，弱基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥數(shù)量由19種增加為43種。經(jīng)過CS/GO/DM固相萃取凈化柱凈化后，紅茶基質(zhì)對(duì)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)為–52.1%（1種）、–35.0%～24.8%（5種）和–12.5%～3.8%（40種），其中噻蟲胺的基質(zhì)效應(yīng)從–63.4%下降到–27.9%，氯噻啉的基質(zhì)效應(yīng)從–60.0%下降到–29.1%，吡蟲啉的基質(zhì)效應(yīng)從–59.8%下降到–35.0%，敵敵畏的基質(zhì)效應(yīng)從–57.8%下降到–52.1%。中基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥數(shù)量從8種減少為5種，弱基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥數(shù)量由34種增加為40種。經(jīng)過CS/GO/DM固相萃取凈化柱凈化后，烏龍茶基質(zhì)對(duì)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)為–58.8%（1種）、–33.2%～–26.9%（3種）和–18.8%～–2.3%（42種），其中氯噻啉的基質(zhì)效應(yīng)從–69.7%下降到–26.9%，噻蟲胺的基質(zhì)效應(yīng)從–69.6%下降到–29.9%，敵敵畏的基質(zhì)效應(yīng)從–68.3%下降到–58.8%，吡蟲啉的基質(zhì)效應(yīng)從–68.3%下降到–33.2%。中基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥數(shù)量從36種減少為3種，弱基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥數(shù)量由6種增加為42種。這些結(jié)果表明，經(jīng)CS/GO/DM固相萃取凈化柱凈化后，綠茶、紅茶和烏龍茶3種茶類對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的基質(zhì)干擾明顯降低，尤以綠茶凈化效果最顯著，其中綠茶的基質(zhì)效應(yīng)下降了4.7%～66.5%，紅茶的基質(zhì)效應(yīng)下降了3.2%～35.5%，烏龍茶的基質(zhì)效應(yīng)下降了4.4%～42.8%。

注：（a）不同淋洗劑對(duì)茶葉中農(nóng)藥的淋洗效果，（b）淋洗劑體積對(duì)農(nóng)藥回收率的影響

為了更直觀的說明CS/GO/DM固相萃取凈化柱對(duì)茶葉基質(zhì)的凈化效果，本研究對(duì)凈化前后的綠茶、紅茶和烏龍茶提取液顏色進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果如圖3-b所示。綠茶、紅茶和烏龍茶的乙腈提取液呈深綠色、紅色和黃褐色。經(jīng)CS/GO/DM固相萃取凈化柱處理后，提取液的顏色有不同程度的淡化，尤其是綠茶和烏龍茶，溶液顏色呈現(xiàn)為無色，表明CS/GO/DM固相萃取凈化柱對(duì)色素具有較好的凈化效果。進(jìn)一步利用液相色譜對(duì)凈化前后的綠茶內(nèi)含成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3-c所示。茶葉提取液含有大量的兒茶素（包括EGCG、ECG、EGC和C）和咖啡堿，經(jīng)CS/GO/DM固相萃取凈化柱凈化后，大量的兒茶素和咖啡堿被吸附去除，其中EGCG、ECG和咖啡堿去除率分別為91.6%、86.6%和99.1%，其他物質(zhì)如EGC和C的峰未被HPLC檢測(cè)到。這是因?yàn)镃S/GO/DM表面含有大量的羥基、羧基等含氧官能團(tuán)，可以有效吸附茶葉中的葉綠素、咖啡堿、ECG、EGCG等物質(zhì)。

通過對(duì)基質(zhì)效應(yīng)、提取液顏色變化、內(nèi)含成分的分析發(fā)現(xiàn)，CS/GO/DM固相萃取凈化柱能高效吸附去除不同茶類基質(zhì)中的兒茶素、咖啡堿、色素等物質(zhì)，有效地降低茶葉基質(zhì)對(duì)農(nóng)藥檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)，是一種性能優(yōu)異的凈化材料。

2.4 方法驗(yàn)證

CS/GO/DM固相萃取凈化柱可以大大降低茶葉基質(zhì)對(duì)農(nóng)藥檢測(cè)的干擾，可以作為一種高效的茶葉基質(zhì)凈化材料應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析前處理，建立一種簡(jiǎn)單、能克服基質(zhì)效應(yīng)的茶葉中多農(nóng)藥殘留分析方法。本研究將46種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖的強(qiáng)度與茶葉提取液經(jīng)CS/GO/DM固相萃取凈化柱凈化過后的農(nóng)藥強(qiáng)度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)40余種農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)可以忽略，其在茶葉基質(zhì)中的信號(hào)強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)（圖4）。利用線性范圍、檢出限、定量限和加標(biāo)回收率試驗(yàn)，對(duì)所建立的方法進(jìn)行方法驗(yàn)證。

2.4.1 線性、檢出限和定量限結(jié)果

根據(jù)1.2.3章節(jié)的方法制備一系列濃度梯度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。在3種茶類中，46種農(nóng)藥在2～100?μg·kg-1線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)2均大于0.98。采用在3種空白茶葉基質(zhì)中添加較低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的方法，確定各農(nóng)藥在茶葉基質(zhì)中的最低檢出限，以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算這些農(nóng)藥的檢出限和定量限。46種農(nóng)藥在綠茶、紅茶和烏龍茶中的檢出限相近，檢出限分別為0.01～1.09、0.01～0.97、0.01～1.33?μg·kg-1；它們的定量限分別為0.03～3.64、0.05～3.23、0.03～4.44?μg·kg-1。通過與國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥殘留最大殘留限量》和歐盟規(guī)定的茶葉中農(nóng)藥的最大限量值進(jìn)行比較，本研究所建立方法的定量限低于國標(biāo)和歐盟限量值，能滿足檢測(cè)的需求。

圖3 CS/GO/DM固相萃取凈化柱對(duì)不同茶葉的凈化效果

注：(a) 46種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液（20?μg·L-1），(b) 46種農(nóng)藥在凈化后茶葉基質(zhì)溶液中的圖譜（20?μg·L-1）

2.4.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)和精密度結(jié)果

在空白綠茶基質(zhì)中添加46種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，開展加標(biāo)回收率試驗(yàn)，以溶劑標(biāo)樣進(jìn)行回收率的計(jì)算。通過日間、日內(nèi)試驗(yàn)，考察方法的精密度，結(jié)果如表3所示。凈化后仍具有中基質(zhì)效應(yīng)的噻蟲胺和吡蟲啉的回收率較低，在0.01、0.1、0.5?mg·kg-13個(gè)加標(biāo)水平下，其他農(nóng)藥的回收率為61.5%～118.0%，能夠滿足檢測(cè)的需求。日內(nèi)和日間精密度良好。結(jié)果表明，該方法靈敏度高、重復(fù)性好。

表2 46種農(nóng)藥的線性、檢出限和定量限及國標(biāo)與歐盟規(guī)定的最大殘留限量

表3 46種農(nóng)藥加標(biāo)回收率、日內(nèi)精密度和日間精密度

2.5 與文獻(xiàn)報(bào)道方法比較

進(jìn)一步比較了一些基于SPE或dSPE前處理方法來分析茶葉中的農(nóng)藥殘留，這些方法具有良好的回收率和靈敏度。如表4所示，在報(bào)道的dSPE樣品前處理中，使用了硫酸鎂、石墨化炭黑和C18等幾種吸附劑的混合物，由于不同吸附劑涉及多個(gè)稱重步驟，因此比較耗時(shí)。除此之外，多種吸附劑的使用也導(dǎo)致吸附劑的用量很大[7,17]。在報(bào)道的SPE前處理方法中，為了達(dá)到較好的凈化效果，也使用了大量吸附劑[18-20]。本研究以一種CS/GO/DM材料為新型SPE吸附劑，具有吸附劑用量少、省時(shí)、可以檢測(cè)不同茶類多農(nóng)殘和定量限低等優(yōu)點(diǎn)。最重要的是，本研究建立的方法，克服了茶葉基質(zhì)效應(yīng)，是一種簡(jiǎn)單可靠的茶葉多農(nóng)殘的分析方法。

表4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中農(nóng)藥的方法與其他方法的比較

3 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用該方法對(duì)包括紅茶（3個(gè)）、綠茶（6個(gè)）和烏龍茶（7個(gè)）在內(nèi)的16個(gè)實(shí)際茶葉樣品進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)。結(jié)果表明，茶葉中檢出率較高的農(nóng)藥為唑蟲酰胺、吡蟲啉和噠螨靈，檢出值分別在0.01～0.95、0.01～0.19、0.01～0.14?mg·kg-1。參照GB2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》的規(guī)定[21]，16個(gè)實(shí)際樣品農(nóng)藥殘留的檢出值均未超過上述限量要求。

4 結(jié)論

本研究利用實(shí)驗(yàn)室自制的CS/GO/DM復(fù)合材料固相萃取凈化小柱，通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件，建立了一種利用CS/GO/DM復(fù)合材料為凈化材料的QuEChERS前處理方法。該凈化小柱對(duì)綠茶、紅茶和烏龍茶中茶葉基質(zhì)具有很好的吸附去除效果，能大大降低茶葉基質(zhì)對(duì)痕量農(nóng)藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)。綠茶的基質(zhì)效應(yīng)下降了4.7%～66.5%，紅茶的基質(zhì)效應(yīng)下降了3.2%～35.5%，烏龍茶的基質(zhì)效應(yīng)下降了4.4%～42.8%。所建立的方法具有較滿意的回收率、精密度和靈敏度。本方法具有吸附劑用量少、省時(shí)、可以檢測(cè)綠茶、紅茶、烏龍茶不同茶類多農(nóng)殘和定量限低等優(yōu)點(diǎn)。

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Determination of Multi-pesticide Residues in Tea Based on the Combination of CS/GO/DM SPE Column and UPLC-MS/MS

HU Gaohua1,2,3,4, CAO Jianrong1,3,4, YANG-LEI Wenxuan1,2,3,4, WANG Chen1,3,4, ZHOU Sujuan1,3,4, LIU Xin1,3,4, LU Chengyin1,3,4, CHEN Hongping1,3,4, MA Guicen1,3,4*

1.Tea Research Institute, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Hangzhou 310008, China; 2.Graduate School, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100081, China; 3.Key Laboratory of Tea Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China; 4.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Tea Products (Hangzhou), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008

In this study, the synthesized chitosan/graphene oxide/diatomite (CS/GO/DM) solid phase extraction (SPE) column cartridge was used for the purification of tea matrix.A method for determination of 46 kinds of pesticide residues in tea by using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was established.The tea samples were extracted by acetonitrile, purified by CS/GO/DM SPE column, washed by acetonitrile.Then, the target compounds of 46 pesticide residues were analyzed by UPLC-MS/MS.The results show that CS/GO/DM SPE column could efficiently remove tea interference substances, which could greatly reduce the matrix effect of pesticides in green tea, black tea and oolong tea by 4.7%-66.5%, 3.2%-35.5% and 4.4%-42.8%, respectively.The recoveries of 46 kinds of pesticides ranged from 61.5% to 118% at three spiked levels, with good linearity.The correlation coefficients (2) were all higher than 0.98.The developed method has the great advantages of operation simplicity, time saving, and high cleanup ability with only one kind towards different types of tea, no need for using matrix standard solution and a low amount of adsorbent.

CS/GO/DM, matrix purification, pesticide residues, tea, UPLC-MS/MS

S571.1；TS207.3

A

1000-369X(2022)02-249-14

2021-12-06

2022-01-09

財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS-06）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程資助（CAAS- ZDRW202011）

胡高華，男，碩士研究生，主要從事茶葉質(zhì)量安全與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究。*通信作者：mgc1314@tricaas.com

（責(zé)任編輯：黃晨）