Hedgehog通路關(guān)鍵基因在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)模式的相關(guān)研究

王仕超，任曉敏，潘園園，李霞

(呼和浩特市第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010010)

Hedgehog(Hh)信號(hào)通路在胚胎發(fā)育過程中高度保守并起到樞紐作用，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)組織分化、維持組織穩(wěn)態(tài)以及干細(xì)胞的干性等[1-2]。Hh信號(hào)通路的失調(diào)與多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，如基底細(xì)胞癌、腦膠質(zhì)瘤、肺癌及消化道腫瘤等[3-4]。常春藤膠質(zhì)細(xì)胞瘤圖譜項(xiàng)目(Ivy Glioblastoma Atlas Project，Ivy-GAP)[5]是一個(gè)建立在解剖學(xué)基礎(chǔ)上的人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)錄圖譜，其通過極為嚴(yán)格的組織病理學(xué)篩選收納了41例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的病理組織，從每個(gè)腫瘤的不同病理區(qū)域分離出122個(gè)樣本，利用激光顯微切割系統(tǒng)對(duì)腫瘤組織由內(nèi)而外進(jìn)行如下病理分區(qū)：腫瘤細(xì)胞區(qū)(cellular tumor，CT)、周圍細(xì)胞壞死區(qū)(pseudo-palisading cells around necrosis，CT-PAN)、增生性血管區(qū)(hyperplastic blood vessels in cellular tumor，CT-HBV)、腫瘤浸潤(rùn)區(qū)(infiltrating tumor，IT)、前緣(the leading edge，LE)，并在相應(yīng)區(qū)域分離RNA獲得各區(qū)間基因的信使RNA(messenger RNA，mRNA)表達(dá)量用以后續(xù)分析。此數(shù)據(jù)庫創(chuàng)建了更為全面的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)生變異的可疑分子集合，能夠更加深入地研究腫瘤異質(zhì)性。本研究數(shù)據(jù)主要來源于Ivy GAP-艾倫腦科學(xué)研究所數(shù)據(jù)庫平臺(tái)提供的較為客觀的病理組織測(cè)序等結(jié)果，并利用此平臺(tái)對(duì)Hh信號(hào)通路的8個(gè)關(guān)鍵基因 CDO兄弟同源物(brother of CDO，BOC)、SMO(Smoothened)、CDON(cell adhesion associated，oncogene regulated)、PTCH1(Patched 1)、GAS1(growth arrest specific 1)、HHIP(Hedgehog inte-racting protein)、腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物(glioma-associated oncogene homolog，GLI)、SHH(Sonic Hedgehog)在不同的腦膠質(zhì)瘤病理分區(qū)、分子亞型、甲基化與否等條件下呈現(xiàn)的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以評(píng)估這些基因在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)支持 征募患者的臨床和基因組數(shù)據(jù)可在Ivy GAP臨床和基因組數(shù)據(jù)庫(ivygap.swedish.org/home)中獲得。在Ivy GAP數(shù)據(jù)庫下載頁面(http://glioblastoma.alleninstitute.org/static/download.html)主要顯示兩部分內(nèi)容，第一部分為腫瘤、解剖結(jié)構(gòu)(腫瘤特征)及研究樣本的概要信息，包括患者及腫瘤信息、每個(gè)腫瘤亞塊的圖像及解剖結(jié)構(gòu)、每個(gè)腫瘤亞塊各解剖結(jié)構(gòu)的基因表達(dá)列表、研究樣本的RNA-Seq數(shù)據(jù)；第二部分為RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，包括所有樣本的歸一化基因水平FPKM值(如RNA-Seq頁面)(zip)，每個(gè)樣本的非標(biāo)準(zhǔn)化基因級(jí)FPKM和TPM值的文件URL (csv)，用于處理RNA-Seq數(shù)據(jù)的參考基因組(zip)等一系列相關(guān)文件。

1.2數(shù)據(jù)方案 基于上述平臺(tái)提供的數(shù)據(jù)支持，本研究主要針對(duì)Hh信號(hào)通路的關(guān)鍵基因在腦膠質(zhì)瘤的不同病理分區(qū)、分子亞型[6]、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)基因突變及O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyl-transferase，MGMT)基因甲基化狀態(tài)4個(gè)層面進(jìn)行深入分析，主要分析依據(jù)為基因的mRNA表達(dá)水平。

①分析Hh信號(hào)通路的8個(gè)關(guān)鍵基因(BOC、SMO、CDON、PTCH1、Gas1、HHIP、GLI、SHH)在腦膠質(zhì)瘤的5個(gè)病理分區(qū)(CT、CT-PAN、CT-HBV、LE、IT)的表達(dá)模式。LE部分腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的比值為(1～3)∶100。IT是位于LE和CT之間的中間條帶，通常以星狀突起為標(biāo)志。CT作為腫瘤組織的核心區(qū)域，其腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的比例為100∶1～500∶1。CT-PAN是由假胞質(zhì)樣細(xì)胞形成的一段狹窄壞死邊界，CT-HBV是一種在腫瘤中隨處可見的內(nèi)壁增厚的血管增殖區(qū)域。②分析上述基因在經(jīng)典型、神經(jīng)元型、間質(zhì)型、前神經(jīng)元型4個(gè)分子亞型間的表達(dá)模式。③對(duì)選取的樣本根據(jù)IDH基因是否變異、是否進(jìn)行MGMT基因甲基化進(jìn)行分組，結(jié)合上述基因的mRNA水平進(jìn)行收集和整理數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用R編程語言對(duì)Hh信號(hào)通路的關(guān)鍵基因在腦膠質(zhì)瘤組織結(jié)構(gòu)、臨床參數(shù)、基因組數(shù)據(jù)等方面的基因表達(dá)值繪制箱形圖和熱圖，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Mann-Whitney檢驗(yàn)評(píng)估樣本組間的差異，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Dunn′s多重檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較計(jì)算中位數(shù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Hh信號(hào)通路的8個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤不同病理分區(qū)的關(guān)系 BOC、SMO、Gas1在CT的表達(dá)水平最高，在LE的表達(dá)水平最低，且BOC與SMO在幾個(gè)病理分區(qū)間的表達(dá)模式類似，隨著腫瘤組織核心區(qū)由內(nèi)而外的擴(kuò)展表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。CDON在CT-PAN的表達(dá)水平最高，與其他4個(gè)病理分區(qū)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。PTCH1在CT的表達(dá)水平與CT-HBV及CT-PAN比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與LE、IT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HHIP的表達(dá)水平由腫瘤向臨界組織延伸而隨之增高，在 LE表達(dá)水平最高，而SHH、GLI在5個(gè)病理分區(qū)間的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表達(dá)水平接近為零。見圖1。

2.2Hh信號(hào)通路的8個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤不同分子亞型的關(guān)系 BOC與SMO在間質(zhì)型腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)的表達(dá)水平高于其他亞型(P<0.05)，在前神經(jīng)元型腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)表達(dá)水平最低。CDON和PTCH1的表達(dá)模式與BOC和SMO相反，在前神經(jīng)元型腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平最高；GAS1在經(jīng)典型腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)的表達(dá)水平高于前神經(jīng)元型腦膠質(zhì)瘤(P<0.01)。HHIP、SHH、GLI在4個(gè)分子亞型中的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

注：BOC為CDO兄弟同源物，SMO為Smoothened，CDON為cell adhesion associated，oncogene regulated，PTCH1為Patched 1，GAS1為growth arrest specific 1，HHIP為Hedgehog interacting protein，GLI為腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物，SHH為Sonic Hedgehog，CT為腫瘤細(xì)胞區(qū)，CT-HBV為增生性血管區(qū)，CT-PAN為周圍細(xì)胞壞死區(qū)，IT為腫瘤浸潤(rùn)區(qū)，LE為前緣；*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001

注：BOC為CDO兄弟同源物，SMO為Smoothened，CDON為cell adhesion associated，oncogene regulated，PTCH1為Patched 1，GAS1為growth arrest specific 1，HHIP為Hedgehog interacting protein，GLI為腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物，SHH為Sonic Hedgehog；*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001

2.3Hh信號(hào)通路的8個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤IDH基因突變的關(guān)系 IDH基因突變組CDON與PTCH1的表達(dá)水平顯著高于IDH基因野生型組(P<0.05)，SHH、SMO、GLI、BOC、HHIP的表達(dá)水平低于IDH基因野生型組(P<0.05)，兩組間GAS1的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.4Hh信號(hào)通路的8個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤MGMT基因甲基化的關(guān)系 MGMT基因甲基化組的GAS1、BOC、SHH表達(dá)水平高于MGMT基因非甲基化組(P<0.05)；PTCH1、HHIP、GLI表達(dá)水平低于MGMT基因非甲基化組(P<0.05)；兩組間SMO、CDON的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

注：IDH為異檸檬酸脫氫酶，SHH為Sonic Hedgehog，SMO為Smoothened，CDON為cell adhesion associated，oncogene regulated，GLI為腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物，GAS1為growth arrest specific 1，BOC為CDO兄弟同源物，PTCH1為Patched 1，HHIP為Hedgehog interacting protein

注：MGMT為O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，SHH為Sonic Hedgehog，SMO為Smoothened，CDON為cell adhesion associated，oncogene regulated，GLI為腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物，GAS1為growth arrest specific 1，BOC為CDO兄弟同源物，PTCH1為Patched 1，HHIP為Hedgehog interacting protein

3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)，Hh信號(hào)通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6-8]，而Hh信號(hào)通路調(diào)控腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)制尚未明確。本研究通過對(duì)Ivy GAP-艾倫腦科學(xué)研究所綜合數(shù)據(jù)庫的分析，闡述了Hh通路中關(guān)鍵基因表達(dá)的瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性[7]以及這些基因表達(dá)的潛在預(yù)后意義。

按照該數(shù)據(jù)庫對(duì)腦膠質(zhì)瘤組織的病理劃分標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤核心區(qū)較其他病理分區(qū)腫瘤細(xì)胞分布最為密集，因此腫瘤核心區(qū)的基因表達(dá)差異在腫瘤分子層面也最具有代表性。SMO作為Hh通路的效應(yīng)蛋白被證實(shí)其表達(dá)增高與多種腫瘤的惡性增殖相關(guān)[8]。本研究中，BOC、SMO、Gas1在CT的表達(dá)水平最高，在LE的表達(dá)水平最低；且BOC與SMO在幾個(gè)病理分區(qū)間的表達(dá)模式高度相似，即隨著腫瘤組織核心區(qū)由內(nèi)而外的擴(kuò)展表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，提示BOC作為SMO上游的跨膜蛋白可能調(diào)控SMO的表達(dá)。CDON在CT-PAN的表達(dá)水平最高，與其他4個(gè)病理分區(qū)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，可能與胚胎期神經(jīng)管發(fā)育過程中CDON具有促凋亡作用[9]有關(guān)；同時(shí)，CDON也被描述為一種依賴性受體，在SHH缺失的情況下觸發(fā)細(xì)胞凋亡，這種CDON促凋亡活性被認(rèn)為可以抑制腫瘤進(jìn)展。

PTCH1基因作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，其基因突變與基底細(xì)胞痣綜合征、食管鱗狀細(xì)胞癌、毛母細(xì)胞瘤、膀胱移行細(xì)胞癌以及無腦畸形有關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示，PTCH1在CT的表達(dá)水平與CT-HBV及CT-PAN比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與LE、IT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。推測(cè)可能與PTCH1通過選擇性剪接可編碼不同亞型的多個(gè)轉(zhuǎn)錄本有關(guān)。有研究在胃癌與胃上皮肉瘤中進(jìn)行HHIP mRNA定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織內(nèi)HHIP的表達(dá)水平明顯下降[11-12]。本研究中HHIP在不同病理分區(qū)的表達(dá)模式與其他基因相反，其表達(dá)水平由腫瘤核心向臨界組織延伸而隨之增高，在LE表達(dá)水平最高，與上述研究結(jié)果一致。且本研究結(jié)果顯示，SHH、GLI在5個(gè)病理分區(qū)間的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但目前已有研究證實(shí)Hh信號(hào)通路的兩個(gè)主要基因(SHH、GLI)與腦膠質(zhì)瘤的惡性增殖顯著相關(guān)[13-14]，且迄今尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于在腦膠質(zhì)瘤不同病理學(xué)分區(qū)中對(duì)SHH、GLI表達(dá)進(jìn)行分析的報(bào)道，推測(cè)原因可能為該數(shù)據(jù)庫利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)靶向基因進(jìn)行測(cè)序，而針對(duì)SHH、GLI基因進(jìn)行檢測(cè)的探針設(shè)計(jì)存在偏差，但此結(jié)論還有待進(jìn)一步證實(shí)。

本研究中，BOC與SMO在間質(zhì)型腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)的表達(dá)水平高于其他亞型(P<0.05)，與學(xué)者利用TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析的研究結(jié)果[15-16]一致。間質(zhì)型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中NF1等致癌基因過表達(dá)，誘導(dǎo)蛋白激酶B信號(hào)通路異常激活、腫瘤壞死因子超家族及核因子κB信號(hào)通路高表達(dá)，導(dǎo)致此類型腦膠質(zhì)瘤的壞死率較高和腫瘤侵襲性較強(qiáng)，預(yù)后極差[17]。上述結(jié)果提示，BOC與SMO可能在間質(zhì)型腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)存在某些調(diào)控關(guān)系，兩者均可激活Hh通路，進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞惡性增殖和侵襲。本研究結(jié)果顯示，PTCH1、CDON在前神經(jīng)元亞型腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平最高，提示這兩個(gè)基因在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病過程中可能起到類似抑癌基因的作用；HHIP、SHH、GLI在4個(gè)分子亞型中的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，分析其原因?yàn)檫@4種亞型的腦膠質(zhì)瘤并非獨(dú)立存在，同一患者腦膠質(zhì)瘤內(nèi)不同微環(huán)境中可能分布著不同亞型表現(xiàn)的腦膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞或腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，因此腫瘤異質(zhì)性可能會(huì)影響某些基因的表達(dá)模式[18]。

IDH1/2基因參與細(xì)胞代謝，其發(fā)生突變后影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腦膠質(zhì)瘤患者若存在IDH1或IDH2基因突變，則腫瘤內(nèi)部血管的分布密度降低，腫瘤細(xì)胞的增殖速度減慢，侵襲程度降低，患者預(yù)后較好[19-20]，因此明確IDH1/2基因突變與否能夠特異性指導(dǎo)靶向治療。本研究結(jié)果顯示，IDH基因突變組CDON與PTCH1的表達(dá)水平顯著高于IDH基因野生型組(P<0.05)，提示CDON及PTCH1的表達(dá)可能受IDH基因突變體高甲基化調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌基因的功能。IDH1/2基因未突變型腫瘤主要通過升高缺氧誘導(dǎo)因子-1表達(dá)水平，促使線粒體對(duì)氧消耗的需求增加并降低活性氧聚集等途徑來改變腫瘤細(xì)胞的代謝途徑。本研究中，IDH基因突變組SHH、SMO、GLI、BOC、HHIP的表達(dá)水平低于IDH基因野生型組(P<0.05)，原因可能為上述基因通過Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了細(xì)胞能量代謝過程，影響腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后。

MGMT基因表達(dá)增高能對(duì)抗烷化劑藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，啟動(dòng)耐藥機(jī)制[21-22]。其啟動(dòng)子區(qū)CpG島的過度甲基化會(huì)降低基因的表達(dá)，此類型腦膠質(zhì)瘤患者生存期延長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，MGMT基因甲基化組的GAS1、BOC、SHH表達(dá)水平高于MGMT基因非甲基化組(P<0.05)；PTCH1、HHIP、GLI表達(dá)水平低于MGMT基因非甲基化組(P<0.05)；兩組間SMO、CDON的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示上述基因可能獨(dú)立于MGMT基因甲基化通過Hh信號(hào)通路調(diào)控腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，Hh通路上BOC、SMO、CDON等關(guān)鍵基因在腦膠質(zhì)瘤組織中呈現(xiàn)不同程度的表達(dá)差異，參與調(diào)控腦膠質(zhì)瘤的不同發(fā)展過程。近年來，腦膠質(zhì)瘤的分子生物學(xué)分型及腫瘤異質(zhì)性被越來越多的研究者關(guān)注，但腫瘤異質(zhì)性與治療耐藥性導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤對(duì)單一靶點(diǎn)治療的反應(yīng)有限。本研究初步闡述了Hh通路多個(gè)關(guān)鍵基因與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的潛在關(guān)系，可為后期多靶點(diǎn)、多機(jī)制聯(lián)合治療腦膠質(zhì)瘤提供理論基礎(chǔ)。