益生菌與益生元組合的篩選及體外發(fā)酵特性研究

李雅麗,王默涵,趙雯,段素芳,劉偉賢,陳萌,劉義鳳,段盛林*,洪維鍊*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015) 2(功能主食創(chuàng)制與慢病營(yíng)養(yǎng)干預(yù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100015)3(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010110)4(內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010110)

益生菌是對(duì)人體有益的微生物的統(tǒng)稱(chēng),其中占比最大的是乳酸菌。乳酸菌能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸,在自然界中的分布極其廣泛,至今已發(fā)現(xiàn)至少18個(gè)屬,共計(jì)200余種[1]。被人們熟知的乳酸菌主要集中在乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和鏈球菌屬等[2]。除極少數(shù)外,絕大部分乳酸菌都被人體所必需,可定殖于人體腸道,具有抑制有害菌生長(zhǎng)、改善腸道微環(huán)境、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能等多種益生功能[3]。正因其顯著促進(jìn)人體健康的功能特性,聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization,FAO/WHO)將乳酸菌定義為益生菌,廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[4]。在益生產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)中,制品中的乳酸菌必須達(dá)到足夠的活菌數(shù)才能獲得預(yù)期的益生功效,且需要確保其通過(guò)消化道后仍可大量存活[5]。此外,乳酸菌在腸道發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸及其他短鏈脂肪酸可顯著改善腸道微環(huán)境從而達(dá)到保健效果[6]。因此,如何促進(jìn)乳酸菌增殖、產(chǎn)酸及其發(fā)酵特性研究成為食品研發(fā)工作者關(guān)注的重點(diǎn)。

益生元是指不可被人體消化利用但可選擇性促進(jìn)腸道益生菌增殖和代謝的碳水化合物,首次由國(guó)際“益生元之父”格倫·吉布索于1995年提出[7]。益生元對(duì)宿主腸道健康起重要作用,添加一定量的益生元可增強(qiáng)乳酸菌功能[8]。目前被廣泛認(rèn)可的益生元有低聚果糖和低聚半乳糖,其他益生元的研究雖然相對(duì)較少,但它們都具有人體不能分解但可被乳酸菌利用的特殊糖苷鍵。BOGER等[9]的研究表明,當(dāng)以低聚果糖為唯一碳源時(shí),唾液乳桿菌W57的生長(zhǎng)情況較差,但低聚果糖可顯著促進(jìn)副干酪乳桿菌W20的生長(zhǎng)增殖?？梢?jiàn),不同乳酸菌對(duì)特定益生元的嗜好性存在較大差異。

基于以上特性,益生菌與益生元結(jié)合使用的生物制劑或微生態(tài)制劑又被稱(chēng)為合生元[10]。合生元以協(xié)同增效的形式相結(jié)合,益生元為益生菌提供營(yíng)養(yǎng),選擇性刺激其生長(zhǎng)、激活代謝,賦予益生菌在腸道中的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),從而有益地影響宿主[11]。研究結(jié)果顯示,補(bǔ)充合生元能夠提高益生菌通過(guò)消化道時(shí)的存活率,使之更有效地定殖于結(jié)腸[12]。因此,合生元常被用做膳食補(bǔ)充劑添加于各類(lèi)食品中,用于維持腸道穩(wěn)態(tài)和人體微生態(tài)健康。

由于益生菌對(duì)益生元嗜好性的不同,為探究合生元的最佳組合,本研究選擇乳雙歧桿菌BL-99、嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496、副干酪乳桿菌K56、副干酪乳桿菌ET-22等4種益生菌,及低聚半乳糖、低聚果糖、棉子糖、低聚木糖、低聚甘露糖、水蘇糖、低聚異麥芽糖、異構(gòu)化乳糖、乳糖、抗性糊精、聚葡萄糖、塔格糖等12種益生元,通過(guò)微生物菌落自動(dòng)化工作站高通量篩選生長(zhǎng)速率較為典型的組合。4株實(shí)驗(yàn)菌株均已在先前研究中進(jìn)行菌種水平鑒定研究[13-14],為對(duì)照其益生作用,本研究引入市售經(jīng)典益生菌菌株乳雙歧桿菌BB-12和鼠李糖乳桿菌LGG作為對(duì)比。分析各典型組合中益生元對(duì)益生菌的促增殖和促產(chǎn)酸能力,通過(guò)測(cè)定益生元的降解率及發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物乙酸、乳酸的濃度分析各組合體外發(fā)酵特性,以期為合生元產(chǎn)品配伍及食品開(kāi)發(fā)奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 益生菌及益生元

研究所用益生菌及益生元樣品信息如表1所示。

表1 益生菌及益生元樣品信息Table 1 Sample information of probiotics and prebiotics

1.1.2 試劑

NaCl、甲酸、正丁醇、3,5-二羥基甲苯、乙醇、濃硫酸,均為分析純,天津永大化學(xué)試劑有限公司;蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、吐溫80、K2HPO4·7H2O、CH3COONa·3H2O、檸檬酸三銨、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、瓊脂粉,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙酸、乳酸、丙酸、異丁酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品,均為色譜純,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682—2016《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》一級(jí)水指標(biāo)。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20型pH計(jì)、AL204型電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;Blue Pard隔水式培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DL-CJ-2 ND I型潔凈工作臺(tái),北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;Spectra Max i3酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;2010 Plus氣相色譜儀,島津儀器有限公司;Rotor HDA微生物菌落自動(dòng)化工作站,英國(guó)Singer公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基。參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》配制。

活化培養(yǎng)基：改良的MRS液體培養(yǎng)基。將原MRS培養(yǎng)基的緩沖劑乙酸鈉用2.0 g/L Na2HPO4·12H2O代替,避免發(fā)酵過(guò)程中由于緩沖體系產(chǎn)生乙酸而影響發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析。同時(shí)加入0.5 g/LL-半胱氨酸鹽酸鹽作為還原劑保證菌落生長(zhǎng)的厭氧環(huán)境。

增殖固體培養(yǎng)基：向不含葡萄糖的活化培養(yǎng)基中加入瓊脂至15 g/L,121 ℃高壓滅菌15 min;配制0.4 g/mL的益生元母液(益生元濃度均按照有效純度計(jì)算),無(wú)菌操作下過(guò)0.22 μm濾膜后分別加入滅菌培養(yǎng)基中至5 mg/mL;倒入Singer Rotor HAD高通量篩選設(shè)備中待用。

發(fā)酵液體培養(yǎng)基：不含葡萄糖的活化培養(yǎng)基121 ℃高壓滅菌15 min后,分裝于15 mL離心管中,按照增殖固體培養(yǎng)基的相同方法配制以各益生元為單一碳源的液體培養(yǎng)基。

1.3.2 菌種活化

將冷凍保藏的0.1 g益生菌凍干粉接入活化培養(yǎng)基中,充分振蕩使菌體混合均勻,厭氧條件下37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。所得菌液按體積分?jǐn)?shù)10%接入新的活化培養(yǎng)基,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,得到菌種母液。

1.3.3 不同培養(yǎng)基中益生菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的高通量測(cè)定

將108CFU/mL活化后的菌液接入96孔母板,微生物菌落自動(dòng)化工作站將母板樣品對(duì)應(yīng)接種至增殖固體培養(yǎng)基,而后置于37 ℃中厭氧培養(yǎng),每隔一定時(shí)間拍照分析菌落尺寸,各菌落尺寸隨時(shí)間變化的曲線(xiàn)即為該菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn),生長(zhǎng)曲線(xiàn)的斜率為該菌的生長(zhǎng)速率。

1.3.4 益生元對(duì)益生菌促增殖及促產(chǎn)酸能力的測(cè)定

將活化后的菌液按體積分?jǐn)?shù)1%接入發(fā)酵液體培養(yǎng)基中,厭氧條件下37 ℃連續(xù)培養(yǎng)48 h,分別于第0、6、20、30、48 h測(cè)定OD600值和pH值,并以不含碳源的發(fā)酵液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照,以未接種菌液的發(fā)酵液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照,以葡萄糖為唯一碳源的發(fā)酵液體培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照,分析發(fā)酵過(guò)程中益生元對(duì)益生菌促增殖和促產(chǎn)酸能力的影響。

1.3.5 益生元降解率的測(cè)定

參照GB 4789.34—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn)》附錄B糖降解率檢測(cè)：薄層色譜法中的方法進(jìn)行。以甲酸∶正丁醇∶水=6∶4∶1(體積比)為展開(kāi)劑,準(zhǔn)確稱(chēng)取900 mg 3,5-二羥基甲苯溶于25 mL水中,加入375 mL無(wú)水乙醇,冰浴中緩慢加入50 mL濃硫酸,作為顯色劑,點(diǎn)樣0.2 μL進(jìn)行薄層層析。用TLC軟件對(duì)層析圖進(jìn)行處理,生成Excel文件。益生元的降解率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A0, 0 h的灰度平均值；A48,48 h的灰度平均值。

1.3.6 代謝產(chǎn)物的測(cè)定

分別測(cè)定各組合0、6、12、24、30 h發(fā)酵液中乙酸和乳酸濃度。準(zhǔn)確吸取2 mL發(fā)酵液于2 mL 的0.25 g/mL磷酸溶液中,振蕩混勻,靜置半小時(shí)后通過(guò)0.22 μm濾器注入進(jìn)樣瓶,通過(guò)氣相色譜分析乙酸和乳酸產(chǎn)量。分別配制質(zhì)量濃度為1、100、200、300、400、500 μg/mL的乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)量濃度為1、10、20、30、40 mg/mL的乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。氣相色譜載氣(氮?dú)?流速1.0 mL/min,進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為240 ℃,進(jìn)樣量1 μL,起始柱溫90 ℃,保留0.5 min后10 ℃/min升溫至110 ℃保留2 min,6 ℃/min升溫至130 ℃保留0 min,10 ℃/min升溫至200 ℃保留5 min,15 ℃/min升溫至230 ℃保留2 min,方法共計(jì)23.83 min。得到乙酸和乳酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別為：y=33 794x-1 590.5(R2=1)和y=20 853x+267.46(R2=1)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究的所有組合均設(shè)計(jì)了2個(gè)生物學(xué)重復(fù)并進(jìn)行平行測(cè)定。數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan法多重比較,以P<0.05表示差異顯著。圖片均采用Excel 2016 軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌與益生元組合的體外篩選

2.1.1 不同培養(yǎng)基中益生菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的高通量測(cè)定

微生物菌落自動(dòng)化工作站各培養(yǎng)基中益生菌生長(zhǎng)速率如表2所示。使乳雙歧桿菌BL-99生長(zhǎng)速率較快的益生元有低聚果糖、水蘇糖、低聚異麥芽糖、乳糖;使嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496生長(zhǎng)速率較快的益生元有乳糖;使乳雙歧桿菌BB-12生長(zhǎng)速率較快的益生元有低聚異麥芽糖;使副干酪乳桿菌K56生長(zhǎng)速率較快的益生元有棉子糖、低聚甘露糖、水蘇糖、異構(gòu)化乳糖、乳糖;使副干酪乳桿菌ET-22生長(zhǎng)速率較快的益生元有水蘇糖;使鼠李糖乳桿菌LGG生長(zhǎng)速率較快的益生元有低聚甘露糖、水蘇糖。綜合來(lái)說(shuō),本研究中的4株實(shí)驗(yàn)菌種與益生元組合后,與商業(yè)益生菌相比,最大生長(zhǎng)速率均高于乳雙歧桿菌BB-12,而與鼠李糖乳桿菌LGG相比,僅乳雙歧桿菌BL-99與乳糖或水蘇糖組合的生長(zhǎng)速率可與之相當(dāng),其余3株菌的生長(zhǎng)速率均低于鼠李糖乳桿菌LGG。

益生元促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)增殖的機(jī)理是菌體可通過(guò)分泌相關(guān)酶將益生元分解為基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),以促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖與代謝[15]。由于每種益生菌含有的基因不同導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)生的酶系不同,因而對(duì)不同益生元的嗜好性差異較大,即體現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)速率。即使是同種菌株(如本研究中的乳雙歧桿菌BL-99和嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496、副干酪乳桿菌K56和副干酪乳桿菌ET-22)基因數(shù)量、分泌酶活性和利用方式也可能不同而反映出對(duì)同一益生元的利用效率不同[16]。同屬雙歧桿菌的3株益生菌均在以聚葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中均無(wú)法生長(zhǎng),在以塔格糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率也很低,而副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌則可以生長(zhǎng),表明不同屬的益生菌代謝途徑和分泌酶系不同。而同屬雙歧桿菌的乳雙歧桿菌BL-99和嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496生長(zhǎng)趨勢(shì)類(lèi)似,但生長(zhǎng)速率仍存在差異,體現(xiàn)出益生菌對(duì)益生元嗜好性篩選的必要性。

高通量篩選、計(jì)算生長(zhǎng)速率作為一種便捷篩選和精簡(jiǎn)測(cè)試組數(shù)的手段,基于以上結(jié)果和市場(chǎng)上常見(jiàn)復(fù)配組合,進(jìn)一步選擇乳雙歧桿菌BL-99與低聚果糖、低聚木糖、乳糖、水蘇糖的組合,嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496與低聚半乳糖、異構(gòu)化乳糖、乳糖、水蘇糖的組合,副干酪乳桿菌K56與低聚甘露糖、低聚半乳糖、低聚木糖、水蘇糖的組合,副干酪乳桿菌ET-22與低聚甘露糖、低聚半乳糖、低聚木糖、水蘇糖的組合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同益生元對(duì)益生菌生長(zhǎng)速率的影響 單位：h-1

2.1.2 益生元對(duì)益生菌促增殖能力分析

益生元對(duì)益生菌的促增殖能力通常以發(fā)酵液的OD600值作為指標(biāo)以評(píng)價(jià)菌體數(shù)量,結(jié)果如圖1所示。相較于陰性對(duì)照,4種益生元均對(duì)益生菌有顯著促增殖作用,且4種益生元作用效果有顯著差異。對(duì)乳雙歧桿菌BL-99促增殖效果較好的益生元是低聚果糖與乳糖;對(duì)嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496促增殖效果較好的益生元是低聚半乳糖與乳糖,而異構(gòu)化乳糖起效速度略慢;對(duì)副干酪乳桿菌K56促增殖效果較好的益生元是低聚半乳糖;對(duì)副干酪乳桿菌ET-22促增殖效果較好的益生元是水蘇糖與低聚半乳糖。

與本研究結(jié)果類(lèi)似,PéREZ-CONESA等[17]研究也發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖和低聚果糖能促進(jìn)多種雙歧桿菌的生長(zhǎng),這可能與雙歧桿菌屬可產(chǎn)生β-呋喃果糖苷酶和β-半乳糖苷酶且活性較高有關(guān)。低聚半乳糖也可極大地促進(jìn)本研究中2種副干酪乳桿菌的增殖,表明它們也可產(chǎn)生高活性的半乳糖苷酶,而副干酪乳桿菌ET-22可能因?yàn)楦弋a(chǎn)α-半乳糖苷酶而可以高效利用水蘇糖[16]。

2.1.3 益生元對(duì)益生菌促產(chǎn)酸能力分析

益生菌在代謝益生元快速生長(zhǎng)的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生短鏈脂肪酸,能有效降低培養(yǎng)環(huán)境的pH值[18]。在人體中,適宜的腸道微環(huán)境pH值有助于維持益生菌的黏附能力,直接促進(jìn)它的定殖和生長(zhǎng),腸道微環(huán)境pH值的降低也可通過(guò)抑制有害菌的生長(zhǎng)增殖而間接促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖[19]。

如圖2所示,相較于陰性對(duì)照,4種益生元均對(duì)益生菌有顯著促產(chǎn)酸作用,且4種益生元作用效果有顯著差異。4種益生元對(duì)實(shí)驗(yàn)菌種的促產(chǎn)酸規(guī)律與促增殖規(guī)律基本一致,即對(duì)乳雙歧桿菌BL-99促產(chǎn)酸效果較好的益生元是低聚果糖與乳糖;對(duì)嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496促產(chǎn)酸效果較好的益生元是低聚半乳糖與乳糖,異構(gòu)化乳糖起效速度略慢;對(duì)副干酪乳桿菌K56促產(chǎn)酸效果較好的益生元是低聚半乳糖;對(duì)副干酪乳桿菌ET-22促產(chǎn)酸效果較好的益生元是水蘇糖,低聚半乳糖、低聚甘露糖與低聚木糖促產(chǎn)酸效果差異不顯著。由促生長(zhǎng)效果數(shù)據(jù)分析,低聚甘露糖對(duì)副干酪乳桿菌ET-22的促生長(zhǎng)效果好于低聚木糖,但促產(chǎn)酸效果差異不顯著,說(shuō)明低聚甘露糖促進(jìn)菌落生長(zhǎng)的同時(shí)主要產(chǎn)生的可能是酸類(lèi)物質(zhì)以外的代謝產(chǎn)物。

a-雙歧桿菌BL-99;b-嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496;c-副干酪乳桿菌K56;d-副干酪乳桿菌ET-22圖1 不同益生元對(duì)益生菌OD600值的影響Fig.1 Effect of different prebiotics on the OD600 nm of probiotics

a-雙歧桿菌BL-99;b-嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496;c-副干酪乳桿菌K56;d-副干酪乳桿菌ET-22圖2 不同益生元對(duì)益生菌pH值的影響Fig.2 Effect of different prebiotics on the pH value of probiotics

2.2 不同合生元組合的體外發(fā)酵特性研究

2.2.1 不同益生菌對(duì)益生元的降解率

采用薄層色譜法分析不同益生菌對(duì)益生元的降解率。研究中使用的益生元均為單糖或多糖類(lèi)物質(zhì),可與3,5-二羥基甲苯結(jié)合顯色,而有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物無(wú)法與該顯色劑結(jié)合。以0 h未發(fā)酵的原培養(yǎng)液為陰性對(duì)照,發(fā)酵48 h的培養(yǎng)液與陰性對(duì)照相比若灰度降低則表明糖原被降解。幾種特征組合中益生元降解率的薄層色譜圖如圖3所示。低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚木糖是多種聚合度的混合物,在薄層色譜上會(huì)顯示多個(gè)點(diǎn)位,與兩側(cè)的陰性對(duì)照相比,各組合中的益生元被不同程度降解,且不同益生元作用有顯著差異。

圖3 四株益生菌對(duì)不同益生元的代謝降解率(薄層色譜圖)Fig.3 Metabolic degradation rate of different prebiotics by four strains of probiotics(thin layer chromatogram)注：C表示0 h未發(fā)酵的原培養(yǎng)液,即陰性對(duì)照;中間為發(fā)酵48 h的培養(yǎng)液;每個(gè)菌株點(diǎn)2個(gè)重復(fù)樣品,每個(gè)樣品點(diǎn)2次平行

掃描后的圖片經(jīng)TLC軟件處理可以得到各列灰度的平均值,按照1.3.5中的方法來(lái)量化益生元的降解率,結(jié)果如表3所示。乳雙歧桿菌BL-99和嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496對(duì)乳糖的降解率最高,對(duì)水蘇糖的降解率最低,副干酪乳桿菌K56對(duì)益生元的降解率從高到低依次為低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚木糖、水蘇糖,而副干酪乳桿菌ET-22對(duì)益生元的降解率從高到低依次為低聚甘露糖、低聚半乳糖、水蘇糖、低聚木糖,表現(xiàn)出不同副干酪乳桿菌菌株對(duì)相同益生元的代謝速率不同。

表3 不同益生菌對(duì)益生元的降解率 單位：%

2.2.2 發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析

表4列出了部分實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)應(yīng)的嗜好益生元發(fā)酵體系,經(jīng)過(guò)48 h發(fā)酵,發(fā)酵液中乙酸及乳酸的最大產(chǎn)生量。由表4可知,不同的益生元對(duì)菌株的促產(chǎn)乙酸及乳酸效果顯著不同。如乳糖對(duì)于雙歧桿菌BL-99產(chǎn)生乳酸效果非常顯著,但低聚木糖對(duì)于雙歧桿菌BL-99產(chǎn)生乙酸效果更好。低聚半乳糖對(duì)于副干酪乳桿菌K56、副干酪乳桿菌ET-22產(chǎn)生乳酸效果非常顯著,但水蘇糖、低聚木糖對(duì)于2種菌產(chǎn)乙酸效果更好。綜合乙酸和乳酸的最大產(chǎn)生量,得到乳雙歧桿菌BL-99與乳糖組合的生長(zhǎng)效果較好,而嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496、副干酪乳桿菌K56、副干酪乳桿菌ET-22則與低聚半乳糖組合的生長(zhǎng)效果較好,乳雙歧桿菌BL-99和副干酪乳桿菌K56的結(jié)果與益生元降解率的結(jié)果相同,而副干酪乳桿菌ET-22與低聚甘露糖雖然有最大降解率,但乙酸和乳酸的產(chǎn)生量不及低聚半乳糖,這與促增殖、促產(chǎn)酸的結(jié)果相似,印證了副干酪乳桿菌ET-22與低聚甘露糖組合可能產(chǎn)生更多的是乙酸及乳酸以外的物質(zhì)。

表4 益生元對(duì)益生菌發(fā)酵體系中乙酸及乳酸最大產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of prebiotics on the maximum yield of acetic acid and lactic acid in the fermentation system of probiotics

3 結(jié)論

本研究通過(guò)微生物菌落自動(dòng)化工作站高通量篩選、促增殖及促產(chǎn)酸能力分析、益生元降解率分析、發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析等方法,研究了雙歧桿菌BL-99、嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496、副干酪乳桿菌K56、副干酪乳桿菌ET-22共4株益生菌與12種益生元的體外發(fā)酵特性,得到了差異顯著的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。考慮到體外生長(zhǎng)速率、促產(chǎn)酸及促增殖能力評(píng)價(jià)對(duì)益生菌、益生元組合的體外篩選具有一定局限性,故以發(fā)酵代謝產(chǎn)物及益生元降解率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo),得到乳雙歧桿菌BL-99與乳糖組合的效果較好,嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496、副干酪乳桿菌K56、副干酪乳桿菌ET-22與低聚半乳糖組合的效果較好,且與商業(yè)菌株乳雙歧桿菌BB-12和鼠李糖乳桿菌LGG相比,本研究中的益生菌具有相當(dāng)甚至更高的生長(zhǎng)速率,可為本實(shí)驗(yàn)中菌株的后續(xù)研究與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。