腐皮鐮孢菌對角膜上皮細(xì)胞AMPK磷酸化及IL-6表達(dá)的影響

魏靜靜 謝艷亭 岳娟 董軍璐 司瑋 王春梅 張紅敏 王麗婭

鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院眼科 河南省立眼科醫(yī)院 河南省眼科研究所 河南省眼科與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450003

腺嘌呤核糖核苷酸活化的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)是一種由α、β和γ亞基組成的異源三聚體蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)葡萄糖、脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)的代謝和維持能量穩(wěn)態(tài)，被稱為細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AMPK信號通路除在能量代謝調(diào)節(jié)方面起關(guān)鍵作用外，在感染和宿主防御方面也起到重要作用[3-4]。真菌性角膜炎是由致病真菌引起的嚴(yán)重感染性、致盲眼病，臨床抗真菌類滴眼制劑種類有限，治療棘手[5-6]。位于角膜組織最外層的上皮細(xì)胞是角膜防御致病微生物侵襲的第一道屏障，是防御真菌感染的關(guān)鍵，目前角膜上皮細(xì)胞是否存在AMPK磷酸化尚不清楚。在真菌性角膜炎炎癥初期及進(jìn)展期，大量多形核中性粒細(xì)胞浸潤[7]，白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)是一種由184個氨基酸組成的單鏈糖蛋白[8]，其能促進(jìn)多形核中性粒細(xì)胞的激活[9]。IL-6以自分泌-旁分泌的方式起作用，誘導(dǎo)駐留的角膜細(xì)胞產(chǎn)生巨噬細(xì)胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)-2和MIP-1α[10]，MIP能促進(jìn)角膜局部炎癥免疫細(xì)胞聚集，從而發(fā)揮殺菌作用。本實(shí)驗(yàn)擬研究角膜上皮細(xì)胞是否存在AMPK磷酸化以及真菌對角膜上皮細(xì)胞AMPK磷酸化及IL-6表達(dá)的影響，探討AMPK磷酸化和IL-6在真菌性角膜炎中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞和菌株來源 人永生化角膜上皮細(xì)胞系CRL-11135 HCE-2(50.B1)(美國ATCC公司)。腐皮鐮孢菌(編號：3.5840)(中國科學(xué)院微生物研究所)。

1.1.2主要試劑及儀器 上樣緩沖液SDS-PAGE(CW0028A，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；PAGE凝膠快速制備試劑盒(PG113，上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司)；預(yù)染蛋白marker(#26616，美國Thermo公司)；發(fā)光底物HRP(ECL發(fā)光液)(WBKLS0100)、PVDF膜(IPVH00010)(美國Millipore公司)；磷酸酶抑制劑Cocktail Ⅱ(HY-K0022)、蛋白酶抑制劑(HY-K0011)、AMPK磷酸化激動劑5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside，AICAR)(HY13417)、AMPK磷酸化抑制劑化合物C(HY-13418)(美國MCE公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(PC0020)、RIPA裂解液(#R0010)(北京索萊寶科技有限公司)；IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑(E-EL-H0102c)、β-actin(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；磷酸化AMPK(p-AMPK)α1(Thr172)(40H9)兔單克隆抗體(#2535S)、AMPKα(D5A2)兔單克隆抗體(#5831S)(美國CST公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔(111-035-003，美國Jackson公司)。實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞多功能分析儀(xCELLigence RTCA S16，杭州艾森生物有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer公司)；蛋白電泳儀、化學(xué)發(fā)光儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞多功能分析儀篩選AICAR和化合物C安全濃度 復(fù)蘇人永生化角膜上皮細(xì)胞，待生長狀態(tài)良好后給予傳代，在E-Plate 16孔板中加入50 μl培養(yǎng)基，置于RTCA Station完成基線測定，并確定所選擇的孔接觸正常，向每孔加入含2.0×104個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞充分貼壁，待培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，向每孔中分別加入濃度梯度為100、300、500和1 000 μmol/L的AICAR以及濃度梯度為10.0、12.5、15.0、17.5和20.0 μmol/L的化合物C，以未處理細(xì)胞作為對照，加藥結(jié)束后設(shè)置對應(yīng)孔的藥物名稱和藥物濃度及相關(guān)參數(shù)，將實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞多功能分析儀放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、95%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至平臺期，觀察角膜上皮細(xì)胞生長指數(shù)，確定藥物對角膜上皮細(xì)胞作用的安全濃度范圍。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取平均值。

1.2.2細(xì)胞分組及處理 將角膜上皮細(xì)胞分為正常對照組、孢子對照組、AICAR組和化合物C組，以單純角膜上皮細(xì)胞作為正常對照組，角膜上皮細(xì)胞與孢子共培養(yǎng)作為孢子對照組，在孢子對照組基礎(chǔ)上分別加入AICAR和化合物C作為AICAR組和化合物C組。以每孔5.0×106個細(xì)胞鋪板，按孢子與角膜上皮細(xì)胞數(shù)量比為1∶ 1的比例，將孢子加入到含細(xì)胞的孔板中混勻，每組均設(shè)3個復(fù)孔，按照對應(yīng)的分組加入AICAR和化合物C，根據(jù)AICAR、化合物C對角膜上皮細(xì)胞作用的安全濃度范圍，選取AICAR和化合物C的終濃度分別為1 000 μmol/L和10.0 μmol/L，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，備用。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，角膜上皮細(xì)胞與孢子共培養(yǎng)4 h時角膜上皮細(xì)胞AMPK磷酸化的刺激作用最強(qiáng)，故本實(shí)驗(yàn)中選擇4 h為培養(yǎng)時間。

1.2.3Western blot法檢測p-AMPK和AMPK蛋白在角膜上皮細(xì)胞中的表達(dá) 培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，用RIPA裂解液(預(yù)先加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)冰上裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按照說明配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5% SDS-PADG凝膠，110 V恒壓電泳1 h，濕轉(zhuǎn)法120 V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h至PVDF膜。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉1 h，去除封閉液，分別浸入p-AMPKα1(Thr172)兔單克隆抗體(1∶ 200)和AMPKα兔單克隆抗體(1∶ 1 000)中，4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后用含Tween 20的磷酸鹽緩沖液洗膜3次；浸入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶ 1 000)室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL液用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行顯影，以β-actin為內(nèi)參。采用ImageJ分析軟件測定條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取平均值。

1.2.4ELISA法測定角膜上皮細(xì)胞上清液中IL-6質(zhì)量濃度 各組培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行如下操作：將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋后依次加入到酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100 μl，均設(shè)3個復(fù)孔；于其他孔中加入100 μl待測樣品細(xì)胞上清原液，給予酶標(biāo)板覆膜，37 ℃孵育90 min。倒去孔內(nèi)液體，加入100 μl生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min。向每孔加入350 μl洗滌液，洗滌3次。加入100 μl酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育30 min。進(jìn)行5次洗滌，加入90 μl底物溶液，37 ℃孵育15 min，加入50 μl終止液，立即用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的吸光度(A)值，用A540值進(jìn)行校正，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式后代入數(shù)據(jù)計(jì)算IL-6的質(zhì)量濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AMPK激動劑AICAR對角膜上皮細(xì)胞作用的安全濃度范圍

不同濃度AICAR作用于角膜上皮細(xì)胞不同時間后，細(xì)胞指數(shù)總體比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表1)，表明AICAR安全范圍較廣，在100～1 000 μmol/L均無角膜上皮細(xì)胞毒性作用。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1 000 μmol/L的AICAR對角膜上皮細(xì)胞AMPK磷酸化的刺激作用最強(qiáng)，因此，選擇1 000 μmol/L作為AICAR后續(xù)實(shí)驗(yàn)的終濃度。

表1 不同濃度AICAR作用于角膜上皮細(xì)胞不同時間后細(xì)胞指數(shù)比較(x±s)Table 1 Comparison of cell index of AICAR-treated corneal epithelial cells at various time points among different concentrations of AICAR (x±s)AICAR濃度(μmol/L)樣本量細(xì)胞指數(shù)12 h24 h36 h48 h60 h72 h041.02±0.142.67±0.053.95±0.174.84±0.024.76±0.224.90±0.1610040.99±0.132.51±0.163.70±0.174.37±0.264.47±0.434.58±0.5030041.05±0.112.51±0.183.66±0.634.34±0.624.42±0.794.55±0.6250040.96±0.142.58±0.034.02±0.464.79±0.344.83±0.664.89±0.641 00040.96±0.192.44±0.153.92±0.254.85±0.314.89±0.454.98±0.55F值0.2031.2830.5311.4960.4720.438P值0.9310.3400.7160.2750.7560.779 注:(單因素方差分析) AICAR:5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸 Note:(One-way ANOVA) AICAR:5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside

2.2 AMPK抑制劑化合物C對角膜上皮細(xì)胞作用的安全濃度范圍

不同濃度化合物C作用于角膜上皮細(xì)胞后24、36、48、60和72 h，細(xì)胞指數(shù)總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.106、61.937、125.858、378.399、229.704，均P<0.001)，其中17.5 μmol/L和20.0 μmol/L化合物C作用后24 h細(xì)胞指數(shù)均低于對照組，15.0、17.5和20.0 μmol/L化合物C作用后36、48、60和72 h細(xì)胞指數(shù)均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表2)，表明10.0～12.5 μmol/L化合物C對角膜上皮細(xì)胞無毒性作用。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10.0 μmol/L化合物C對角膜上皮細(xì)胞AMPK磷酸化表達(dá)即有較好的抑制作用，因此，選擇10.0 μmol/L作為化合物C后續(xù)實(shí)驗(yàn)的終濃度。

表2 不同濃度化合物C作用于角膜上皮細(xì)胞不同時間后細(xì)胞指數(shù)比較(x±s)Table 2 Comparison of cell index of Compound C-treated corneal epithelial cells at various time points among different concentrations of Compound C (x±s)化合物C濃度(μmol/L)樣本量細(xì)胞指數(shù)12 h24 h#36 h*48 h*60 h#72 h*041.00±0.122.66±0.053.69±0.554.88±0.074.83±0.174.92±0.1510.041.21±0.462.71±0.194.08±0.344.81±0.224.94±0.395.02±0.2912.541.19±0.302.39±0.363.88±0.464.77±0.275.40±0.055.46±0.0415.041.41±1.031.77±0.861.76±0.55a1.77±0.58a1.29±0.34a1.04±0.43a17.540.48±0.110.42±0.12a0.18±0.11a0.29±0.28a0.10±0.01a0.07±0.00a20.040.39±0.230.22±0.13a0.25±0.14a0.38±0.44a0.12±0.08a0.37±0.47aF值2.17824.10661.937125.858378.399229.704P值0.125<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與各自對照組(0 μmol/L)比較,aP<0.01(單因素方差分析,#:Tamhane T2檢驗(yàn);*:LSD-t檢驗(yàn)) Note:Compared with the respective control group (0 μmol/L),aP<0.01 (One-way ANOVA,#:Tamhane T2 test;*:LSD-t test)

2.3 真菌孢子對角膜上皮細(xì)胞AMPK磷酸化的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，孢子對照組和AICAR組p-AMPK蛋白表達(dá)條帶增強(qiáng)，化合物C組p-AMPK蛋白表達(dá)條帶減弱；各組AMPK蛋白表達(dá)條帶無明顯變化(圖1A)。正常對照組、孢子對照組、AICAR組和化合物C組p-AMPK相對表達(dá)量分別為0.67±0.15、2.57±0.12、3.67±0.58和1.50±0.50，各組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.820，P<0.001)，其中孢子對照組p-AMPK相對表達(dá)量較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；AICAR組較孢子對照組p-AMPK相對表達(dá)量明顯升高，化合物C組較孢子對照組p-AMPK相對表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.010)(圖1B)。正常對照組、孢子對照組、AICAR組和化合物C組AMPK相對表達(dá)量分別為1.09±0.74、1.47±0.78、1.45±0.96和1.29±1.04，各組總體比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.120，P=0.950)(圖1C)。

圖1 真菌孢子誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞p-AMPK和AMPK蛋白表達(dá) A：Western blot法檢測電泳圖 B：各組角膜上皮細(xì)胞中p-AMPK蛋白定量結(jié)果比較 F=32.820，P<0.001.與正常對照組比較，aP<0.01；與孢子對照組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=4) C：各組角膜上皮細(xì)胞中AMPK蛋白定量結(jié)果比較 F=0.120，P=0.950(單因素方差分析，n=4) 1：正常對照組；2：孢子對照組；3：AICAR組；4：化合物C組 p-AMPK：磷酸化腺苷酸激活蛋白激酶；AMPK：腺嘌呤核糖核苷酸活化的蛋白激酶；β-actin：β-肌動蛋白 圖2 各組角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6質(zhì)量濃度比較 F=15.210，P<0.001.與正常對照組比較，aP<0.01；與孢子對照組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=4) 1：正常對照組；2：孢子對照組；3：AICAR組；4：化合物C組 IL：白細(xì)胞介素Figure 1 Expression of p-AMPK and AMPK proteins in corneal epithelial cells induced by fungal spores A：Electrophoretogram of p-AMPK and AMPK proteins by Western blot B：Comparison of quantitative results of p-AMPK protein in corneal epithelial cells among different groups F=32.820,P<0.001 Compared with the normal control group,aP<0.01;compared with the spore control group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=4) C：Comparison of quantitative results of AMPK protein in corneal epithelial cells among different groups F=0.120,P=0.950 (One-way ANOVA,n=4) 1：Normal control group;2：Spore control group;3：AICAR group;4：Compound C group p-AMPK：phosphorylated adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase;AMPK：adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase Figure 2 Comparison of IL-6 concentration in culture supernatant among different groups F=15.210,P<0.001 Compared with the normal control group,aP<0.01;compared with the spore control group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=4) 1：Normal control group;2：Spore control group;3：AICAR group;4：Compound C group IL：interleukin

2.4 真菌孢子對角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6表達(dá)的影響

ELISA法測定結(jié)果顯示，正常對照組、孢子對照組、AICAR組和化合物C組IL-6質(zhì)量濃度分別為(107.81±17.15)、(156.32±9.94)、(167.96±14.16)和(127.42±19.75)pg/ml，各組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.210，P<0.001)，其中孢子對照組IL-6質(zhì)量濃度較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；AICAR組IL-6質(zhì)量濃度較孢子對照組略升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.260)，化合物C組IL-6質(zhì)量濃度較孢子對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010)(圖2)。

3 討論

角膜上皮細(xì)胞是上皮類細(xì)胞的一種，AMPK磷酸化在上皮類細(xì)胞中廣泛表達(dá)，如肺泡上皮A549細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和唾液腺上皮細(xì)胞等[11-13]。本研究結(jié)果顯示，角膜上皮細(xì)胞中存在AMPK磷酸化，在真菌誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞中AMPK磷酸化水平升高，且AICAR可以增強(qiáng)這一效應(yīng)，化合物C則抑制這一效應(yīng)。宿主對隱球菌(一種致命的真菌病原體)感染的反應(yīng)進(jìn)行全面的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，真菌被巨噬細(xì)胞攝取后，大量不同的宿主蛋白被差異磷酸化，包括AMPKα[14]，與本研究結(jié)果相似，提示AMPK磷酸化參與真菌性角膜炎的致病過程。不僅如此，AMPK磷酸化在細(xì)菌、病毒和寄生蟲等感染性疾病中亦有重要意義[15-17]。目前，關(guān)于AMPK磷酸化在真菌誘導(dǎo)感染性疾病中的研究仍較少，未來可深入研究AMPK磷酸化在真菌感染中的作用機(jī)制，尋找致病靶點(diǎn)，為開發(fā)更多的抗真菌藥物提供基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6的質(zhì)量濃度升高，與既往研究結(jié)果相似。滅活的茄病鐮刀菌孢子在體外能上調(diào)人角膜上皮細(xì)胞中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2 mRNA及蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)下游炎性因子IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α蛋白的表達(dá)[18]；巴西假單胞菌以蛋白激酶C依賴性方式促進(jìn)人肺上皮A549細(xì)胞分泌IL-6和IL-8[19]；該結(jié)果在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中亦得到證實(shí)。IL-6在煙曲霉菌性角膜炎大鼠角膜中早期大量表達(dá)，中晚期達(dá)高峰[20]，黑曲霉刺激增加慢性鼻-鼻竇炎鼻息肉組織中促炎細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)[21]。真菌性角膜炎的免疫反應(yīng)過程中，病變早期主要是中性粒細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]，IL-6則能促進(jìn)小鼠角膜上皮損傷的快速修復(fù)，同時伴有角膜中的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)增多[23]。因此，IL-6表達(dá)的增加在真菌性角膜感染中是一種保護(hù)因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，真菌刺激角膜上皮細(xì)胞后，p-AMPK表達(dá)水平和分泌的IL-6質(zhì)量濃度均升高；在孢子刺激的基礎(chǔ)上加入AICAR，p-AMPK表達(dá)水平和IL-6質(zhì)量濃度也升高，但與孢子對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，猜測可能是孢子刺激引起角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-6質(zhì)量濃度已達(dá)到高峰，接近飽和狀態(tài)，故加入AICAR后IL-6的質(zhì)量濃度升高幅度不明顯；在孢子刺激的基礎(chǔ)上加入化合物C作用后，p-AMPK表達(dá)水平降低，IL-6的表達(dá)亦減少，證明角膜上皮細(xì)胞AMPK磷酸化與IL-6的分泌有關(guān)。

大量研究顯示，核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是炎癥產(chǎn)生的關(guān)鍵因子，IL-6是激活NF-κB信號傳導(dǎo)的刺激因子和激活產(chǎn)物[24-25]。本研究推測，角膜上皮細(xì)胞在真菌刺激下激活A(yù)MPK，通過NF-κB正反饋調(diào)節(jié)引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，以募集中性粒細(xì)胞到感染部位。本研究僅對角膜上皮細(xì)胞在真菌刺激下AMPK的激活以及產(chǎn)生的IL-6進(jìn)行了體外研究，并未對磷酸化AMPK促進(jìn)IL-6產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行探討，關(guān)于真菌刺激角膜上皮細(xì)胞激活A(yù)MPK-NF-κB-IL-6通路的假說仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)角膜上皮細(xì)胞中存在AMPK磷酸化，在真菌孢子誘導(dǎo)下，角膜上皮細(xì)胞AMPK磷酸化增強(qiáng)，IL-6分泌增多，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，有利于免疫細(xì)胞向感染部位募集，對真菌的徹底清除具有一定的意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明魏靜靜：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)分析；謝艷亭、岳娟、董軍璐、司瑋、王春梅：實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)分析；張紅敏：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持；王麗婭：論文修改，研究指導(dǎo)