板藍(lán)根多糖在3D4/21/CD163細(xì)胞上對(duì)PRRSV感染過(guò)程的影響

劉 建，蘇 科，朱世豪，樊俊洋，李倩楠，郝瀟雅，楊明凡,2,3，張紅英,2,3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450000；2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450000；3.鄭州市中獸藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450000)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus PRRSV)是引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的病原。該病以母豬晚期生殖障礙、仔豬呼吸窘迫、免疫抑制和持續(xù)性感染等為主要臨床癥狀，是威脅當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)最重要的疫病之一，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，僅美國(guó)年均經(jīng)濟(jì)損失超過(guò) 5.6 億美元[1]。

PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科(Arterividae)、動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)的成員，是一種基因組不分節(jié)、大小為15 kb、單股正鏈有囊膜的RNA病毒[2-3]。我國(guó)的流行毒株總體分屬于4個(gè)譜系，即lineage1、lineage3、lineage5、lineage8，其中sublinege 8.7是我國(guó)流行毒株的優(yōu)勢(shì)譜系，其代表性毒株為經(jīng)典毒株CH-1a和高致病性毒株JXA1等，其次是lineage1譜系，代表性毒株為HENAN-XINX、JL580，sublinege5.1譜系的代表毒株是VR-2332和BJ-4，其致病性相對(duì)較弱[4-5]。

目前防控PRRS主要采取弱毒苗和滅活疫苗預(yù)防，但由于弱毒疫苗存在散毒風(fēng)險(xiǎn)，而滅活疫苗免疫效果不佳，且PRRSV具有抗體依賴性增強(qiáng)作用，低水平抗體的存在反而有助于其感染增殖，加之病毒變異較快，故疫苗免疫效果并不理想[6-7]。PRRSV感染機(jī)體的巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞，導(dǎo)致宿主免疫功能低下，容易繼發(fā)其他病原感染[8-9]。因此，多年來(lái)對(duì)PRRS防控藥物及新型疫苗的研制一直是學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)[10-11]。

板藍(lán)根為中國(guó)傳統(tǒng)中藥，有清熱解毒、涼血利咽功能。板藍(lán)根多糖(IsatidisRadixpolysaccharides，IRPS)是板藍(lán)根中具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)活性的一類物質(zhì)[12]。板藍(lán)根多糖體外可以抑制人流感病毒(H1N1和H3N2亞型)、禽流感病毒(H6N2和H9N2亞型)、豬流感病毒(H3N2亞型)增殖，或通過(guò)抑制流感病毒H1N1、H5N1亞型神經(jīng)氨酸酶的活性或通過(guò)抑制TLR-3蛋白表達(dá)，或通過(guò)促進(jìn)IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ的分泌等發(fā)揮抗流感病毒作用[13-15]。胡元亮等研究發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根多糖在體外可抑制新城疫病毒(NDV)的增殖[16]。板藍(lán)根多糖在鵝胚內(nèi)具有極強(qiáng)的阻斷小鵝瘟病毒(GPV)感染、增殖和保護(hù)胚體組織器官免受其損傷的作用[17]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根多糖對(duì)在 Marc-145細(xì)胞上增殖的PRRSV有較好的抑制作用[18]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外廣泛開(kāi)展了中藥抗PRRSV的試驗(yàn)研究[19]，但體外試驗(yàn)多用MA-104和Marc-145細(xì)胞，這兩個(gè)細(xì)胞株來(lái)源于猴腎細(xì)胞，而PRRSV感染的靶細(xì)胞是豬肺泡巨噬細(xì)胞，兩者差異較大。本試驗(yàn)使用永生化的豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21/CD163作為PRRSV感染細(xì)胞，確定IRPS抗PRRSV的最佳濃度、作用方式和作用環(huán)節(jié)，為后續(xù)的IRPS抗PRRSV 作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞 PRRSV BJ 4毒株(TCID50為10-5.667)和永生化傳代豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/21/CD163)均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.2 板藍(lán)根多糖 本試驗(yàn)中用到的板藍(lán)根多糖由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取并保存，多糖含量為94.67%。

1.1.3 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(SH30809.01)，美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清(FB15015)，美國(guó)CLARK公司產(chǎn)品；青鏈霉素混合液(p1400)，谷氨酰氨粉末(G0200)，胰蛋白酶(T1300)，二甲基亞砜(DMSO D8371)，MTT(M8180)，牛血清白蛋白(A8020)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；PRRSV N抗體(bs-23941R)，北京博奧森公司產(chǎn)品；SYBR Green I(DRR041A)，日本Takara公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 PCR儀(A48141)，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀(7500/Bio-RAD iCycler)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；4℃離心機(jī)(Espresso)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Qp-160)，細(xì)胞生物安全柜(1300-A2)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 板藍(lán)根多糖對(duì)3D4/21/CD163細(xì)胞最大安全濃度研究 將3D4/21/CD163細(xì)胞以3×105個(gè)/mL的濃度鋪于96孔板，每孔100 μL，板藍(lán)根多糖用維持液稀釋成初始濃度為2 mg/mL的溶液，再用細(xì)胞生長(zhǎng)液連續(xù)倍比稀釋為5個(gè)濃度梯度，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度6個(gè)孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照和空白對(duì)照，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于結(jié)束培養(yǎng)前4 h每孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后取出培養(yǎng)板，棄去上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，置于酶標(biāo)儀上測(cè)波長(zhǎng)492 nm處的OD值。以MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率，采用SPSS軟件Probit回歸法計(jì)算藥物的最大安全濃度。

藥物抑制率(%)=(OD給藥組-OD病毒對(duì)照組)/(OD細(xì)胞對(duì)照組-OD病毒對(duì)照組)×100%

1.2.2 板藍(lán)根多糖抑制PRRSV增殖最佳作用方式和濃度研究

1.2.2.1 藥物的預(yù)防作用 3D4/21/CD163細(xì)胞以3×105個(gè)/mL的濃度鋪于24孔板，每孔500 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)成單層后，用維持液從最大安全濃度往下倍比稀釋3個(gè)濃度，每孔加入300 μL藥物，培養(yǎng)4 h后取出24孔板，棄上清，PBS洗2次，以100TCID50的濃度稀釋病毒液，每孔加入300 μL，培養(yǎng)2 h后棄去上清，PBS洗2次,每孔加入500 μL維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取RNA，用熒光定量PCR方法測(cè)定病毒拷貝數(shù)，確定板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV是否有抑制其增殖的作用。

1.2.2.2 藥物的直接殺滅作用 3D4/21/CD163細(xì)胞在24孔板中長(zhǎng)成單層后棄去生長(zhǎng)液，PBS洗兩次，以100TCID50的濃度稀釋病毒液，分別將各濃度藥物與病毒混合，每孔加300 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)2 h后棄去上清，每孔加入500 μL維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用熒光定量PCR方法確定板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV是否有直接殺滅作用。

1.2.2.3 藥物的治療作用 3D4/21/CD163細(xì)胞在24孔板中長(zhǎng)成單層后棄去生長(zhǎng)液，PBS洗2次，以100TCID50的濃度稀釋病毒液，培養(yǎng)2 h后棄去上清，PBS洗2次，用維持液從最大安全濃度往下倍比稀釋3個(gè)濃度，每孔加入500 μL藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用熒光定量PCR方法確定藥物是否對(duì)病毒入侵細(xì)胞后有抑制作用。

1.2.3 板藍(lán)根多糖作用于PRRSV復(fù)制環(huán)節(jié)的研究1.2.3.1 板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV吸附環(huán)節(jié)的影響 以100TCID50的濃度稀釋病毒液，分別將各濃度藥物和病毒混合，每孔加300 μL，4℃吸附2 h后棄去上清，PBS洗兩次，每孔加入500 μL維持液，37℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。用熒光定量PCR方法檢測(cè)板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV吸附的抑制作用。

1.2.3.2 板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV侵入環(huán)節(jié)的影響 以100TCID50的濃度稀釋病毒液，感染3D4/21/CD163細(xì)胞，4℃吸附2 h后棄去病毒液，每孔加入500 μL維持液，轉(zhuǎn)入37℃培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)入37℃ 的0、1、2 h加入最佳作用濃度的板藍(lán)根多糖，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用熒光定量PCR方法檢測(cè)板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV入侵宿主細(xì)胞的抑制作用。

1.2.4 板藍(lán)根多糖抗PRRSV作用的確證

1.2.4.1 熒光定量方法檢測(cè)PRRSV拷貝數(shù) 采用最佳給藥途徑、用最佳劑量的板藍(lán)根多糖作用于PRRSV，設(shè)置細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照，分別在PRRSV感染3D4/21/CD163細(xì)胞后36 h、48 h、72 h，收取細(xì)胞和細(xì)胞上清樣品，以熒光定量PCR方法檢測(cè)板藍(lán)根多糖在最佳作用濃度、最佳作用方式下對(duì)PRRSV拷貝數(shù)的影響。

1.2.4.2 間接免疫熒光檢測(cè)藥物對(duì)PRRSV的作用 采用最佳給藥途徑、用最佳劑量的板藍(lán)根多糖作用于PRRSV，設(shè)置細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照，在PRRSV感染細(xì)胞后的第48 h收取細(xì)胞，用PBS洗3次，然后加入組織固定液，37℃ 30 min，PBS洗3次，向每孔加入5 g/L TritonX-100 15 min，PBS洗3次，加入50 g/L 牛血清白蛋白37℃封閉2 h。PBS洗3次，然后一抗孵育2 h，PBS洗3次，加入標(biāo)記FITI標(biāo)簽的二抗孵育50 min，PBS洗3次，向每孔加入DAPI室溫孵育10 min，PBS洗3次，最后加入60%甘油，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 用prism8.0 和spss軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2 結(jié)果

2.1 板藍(lán)根多糖對(duì)細(xì)胞的最大安全濃度測(cè)定

由1.2.1中的公式可以求出板藍(lán)根多糖的最大安全濃度(表1)。當(dāng)板藍(lán)根多糖濃度為0.062 5 mg/mL時(shí)藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率小于10%，當(dāng)藥物濃度繼續(xù)往低濃度稀釋，藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，所以IRPS對(duì)3D4/21/CD163細(xì)胞的最大安全濃度為0.062 5 mg/mL。

表1 IRPS在3D4/21/CD163細(xì)胞上的安全濃度Table 1 Safe concentration of Isatidis Radix polysaccharides on 3D4/21/CD163 cells

2.2 板藍(lán)根多糖抑制PRRSV增殖的最佳作用方式和濃度

如圖1所示，當(dāng)藥物濃度為0.062 5 mg/mL時(shí)，用藥組細(xì)胞中病毒拷貝數(shù)顯著低于病毒對(duì)照組(P<0.001)；當(dāng)藥物濃度為0.031 3 mg/mL時(shí)與病毒對(duì)照組無(wú)顯著性差異；當(dāng)藥物濃度為0.015 6 mg/mL時(shí)顯著低于病毒對(duì)照組(P<0.01)。不同濃度藥物組的病毒拷貝數(shù)均顯著低于病毒對(duì)照組(P<0.000 1)，見(jiàn)圖2。當(dāng)藥物濃度為0.062 5 mg/mL 時(shí)低于病毒對(duì)照組拷貝數(shù)(P<0.05)，而其余濃度的藥物組病毒拷貝數(shù)與病毒對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)圖3。此結(jié)果說(shuō)明IRPS對(duì)PRRSV具有一定的預(yù)防作用和直接殺滅作用，且直接殺滅作用療效最優(yōu)。藥物濃度為0.062 5 mg/mL時(shí)，3種作用方式均好于0.031 3 mg/mL和0.0156 mg/mL。后續(xù)IRPS對(duì)PRRSV的抗病毒確證試驗(yàn)采用0.062 5 mg/mL劑量的直接殺滅作用方式進(jìn)行。

A.病毒對(duì)照組；B.0.062 5 mg/mL；C.0.031 3 mg/mL；D.0.015 6 mg/mLA.Virus control group;B.0.062 5 mg/mL;C.0.031 3 mg/mL;D.0.015 6 mg/mL圖1 板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV的預(yù)防作用Fig.1 Prophylactic effect of Isatidis Radix polysaccharides on PRRSV

A.病毒對(duì)照組；B.0.062 5 mg/mL；C.0.031 3 mg/mL；D.0.015 6 mg/mLA.Virus control group;B.0.062 5 mg/mL;C.0.031 3 mg/mL;D.0.015 6 mg/mL圖2 板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV的直接殺滅作用Fig.2 Direct killing effect of Isatidis Radix polysaccharides on PRRSV

A.病毒對(duì)照組；B.0.062 5 mg/mL；C.0.031 3 mg/mL；D.0.015 6 mg/mLA.Virus control group;B.0.062 5 mg/mL;C.0.031 3 mg/mL;D.0.015 6 mg/mL圖3 板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV的治療作用Fig.3 Therapeutic effect of Isatidis Radix polysaccharides on PRRSV

2.3 板藍(lán)根多糖作用于PRRSV復(fù)制環(huán)節(jié)的研究

如圖4所示，當(dāng)藥物作用于病毒的吸附環(huán)節(jié)時(shí)，0.062 5 mg/mL 濃度的藥物組細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)高于病毒對(duì)照組(P<0.05)，其余2個(gè)濃度藥物組與病毒對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。當(dāng)藥物作用于病毒的入侵環(huán)節(jié)時(shí)，不同時(shí)間點(diǎn)藥物處理組的拷貝數(shù)均顯著低于病毒對(duì)照組(P<0.0001)，見(jiàn)圖5。此結(jié)果說(shuō)明IRPS主要對(duì)RPPSV復(fù)制的入侵環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。

A.病毒對(duì)照組；B.0.062 5 mg/mL；C.0.031 3 mg/mL；D.0.015 6 mg/mLA.Virus control group;B.0.062 5 mg/mL;C.0.031 3 mg/mL;D.0.015 6 mg/mL圖4 板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV吸附環(huán)節(jié)的影響Fig.4 Effect of Isatidis Radix polysaccharides on the adsorption of PRRSV

A.病毒對(duì)照組；B.0 h；C.1 h；D.2 hA.Viral control group;B.0 h;C.1 h;D.2 h圖5 板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV入侵環(huán)節(jié)的影響Fig.5 Effect of Isatidis Radix polysaccharides on the invasion of PRRSV

2.4 熒光定量方法檢測(cè)PRRSV拷貝數(shù)

以最佳給藥濃度和最佳給藥方式的IRPS作用于PRRSV，從細(xì)胞中病毒的拷貝數(shù)可以看出，在36 h時(shí)病毒增殖達(dá)到最高峰，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒拷貝數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在36 h和48 h時(shí)用藥組病毒拷貝數(shù)極顯著低于病毒對(duì)照組(P<0.000 1)。

A.病毒對(duì)照組；B.板藍(lán)根多糖處理組A.Virus control group;B.Treatment group of Isatidis Radix polysaccharides圖6 不同時(shí)間點(diǎn)給藥組和病毒對(duì)照組病毒的拷貝數(shù)Fig.6 Copies of virus in drug administration group and virus control group at different time points

2.5 間接免疫熒光檢測(cè)IRPS對(duì)PRRSV的作用

如圖7所示，DAPI染色后細(xì)胞核被染成藍(lán)色，細(xì)胞對(duì)照組與用藥組細(xì)胞核狀態(tài)相近，細(xì)胞核圓潤(rùn)，染色后激發(fā)的顏色均一，病毒對(duì)照組細(xì)胞核皺縮，顆粒感強(qiáng)。FITC標(biāo)記的N蛋白被染成綠色，細(xì)胞對(duì)照組無(wú)熒光，用藥組熒光較弱，病毒對(duì)照組細(xì)胞熒光很強(qiáng)且連接成片，此結(jié)果說(shuō)明IRPS有抗PRRSV的作用。

3 討論

3.1 IRPS對(duì)PRRSV感染環(huán)節(jié)的影響

病毒的感染包括吸附、入侵、脫殼、生物合成、組裝和釋放幾個(gè)環(huán)節(jié)，其中任一環(huán)節(jié)受到影響都可以干擾病毒的感染。板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV不同感染環(huán)節(jié)的作用結(jié)果表明，在病毒入侵細(xì)胞環(huán)節(jié)時(shí)用IRPS處理，給藥組病毒的拷貝數(shù)明顯低于病毒對(duì)照組(P<0.001)，說(shuō)明IRPS可以干擾PRRSV的入侵。PRRSV入侵豬肺泡巨噬細(xì)胞依賴于受體介導(dǎo)的內(nèi)吞小泡和低pH介導(dǎo)的內(nèi)吞通路[20]，IRPS在抑制PRRSV入侵細(xì)胞的過(guò)程中，是否通過(guò)影響內(nèi)吞過(guò)程而抑制了病毒的入侵有待進(jìn)一步研究。

3.2 IRPS不同給藥方式對(duì)PRRSV增殖的影響

本試驗(yàn)中以3種給藥方式研究了板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV的抑制效果，結(jié)果表明，當(dāng)藥物濃度為0.062 5 mg/mL時(shí)，預(yù)防作用和直接殺滅作用效果極顯著。在研究板藍(lán)根多糖預(yù)防作用時(shí)先把藥物作用于細(xì)胞4 h，可能提高了細(xì)胞的免疫力，或者封閉了某些受體，所以對(duì)病毒入侵有一定的抑制作用。在研究IRPS對(duì)PRRSV直接殺滅作用時(shí)，分別將各濃度藥物和病毒混合后37℃作用于細(xì)胞，2 h后棄去，這種作用方式與研究病毒的入侵環(huán)節(jié)接近，其結(jié)果與IRPS能夠抑制PRRSV對(duì)宿主細(xì)胞的入侵一致。

A.細(xì)胞對(duì)照組；B.病毒對(duì)照組；C.板藍(lán)根多糖處理組a.各組細(xì)胞核染色結(jié)果；b.各組免疫熒光結(jié)果；c.熒光融合結(jié)果A.Cell control group;B.Virus control group;C.Treatment group of Isatidis Radix polysaccharidesa.Nuclear staining results;b.Immunofluorescence results;c.Fluorescence fusion results圖7 各組熒光染色結(jié)果Fig.7 Fluorescence staining results of each group

王學(xué)兵[21]等發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根多糖在Marc-145細(xì)胞上對(duì)PRRSV具有較好的阻斷(相當(dāng)于本試驗(yàn)中的預(yù)防作用)和抑制作用(操作方法相當(dāng)于本試驗(yàn)中的治療作用)，而本試驗(yàn)中的治療作用雖有效，但遜于預(yù)防作用和直接殺滅作用，其結(jié)果的差異性可能與所用細(xì)胞有關(guān)。

3.3 不同細(xì)胞在PRRSV研究中的應(yīng)用

本試驗(yàn)中IRPS在3D4/21/CD163細(xì)胞上的最大安全濃度與本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得IRPS在Marc-145上的最大安全濃度一致，說(shuō)明3D4/21/CD163作為PRRSV體外試驗(yàn)的靶細(xì)胞與Marc-145相比，對(duì)IRPS的耐受性相同。本試驗(yàn)在王學(xué)兵等[21]試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上增加藥物對(duì)病毒的直接殺滅作用，從結(jié)果看來(lái)，最佳的給藥方式不相同，這兩種細(xì)胞都作為PRRSV體外研究的靶細(xì)胞表現(xiàn)出不同的結(jié)果，推測(cè)3D4/21/CD163細(xì)胞作為改造的PAM細(xì)胞相比較Marc-145細(xì)胞可能具有更大的同源性，試驗(yàn)結(jié)果可能更加可靠。

PRRSV有很強(qiáng)的細(xì)胞嗜性，通過(guò)結(jié)合細(xì)胞受體感染宿主細(xì)胞。PRRSV在體外僅能在豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)和MA-104、Marc-145、CL-2621等少數(shù)幾種細(xì)胞中增殖。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外廣泛開(kāi)展了中藥抗PRRSV的試驗(yàn)研究[19]，但體外試驗(yàn)多用MA-104和Marc-145細(xì)胞，這2個(gè)細(xì)胞株來(lái)源于猴的腎細(xì)胞，因其為非豬源細(xì)胞[22-23]，也不屬于單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，只限于與自然宿主相關(guān)的體外試驗(yàn)，因此其試驗(yàn)結(jié)果可能與臨床實(shí)際感染差異較大。原代培養(yǎng)的PAM細(xì)胞在生物學(xué)和免疫病理學(xué)方面有許多優(yōu)點(diǎn)，最接近體內(nèi)病毒感染情況，但因細(xì)胞分離培養(yǎng)操作過(guò)程復(fù)雜，不能連續(xù)傳代，成本高昂，不宜廣泛應(yīng)用。3D4/21是永生化的豬肺泡巨噬細(xì)胞，將PAM細(xì)胞的CD163基因克隆到真核表達(dá)載體上，然后把其轉(zhuǎn)染到3D4/21(CLR-2843)細(xì)胞上，經(jīng)過(guò)Zeocin抗性篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)CD163的豬肺泡巨噬細(xì)胞系[24]。將此細(xì)胞用于抗PRRSV藥物篩選的體外模型細(xì)胞，其試驗(yàn)結(jié)果更接近PAM細(xì)胞，又比PAM細(xì)胞方便易得，其結(jié)果可能對(duì)后續(xù)的臨床應(yīng)用提供更可靠的理論指導(dǎo)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根多糖體外對(duì)PRRSV具有很好的預(yù)防和直接殺滅作用，其主要是作用于病毒的入侵環(huán)節(jié)，為后續(xù)研究其抗PRRSV病毒機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。