甜菊糖苷類化合物的質(zhì)譜行為分析及定量策略初探

羅慶云，印敏

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095；2.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所/南京中山植物園，南京 210014）

0 引言

植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究是對(duì)目標(biāo)器官所含化合物的全面分析，是以特定部位所含化合物為依據(jù)，對(duì)植物資源加以描述和分類的一門形態(tài)學(xué)與化學(xué)相互滲透的學(xué)科。其基于化學(xué)組分間的有機(jī)聯(lián)系，探討化合物的形成、積累、轉(zhuǎn)化機(jī)制，為以特定部位所含目標(biāo)化合物為關(guān)注對(duì)象的遺傳改良和栽培管理提供依據(jù)，其主要任務(wù)之一就是對(duì)特定部位所含各化合物進(jìn)行相對(duì)全面的定性、定量表征。液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)具有定性范圍廣、相對(duì)定量準(zhǔn)確、操作簡單、檢測快速、使用成本低等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于化合物定性、定量分析，經(jīng)發(fā)展，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)器官檢出化合物的定性、定量分析，用于構(gòu)建植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究體系所需數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)[1-4]。

隨著體重控制人群的增加，原產(chǎn)于南美洲阿曼山脈的菊科斯特維亞屬宿根性多年生草本植物甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni），簡稱甜菊，因其葉富含一類甜度為蔗糖200～300 倍，但熱量僅為蔗糖1/300 的四環(huán)二萜類化合物——甜菊糖苷（Steviol glycosides）而被廣泛種植、加工[5]。我國是世界最主要的甜菊種植、加工基地，年產(chǎn)甜菊葉近10萬噸，開展甜菊品質(zhì)育種及配套栽培措施研究，提高甜菊葉內(nèi)甜菊糖苷等化合物含量，可提高甜菊葉加工效益，促進(jìn)甜菊產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[6]。

本研究以甜菊葉所含甜菊糖苷類化合物為例，探討建立利用LC-MS對(duì)植物目標(biāo)器官所含各組分進(jìn)行定量的化學(xué)計(jì)量方法，為作物品質(zhì)育種親本選配及栽培管理措施評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)分析方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試甜菊

以按常規(guī)方法種植于江蘇南京湯山的甜菊種質(zhì)資源圃（E119.0651°、N32.0647°）、實(shí)驗(yàn)室自育、葉內(nèi)各甜菊糖苷組分差異大、編號(hào)分別為‘6797’、‘6808’、‘6822’的3個(gè)甜葉菊品系的現(xiàn)蕾期葉片為材料。

1.1.2 儀器、試劑樣品

分析儀器：液質(zhì)聯(lián)用儀Agilent 1260 UPLC-DAD-6530 ESI-QTOF MS。分析耗材：色譜柱ACE Ultracore 2.5 Super C18柱（150 mm×4.6 mm,2.5μm）（廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司）；甲酸（美國如意，LCMS級(jí)）；乙腈（Tedia company Inc,absolv）；去離子純化水。

1.1.3 甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品

甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品瑞鮑迪苷A（Rebaudioside A，RA）、瑞鮑迪苷B（Rebaudioside B，RB）、瑞鮑迪苷C（Rebaudioside C，RC）、瑞鮑迪苷D（Rebaudioside D，RD）、瑞鮑迪苷E（Rebaudioside E，RE）、瑞鮑迪苷F（Rebaudioside F，RF）、瑞鮑迪苷G（Rebaudioside G，RG）、瑞鮑迪苷M（Rebaudioside M，RM）、瑞鮑迪苷N（Rebaudioside N，RN）、瑞鮑迪苷O（Rebaudioside O，RO）、雙糖苷（Steviolbioside，SB）、甜菊苷（Stevioside，STV）12 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，部分購于ChromaDex、部分由浩天藥業(yè)有限公司饋贈(zèng)，用含30%（v/v）乙腈的水溶液溶解。

1.2 方法

1.2.1 甜菊葉材料的處理

80 ℃烘箱中烘干過夜，參照羅慶云等[7]方法準(zhǔn)備樣品備用。

1.2.2 分析用樣品準(zhǔn)備及進(jìn)樣方法

將各甜菊葉提取液及混合標(biāo)準(zhǔn)品分別用含50%乙醇的水溶液稀釋至原濃度的100%、80%、60%、40%和20%（在圖1和表2～表7中分別用濃度梯度“5”～“1”表示，濃度梯度“5”為原濃度的100%，濃度梯度“1”為原濃度的20%），各10μL上機(jī)檢測。

1.2.3 液質(zhì)聯(lián)用條件及方法

采用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測各材料葉片所含化合物，其中，液相分離體系為：以ACE Ultracore 2.5 Super C18柱為固定相，以含0.1%（v/v）甲酸（A）的純凈水和乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫條件為：0 min 22.0% B、7.0 min 26.5%B、12.0 min 26.5%B、15.0 min 38.0%B、19.0 min 100%B、22.0 min 100%B、22.01 min 22.0%B。

質(zhì)譜條件為：離子源為電噴霧電離源，負(fù)離子掃描模式，霧化氣為純度99.9%氮?dú)?，碰撞氣為純?9.999%氮?dú)?，霧化氣壓力為50 psi，干燥氣溫度為350 ℃，干燥氮?dú)饬髁繛?0.0 L/min，毛細(xì)管電壓為3 000 V，Mass range 100～3 500 m/z，碰裂電壓170 V，Mass Hunter B0.05.00工作站。

1.3 數(shù)據(jù)的采集分析策略

結(jié)合保留時(shí)間和共分離特征峰分析歸屬各甜菊糖苷的離子峰種類，并采集質(zhì)荷比≥M/2 的裂解碎片、單分子、加和離子、雙分子聚合物和三分子聚合物等組分及其同位素化合物的定量檢出峰面積信息，分析各化合物相關(guān)組分的離子峰面積隨各甜菊糖苷濃度變化情況，建立利用LC-MS對(duì)各甜菊糖苷進(jìn)行定量的化學(xué)計(jì)量方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 各甜菊糖苷類化合物定量分析用特征離子的確定

以材料中某單一化合物含量最高、受周邊化合物影響最小的樣品為案例，采用“步進(jìn)”掃描結(jié)合共分離法提取考察LC-MS體系中歸屬各化合物的離子種類，利用“區(qū)域全掃描”方法確定甜菊葉內(nèi)各主要甜菊糖苷類化合物的各組分同位素化合物m/z值分布范圍（表1）。

表1 甜菊糖苷類化合物各組分同位素化合物m/z 值分布范圍Table 1 The m/z range of each isotopic group of steviol glycosides

續(xù)表1 Conticuned Table 1

2.2 進(jìn)樣濃度對(duì)樣品所含化合物離子信息檢出效率的影響

利用上述特征離子信息，采用非對(duì)稱提取方法（-0.000 0～+0.999 9），提取歸屬各組分的離子及其同位素化合物離子的定量檢出峰信息。對(duì)各樣品中定量檢出離子種類數(shù)的變化情況分析結(jié)果顯示，各樣品定量檢出離子種類隨樣品內(nèi)所含化合物濃度的增大而呈線性增加（圖1）。這一結(jié)果表明，由于LC-MS 儀器對(duì)化合物離子的定量存在檢測限，在利用LC-MS 系統(tǒng)建立植物目標(biāo)器官化學(xué)形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)時(shí)，各組分在樣品中的含量高低是影響相關(guān)化合物能否被有效定量的關(guān)鍵因素之一。

另，圖1 結(jié)果還顯示，與甜菊葉片提取樣品相比較，混合標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)定量檢出離子信息數(shù)隨進(jìn)樣濃度梯度的增幅明顯偏低。這一結(jié)果表明，各樣品因其所含化合物豐富度不同，隨進(jìn)樣濃度的增大，其檢出化合物離子種類增幅不一：化合物組成越豐富的樣品，其檢出化合物離子種類增幅越大；反之，化合物組成越單一的樣品，其檢出化合物離子種類增幅越小。

圖1 樣品所含化合物濃度對(duì)定量檢出離子信息量的影響Fig.1 Influence of concentration of compounds in sample on items of quantitatively detectable ion

2.3 化合物濃度對(duì)歸屬同一甜菊糖苷類化合物的各類型離子質(zhì)譜行為的影響

在混合體系中，各化合物的濃度差異大，為探討建立一種適用于混合體系內(nèi)各濃度水平的化合物定量策略，本部分以含量高的STV、中等的RE 和低的RO 三種甜菊糖苷化合物為例，探討化合物濃度對(duì)各類型離子質(zhì)譜行為的影響，在此基礎(chǔ)上，再進(jìn)一步探討各甜菊糖苷類化合物的定量策略。表2～表7 內(nèi)各樣品排列順序?yàn)橄嚓P(guān)組分含量由高到低進(jìn)行排列，對(duì)同一樣品，按照甜菊糖苷濃度梯度由高（濃度水平“5”）到低（濃度水平“1”）排列。

2.3.1 化合物濃度對(duì)歸屬同一化合物各組分檢出效率的影響

表2～表4為分別以歸屬于STV/RE/RO 的各類型離子檢出峰面積的總和為100%，測算各類型離子檢出峰面積的絕對(duì)占比隨STV/RE/RO 濃度梯度的變化情況。結(jié)果顯示，在各種類型離子峰組中，以分子離子化合物組的檢出峰面積占比最高，其次為裂解離子組、加和離子組和多分子聚合離子組；在裂解離子組中以初級(jí)裂解離子組的檢出峰面積總和占比高于次級(jí)裂解離子組，在加和離子組中以硝酸根加和離子組檢出峰面積總和占比高于氯離子加和離子，在聚合體組中雙分子聚合體檢出峰面積總和占比高于三分子聚合體。

表4 RO 各組分離子檢出效率隨進(jìn)樣濃度梯度變化情況Table 4 Detection efficiency of component of RO varies with the gradient of concentration in samples

在混合體系中，隨著化合物濃度的增加，化合物傾向于形成多分子聚合體，體系中多分子聚合體所占比例也隨化合物濃度的增加而增高。但是表2結(jié)果顯示，隨著所進(jìn)樣品中STV 濃度梯度的增加，雙分子和三分子聚合體離子檢出峰面積的占比逐漸減小。具體原因可能是由于體系中單分子形態(tài)存在的STV 濃度過高，在LC-MS 檢測時(shí)，單分子形態(tài)存在的STV 檢測信號(hào)形成了對(duì)聚合體形態(tài)存在的STV 檢測信號(hào)的掩蓋，其根本原因是由于LC-MS檢測器對(duì)化合物質(zhì)譜信號(hào)的響應(yīng)和提取能力有限。

表2 STV 各組分離子檢出效率隨進(jìn)樣濃度梯度變化情況Table 2 Detection efficiency of component of STV varies with the gradient of concentration in samples

表3 和表4 結(jié)果顯示，當(dāng)所進(jìn)樣品中RE 或RO 濃度較低時(shí)，隨著所進(jìn)樣濃度梯度的增加，其雙分子聚合體和三分子聚合體離子檢出峰面積在總檢出峰面積中的占比逐漸增大，符合前述一般規(guī)律。同樣地，這可能是由于源于單分子形態(tài)的化合物離子信號(hào)因化合物濃度較低而不足以掩蓋源于雙分子/三分子聚合體的離子信號(hào)。這一結(jié)果揭示，欲準(zhǔn)確表征混合體系中各類型離子相對(duì)含量，應(yīng)減小化合物的進(jìn)樣濃度，但由于植物器官中各化合物濃度不一，這對(duì)著眼于目標(biāo)器官所含化合物全面解析的植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究具有一定挑戰(zhàn)性。

表3 RE 各組分離子檢出效率隨進(jìn)樣濃度梯度變化情況Table 3 Detection efficiency of component of RE varies with the gradient of concentration in samples

作物器官所含各化合物種類繁多，大多數(shù)化合物為絕對(duì)含量低于0.1%的微量和痕量化合物，建立對(duì)這類化合物進(jìn)行定量的化學(xué)計(jì)量方法是植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究的重要任務(wù)。本研究以甜菊葉片中含量相對(duì)較低的RO 為例，分析其相關(guān)組分離子在檢測體系中質(zhì)譜行為。表4結(jié)果顯示，當(dāng)化合物濃度較低時(shí)，分子離子峰占比增大，隨著化合物濃度的進(jìn)一步降低，大多數(shù)化合物以裂解離子的方式被檢出，而在痕量濃度下，其他組分的信號(hào)低于儀器檢測限，只有分子離子的信號(hào)能被檢出。

2.3.2 化合物濃度對(duì)各組分同位素化合物相對(duì)檢出效率的影響

C、H、O 的同位素元素廣泛存在于自然界中，在一定條件下，同位素化合物間的比例是相對(duì)穩(wěn)定的。以各同位素組中檢出峰面積最大組分的峰面積為100%，對(duì)各同位素化合物檢出峰面積相對(duì)豐度的分析結(jié)果顯示，在檢測體系中，裂解離子組、分子離子組、加和離子組、雙分子和三分子聚合物組中各同位素化合物檢出峰面積的相對(duì)豐度整體表現(xiàn)為隨檢測體系中STV濃度梯度的增大而不斷提高（表5）。

表5 STV 各組分同位素離子檢出效率隨進(jìn)樣濃度梯度變化情況Table 5 Detection efficiency of isotopiccomponent of STV varies with the gradient of concentration in samples

對(duì)于混合體系中濃度較低的化合物RE，隨著所檢測樣品中RE濃度的降低，離子體系中占比較低的裂解離子組、雙分子和三分子聚合物組中同位素化合物的檢出峰面積的相對(duì)豐度波動(dòng)幅度較大（表6）。

表6 RE 各組分同位素離子檢出效率隨進(jìn)樣濃度梯度變化情況Table 6 Detection efficiency of isotopic component of RE varies with the gradient of concentration in samples

對(duì)于混合體系中處于痕量的化合物RO，隨著所進(jìn)樣樣品中RO 濃度的降低，在所屬化合物離子體系中占比較低的裂解離子組、雙分子聚合物組中同位素化合物檢出峰面積的相對(duì)豐度波動(dòng)幅度遠(yuǎn)大于STV和RE者（表7）。

表7 RO 各組分同位素離子檢出效率隨進(jìn)樣濃度梯度變化情況Table 7 Detection efficiency of isotopic component of RO varies with the gradient of concentration in samples

續(xù)表7 Continued Table 7

2.4 甜菊糖苷類化合物的LC-MS定量策略

在植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究中，由于所面臨的研究對(duì)象為作物收獲器官，其所含化合物種類繁多，為更全面地解析化學(xué)組分間的有機(jī)聯(lián)系，探討化合物的形成、積累、轉(zhuǎn)化機(jī)制，需要更廣泛地采集收獲器官所含化合物的定性定量信息。在正常情況下，目標(biāo)器官內(nèi)相對(duì)含量高于10.0%或1.0%以上的化合物種類較少，絕大多數(shù)的化合物含量多低于1.0%及0.1%以下。為更全面地解析化學(xué)組分間的有機(jī)聯(lián)系，需要對(duì)目標(biāo)器官所含化合物相對(duì)全面地進(jìn)行定量，即需要建立一種適用于植物化學(xué)形態(tài)學(xué)分析的化合物定量策略，要求所定量的化合物含量分布范圍廣，相對(duì)含量從10.0%以上到0.1%以下。

結(jié)合甜葉菊育種和栽培實(shí)際，為建立一種甜菊葉源甜菊糖苷類化合物的LC-MS 定量策略，本研究以葉內(nèi)各甜菊糖苷組分及含量差異大的甜葉菊品系現(xiàn)蕾期葉片為材料，采用梯度稀釋、等體積進(jìn)樣方法，采集分析歸宿各甜菊糖苷類化合物的質(zhì)荷≥M/2的裂解碎片、單分子、加和離子、雙分子聚合物和三分子聚合物等組分及其同位素化合物的檢出峰面積信息隨樣品進(jìn)樣濃度梯度的線性相關(guān)分析，以建立利用LC-MS對(duì)各化合物進(jìn)行定量的化學(xué)計(jì)量方法。

由于LC-MS具有一定的檢測限，當(dāng)代表某種化合物的離子信號(hào)強(qiáng)度低于背景值10 倍以下時(shí)，儀器就無法對(duì)相關(guān)化合物進(jìn)行定量。從表5～表7可以看出，歸屬各甜菊糖苷組分可定量檢出的離子種類隨所檢樣品中各甜菊糖苷組分濃度的不同而不同。總體表現(xiàn)為，當(dāng)樣品中化合物濃度較高時(shí)，除分子離子外，可定量檢出的離子種類有各級(jí)裂解離子、加和離子和聚合物離子；隨著所檢樣品中化合物濃度的降低，依次消失的離子信號(hào)為：三分子聚合物離子、雙分子聚合物離子、次級(jí)裂解物離子、初級(jí)裂解物離子、硝酸根加和離子、氯離子加和離子；當(dāng)化合物濃度降低至痕量時(shí)，直至最后才消失的可定量檢出離子信號(hào)為分子離子?；诖耍瑸榻⒁环N適用于化合物含量分布范圍廣的定量策略，宜選用分子離子信號(hào)作為定量的主要依據(jù)。

表8 的結(jié)果表明，三分子聚合物離子、雙分子聚合物離子、次級(jí)裂解物離子、初級(jí)裂解物離子、氯離子加和離子類型的離子峰面積信息在化合物濃度過低時(shí)都會(huì)出現(xiàn)缺失，即LC-MS系統(tǒng)對(duì)這些類型的離子信息只有在化合物濃度足夠高時(shí)才能定量檢出，若以這些類型的離子峰信息作為相關(guān)化合物的定量依據(jù)，其定量限高，無法滿足植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究對(duì)植物收獲器官中廣泛存在的含量較低化合物進(jìn)行有效定量的要求。

相對(duì)地，分子離子組、分子離子同位素組和各類離子類型的總和3種檢出峰面積參數(shù)為與本研究所涉甜菊葉樣品所含12 種甜菊糖苷類化合物濃度梯度密切相關(guān)的組分類型，這3 種類型的峰面積信息在各類型樣品中都穩(wěn)定存在，且與化合物的濃度梯度呈線性相關(guān)。為此，可以選用這3種離子峰面積信息作為各甜菊糖苷類化合物的定量依據(jù)。在此3 種離子峰面積信息中，又多以各檢出峰面積的總和與化合物濃度梯度間相關(guān)性更強(qiáng)。基于表8所展示的數(shù)據(jù)，在利用LC-MS 對(duì)各化合物進(jìn)行定量時(shí)，宜采用所有類型離子的檢出峰面積總和為參數(shù)，若因此參數(shù)的獲取所要求的數(shù)據(jù)準(zhǔn)備和統(tǒng)計(jì)工作量較大，可退而求其次地選用分子離子同位素組檢出峰面積為參數(shù)。

表8 甜菊糖苷類化合物各組分檢出峰面積與樣品進(jìn)樣濃度梯度的線性相關(guān)系數(shù)（r2）Table 8 Linear correlation coefficient between peak area of each component of steviol glycosides and the gradient of concentration in samples

另外，由于甜菊葉內(nèi)甜菊糖苷類化合物種類繁多，目前已知的甜菊糖苷類化合物近50余種，在本研究中我們注意到，在現(xiàn)有分離檢測體系下，甜菊糖苷化合物分離峰間（如RA和STV）存在交叉疊加現(xiàn)象，且存在具有相同m/z值的組分峰，這導(dǎo)致相關(guān)組分峰在歸宿性分析時(shí)存在混淆，在此情況下，當(dāng)化合物濃度較高時(shí)（如‘6808’、‘6797’和‘6822’中的STV），可選用與化合物濃度梯度相關(guān)性較好的硝酸根加和離子峰面積或雙分子離子峰面積等信息建立定量關(guān)系式。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在混合體系中，化合物除以分子離子的方式存在外，還以加和離子、雙分子及三分子聚合物等方式存在?，F(xiàn)有LC-MS 定量方法中，多以LC-MS/MS 定量為準(zhǔn)，其基本原則是多只依據(jù)可以裂解為特定的初級(jí)裂解離子或次級(jí)裂解離子的分子離子的量作為定量依據(jù)[8-10]。僅以分子離子峰或已裂解為特定的初級(jí)或次級(jí)裂解離子的分子離子峰面積進(jìn)行的定量分析結(jié)果與化合物濃度間相關(guān)性差，其余各組分所占比例也依化合物濃度不同存在較大波動(dòng)，都不宜單獨(dú)作為相關(guān)化合物的定量依據(jù)。

為此，本研究的意義體現(xiàn)在，通過對(duì)歸屬各甜菊糖苷化合物各組分離子及其同位素化合物定量檢出峰面積信息與化合物濃度梯度間的相關(guān)性所進(jìn)行的較為全面的考察，揭示了歸屬同一甜菊糖苷化合物的任何單一組分離子及其同位素化合物離子的定量檢出峰面積信息都會(huì)因化合物濃度不同而存在較大波動(dòng)，不宜單獨(dú)作為LC-MS定量依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提出應(yīng)以相關(guān)化合物的檢出各組分離子定量檢出峰面積信息的總和作為其LC-MS 定量依據(jù)，這樣建立的定量體系更適用于對(duì)混合體系中含量差異大各化合物的表征，更有利于植物化學(xué)形態(tài)學(xué)研究對(duì)作物收獲器官所含含量分布范圍廣的各化合物的全面解析，利于闡明各化學(xué)組分間的有機(jī)聯(lián)系，為作物品質(zhì)育種親本選配及栽培管理措施評(píng)價(jià)提供更為可靠的數(shù)據(jù)分析方法。