維吾爾族乳腺癌中STAT3的表達(dá)及臨床病理意義

周 梅，阿迪拉·斯依提，葉 明，岳 娜，陳鈺偉，禤瑞霞

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一[1]，也是女性癌癥死亡的主要原因[2]。維吾爾族和漢族占新疆人口的絕大多數(shù)，維吾爾族在遺傳背景、生活方式等方面不同于其他民族，因此探尋其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)個(gè)體化治療以及提高維吾爾族乳腺癌患者的預(yù)后和生存質(zhì)量有重要意義。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是一種重要的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)因子和細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，可與酪氨酸磷酸化通道相偶聯(lián)而被激活，介導(dǎo)多種信號(hào)分子調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡，影響腫瘤進(jìn)展[3]。STAT3在多數(shù)惡性腫瘤中被激活[4]，而其在維吾爾族乳腺癌中的作用尚未見報(bào)道。本文著重分析不同分子分型維吾爾族浸潤(rùn)性乳腺癌中STAT3的表達(dá)，探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為預(yù)測(cè)臨床療效提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2013年1月～2014年12月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科存檔的維吾爾族乳腺癌80例和正常乳腺組織30例，患者均為女性，中位年齡54歲(27～81歲)。病理類型均為非特殊類型浸潤(rùn)性乳腺癌，組織學(xué)分級(jí)及分期標(biāo)準(zhǔn)參照WHO(2012)乳腺腫瘤分類。乳腺癌分子分型采用免疫組化替代分型(2013年St Gallen乳腺癌會(huì)議國(guó)際共識(shí)[4])，即LuminaI A型、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型和三陰型乳腺癌[5]：ER陽性、PR陽性≥20%、HER-2陰性且Ki-67增殖指數(shù)<20%定義為L(zhǎng)uminal A型；Luminal B型分2種情況，一種為ER陽性、HER-2陰性、Ki-67增殖指數(shù)≥20%或PR表達(dá)<20%，另一種為ER陽性、HER-2陽性、PR及Ki-67增殖指數(shù)任何表達(dá)水平；ER及PR陰性、HER-2陽性定義為HER-2過表達(dá)型；ER、PR及HER-2均陰性定義為三陰型。

1.2 免疫組化兔抗人STAT3、ER、PR、HER-2和Ki-67單克隆抗體購自北京中杉金橋公司，二抗免疫組化試劑盒及DAB酶底物顯色劑等均購于福州邁新公司，免疫組化采用SP法，操作步驟按照說明書進(jìn)行。(1)所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，敷貼于10%多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上，60 ℃溫箱烤片2 h；二甲苯中浸泡5 min，重復(fù)1次；(2)將切片依次經(jīng)100%、95%、75%乙醇、蒸餾水中各浸泡3 min；(3)置于3%H2O2中室溫孵育10 min；(4)放入盛有檸檬酸鈉抗原修復(fù)液的高壓鍋中，高壓2～3 min，自然冷卻1 h，PBS洗滌3次；(5)滴加羊血清封閉30 min；(6)一抗按1 ∶100稀釋，室溫孵育2 h，PBS緩沖液洗滌3次；(7)滴加二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次；(8)DAB顯色2～3 min，清水沖洗終止反應(yīng)；(9)蘇木精復(fù)染1～2 min，鹽酸乙醇分化1～3 s；(10)75%、95%、100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明；(11)中性樹脂封固，鏡下觀察。

結(jié)果判定：STAT3蛋白陽性為細(xì)胞質(zhì)和胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，陽性染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色為0分，微弱染色為1分，染色清晰且細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色為2分，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核呈深棕色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤20%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)21%～50%為2分，陽性細(xì)胞數(shù)>50%為3分；將上述兩項(xiàng)評(píng)分相乘作為最終結(jié)果：0～2分為陰性，≥3分為陽性。

1.3 RT-PCR檢測(cè)(1)提取總RNA與合成cDNA：所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定和石蠟包埋后，6 μm厚切取樣本8片，使用總RNA提取試劑盒(美國(guó)QIAGEN公司)提取組織總RNA，用紫外分光法測(cè)取RNA純度，用qPCR-RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega生物公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。將500 ng總RNA加入20 μL反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃延伸，獲得cDNA后放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)RT-PCR檢測(cè)：采用Real-time PCR 法對(duì)STAT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。引物序列由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成，以GAPDH為內(nèi)參。STAT3上游引物：5′-CAGTGACCAGGC AGAAGA-3′，下游引物：5′-ACTCCATCGCTGACAA AA-3′；GAPDH上游引物：5′-TCGACCAGTCAGCCG CATCTTCTTT-3′，下游引物：5′-ACCAAATCCGTT GACTCCGACCTT-3′。PCR反應(yīng)體系：SYBR 10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，去離子水7.2 μL；在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 30 min預(yù)變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；繪制溶解曲線：95 ℃15 min，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。以GAPDH為內(nèi)參照計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式：ΔΔCt=(CT實(shí)驗(yàn)組的基因-CT實(shí)驗(yàn)組管家基因)-(CT對(duì)照組目的基因-CT對(duì)照組管家基因)。

1.4 預(yù)后隨訪截止時(shí)間2019年12月31日，通過電話方式對(duì)患者進(jìn)行調(diào)查，總生存時(shí)間為明確診斷至患者死亡或末次隨訪的時(shí)間，患者死于乳腺癌為終點(diǎn)事件，死于其他疾病、失訪或至隨訪結(jié)束時(shí)患者仍存活為截尾事件。

2 結(jié)果

2.1 維吾爾族乳腺癌組織與正常組織中STAT3的表達(dá)差異在乳腺癌組織中，STAT3蛋白陽性細(xì)胞較多，著色深，呈強(qiáng)陽性(圖1)；在正常乳腺組織中，STAT3蛋白呈弱陽性或陰性(圖2)。STAT3蛋白在維吾爾族乳腺癌組織和正常組織中的陽性率分別為77.5%(62/80)和56.7%(17/30)，乳腺癌組織中STAT3蛋白的陽性率明顯高于正常乳腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

圖1 STAT3蛋白在乳腺癌中呈強(qiáng)陽性，SP法 圖2 STAT3蛋白在正常乳腺組織中呈陰性，SP法

表1 乳腺癌和正常組織中STAT3蛋白的表達(dá)[n(%)]

STAT3 mRNA表達(dá)水平運(yùn)用相對(duì)定量法通過2-ΔΔCt計(jì)算，觀察溶解曲線及擴(kuò)增曲線圖(圖3)，了解擴(kuò)增情況。STAT3 mRNA在維吾爾族浸潤(rùn)性乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)量(7.015±5.853)明顯高于正常乳腺組織(4.324±2.258)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032，圖4)。

圖3 熒光定量擴(kuò)增曲線圖

圖4 乳腺癌和正常組織中STAT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.2 不同分子分型乳腺癌組織中STAT3蛋白的表達(dá)差異在維吾爾族乳腺癌中，STAT3蛋白在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)，HER-2過表達(dá)型乳腺癌中STAT3蛋白的陽性率高于其他分子分型(表2)。

表2 STAT3蛋白在不同分子分型乳腺癌組織中的表達(dá)[n(%)]

2.3 STAT3表達(dá)與維吾爾族乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系在維吾爾族乳腺癌中，STAT3蛋白表達(dá)與腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均顯著相關(guān)(P<0.05)，提示在腫瘤體積越大、組織學(xué)分級(jí)越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越高的乳腺癌組織中STAT3蛋白的陽性率越高(表3)。

表3 乳腺癌中STAT3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

在維吾爾族乳腺癌中，STAT3蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=5.164，P=0.023)；STAT3蛋白在Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌中的陽性率逐漸增高，其中在Ⅲ期乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于Ⅰ期乳腺癌(χ2=4.073，P=0.044)。同樣的，STAT3 mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的相對(duì)表達(dá)量(7.037±6.368)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(4.258±3.214)(P=0.019，圖5)；STAT3 mRNA在Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)量逐漸增高，其中在Ⅲ期乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)量(7.285±6.722)明顯高于Ⅰ期乳腺癌(3.975±2.040)(P=0.045，圖6)；而STAT3 mRNA在不同腫瘤直徑和組織學(xué)分級(jí)乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖5 STAT3 mRNA在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組中的相對(duì)表達(dá)量

圖6 STAT3 mRNA在Ⅰ、Ⅲ期乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)量

2.4 STAT3 mRNA表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系所有患者均接受手術(shù)治療，隨訪時(shí)間17～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間43個(gè)月，平均43.6個(gè)月，生存63例，死亡15例。根據(jù)乳腺癌中STAT3 mRNA表達(dá)量中位數(shù)將STAT3 mRNA分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，繪制維吾爾族乳腺癌患者術(shù)后5年STAT3高、低表達(dá)組的生存曲線，STAT3高表達(dá)組及低表達(dá)組患者術(shù)后的總生存率分別為73.477%(36/49)、93.10%(27/29)，STAT3高表達(dá)患者的中位生存期為48個(gè)月(95%CI：42.21～53.79)，STAT3低表達(dá)患者的中位生存期為54個(gè)月(95%CI：51.93～56.07)，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rank χ2=4.256，P=0.039，圖7)。

圖7 維吾爾族乳腺癌患者中STAT3 mRNA高表達(dá)及低表達(dá)組患者的5年生存曲線

3 討論

乳腺癌是一種多基因性疾病，遺傳基因易感性起著重要作用，其發(fā)病存在一定的種族和地域差異性[6]。新疆維吾爾族乳腺癌的發(fā)病率逐年增高，與漢族乳腺癌相比，具有發(fā)病年齡較早、分期較晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后較差等特點(diǎn)[7]，除飲食習(xí)慣、婚育情況等因素外，基因改變也是形成維吾爾族乳腺癌發(fā)病差異的重要因素。

Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)途徑是整合細(xì)胞因子、激素和生長(zhǎng)因子信號(hào)，以誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的核心癌癥途徑之一[8]。STAT3蛋白是JAK3/STAT通路激活的關(guān)鍵因素，是目前公認(rèn)的參與人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的最為重要的STAT家族成員。STAT蛋白家族是一組可以被多種細(xì)胞因子受體激活的相關(guān)蛋白，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6共7個(gè)成員[9]，其中以STAT3研究最多，是多種惡性腫瘤已知的癌基因[10]。STAT3的活化受其上游JAK的調(diào)控，活化的JAK可以通過募集胞質(zhì)中的單體STAT3分子，促進(jìn)STAT3的酪氨酸磷酸化，磷酸化的STAT3形成同源二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，并與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄[11]，STAT3持續(xù)激活可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化及凋亡，細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，該途徑在乳腺癌中尤為突出[12]。STAT3作為一種癌基因，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[13]。研究表明：STAT3在乳腺癌、肝癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)和異常激活狀態(tài)[14-15]。文獻(xiàn)報(bào)道STAT3過表達(dá)和激活參與了乳腺癌的進(jìn)展、增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥[16]。Sapio等[17]研究發(fā)現(xiàn)STAT3在乳腺癌組織中異常高表達(dá)，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。Li等[18]研究顯示STAT3在乳腺癌組織中的表達(dá)與活化增強(qiáng)、臨床分期和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

Sherona等[19]分析了710例乳腺腫瘤，發(fā)現(xiàn)STAT3在三陰型和HER-2過表達(dá)型乳腺癌中過表達(dá)，但在管腔型乳腺癌中無過表達(dá)。李玉柱等[20]研究顯示STAT3在HER-2過表達(dá)型和Luminal A型乳腺癌中表達(dá)較高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STAT3蛋白在不同分子分型維吾爾族乳腺癌組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，STAT3在HER-2過表達(dá)型和三陰型乳腺癌中表達(dá)較高，而在管腔型乳腺癌中表達(dá)較低，其中HER-2過表達(dá)型乳腺癌組織中STAT3的陽性率高于其他分子分型乳腺癌。本研究顯示：STAT3在不同分子分型維吾爾族乳腺癌中的陽性率與西方人群更接近，與漢族人群比較略有差異，提示HER-2過表達(dá)型維吾爾族乳腺癌的侵襲性較強(qiáng)。在維吾爾族乳腺癌中，STAT3蛋白和mRNA表達(dá)高于正常乳腺組織(P<0.05)；STAT3蛋白表達(dá)與腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P<0.05)，提示STAT3表達(dá)越高，乳腺癌增殖速度越快，侵襲性越強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，臨床分期越晚，預(yù)后越差；STAT3 mRNA在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和TNM分期乳腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而由于樣本量有限，本組STAT3 mRNA表達(dá)量在不同腫瘤直徑和組織學(xué)分級(jí)中未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。繪制維吾爾族乳腺癌患者術(shù)后5年生存曲線，術(shù)后前30個(gè)月STAT3 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)組乳腺癌患者的總生存率差別不明顯，可能與乳腺癌患者術(shù)后行放化療、靶向治療或內(nèi)分泌治療有關(guān)，尤其是早期手術(shù)患者的3年生存率較高；STAT3高表達(dá)乳腺癌患者的總生存率低于低表達(dá)組患者，可能與臨床分期較晚、不同分子分型和基因調(diào)控有關(guān)，STAT3可能參與調(diào)控維吾爾族非特殊類型浸潤(rùn)性乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，STAT3高表達(dá)可能是影響乳腺癌患者生存的預(yù)后因素。Khan等[21]研究顯示：在乳腺腫瘤模型中抑制STAT3活性可減緩腫瘤生長(zhǎng)，減少腫瘤相關(guān)炎癥。有研究發(fā)現(xiàn)靶向STAT3和mTOR的聯(lián)合治療可能是乳腺癌的最佳治療靶點(diǎn)[22]，STAT3可能成為一個(gè)有前景的人類腫瘤治療干預(yù)靶點(diǎn)。目前，一些針對(duì)STAT3的特異性小分子抑制劑已經(jīng)開發(fā)出來，尋找新的靶向STAT3激活藥物仍然是一個(gè)重要的臨床挑戰(zhàn)。

綜上所述，STAT3高表達(dá)可能影響維吾爾族乳腺癌患者的病變進(jìn)展、增殖和轉(zhuǎn)移，STAT3可能在維吾爾族乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)為研究乳腺癌的發(fā)生機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)，本課題組后續(xù)將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究STAT3在不同民族間的表達(dá)差異，STAT3在乳腺癌中的作用有待于進(jìn)一步探討。