發(fā)酵玉米-豆粕飼料對蛋雞小腸組織形態(tài)、消化酶活性和屏障功能相關(guān)基因表達的影響

劉瑩露 王雅敏 李景河 呂 靜 郭麗娟 閔育娜*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊陵712100；2.銅川市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，銅川629000)

玉米-豆粕型飼糧是蛋雞養(yǎng)殖中最常見的飼糧。目前，隨著我國蛋雞養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，飼料原料缺口進一步擴大，人畜爭糧局面愈發(fā)嚴(yán)重[1]。玉米、豆粕和麩皮等飼料原料中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，這使得營養(yǎng)物質(zhì)的利用率下降，并對蛋雞的機體健康造成負面影響[2]。如何提高飼料消化利用率，改善飼料營養(yǎng)品質(zhì)，是實現(xiàn)蛋雞高效養(yǎng)殖的關(guān)鍵所在。發(fā)酵飼料是指使用國家相關(guān)法規(guī)允許使用的飼料原料和微生物，通過人工控制發(fā)酵條件，利用微生物自身的代謝活動將蛋白質(zhì)、糖類和脂肪等大分子營養(yǎng)素降解為多肽、有機酸等小分子物質(zhì)，最終形成富含大量活菌和功能性代謝產(chǎn)物的生物飼料[3]。此外，微生物發(fā)酵是消除飼料原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的一種有效方法[4]。發(fā)酵飼料工藝分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵，其中固態(tài)發(fā)酵工藝的成本更低、污染更小[5]，所以目前對家禽發(fā)酵飼料的研究大部分集中在固態(tài)發(fā)酵飼料上。相較于普通飼料，發(fā)酵飼料的營養(yǎng)特性使其能夠促進畜禽生產(chǎn)性能和免疫力的提高[6-7]，因此在養(yǎng)殖過程中可作為一種抗生素、化學(xué)添加劑等藥物的替代品。Wu等[8]研究表明，飼喂發(fā)酵飼料能顯著提高肉雞的平均日采食量和平均日增重，且能顯著提高肉雞十二指腸的絨毛高度和絨隱比(絨毛高度/隱窩深度)。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加4%和6%發(fā)酵飼料能增加肉雞腸段長度，提高腸絨毛高度和降低隱窩深度。張孟陽等[10]使用蛋雛雞作為研究對象，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料顯著提高了雛雞盲腸中乳酸桿菌豐度，同時顯著降低了脫硫弧菌屬、螺桿菌等致病菌的豐度，優(yōu)化了腸道菌群結(jié)構(gòu)。張俊[11]使用發(fā)酵飼料和滅菌發(fā)酵飼料作為試驗材料，研究益生菌和發(fā)酵代謝產(chǎn)物對肉雞腸道健康的影響，結(jié)果表明2個試驗組肉雞回腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量均顯著提高，腸道免疫屏障得以增強。這些都說明發(fā)酵過程中產(chǎn)生的益生菌和代謝產(chǎn)物對腸道健康都有積極作用。目前，我國養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)酵飼料的研發(fā)應(yīng)及應(yīng)用尚處于起步階段，且關(guān)于益生菌發(fā)酵飼料調(diào)節(jié)家禽腸道健康的研究大部分集中在肉雞上，而在產(chǎn)蛋雞上的研究較少。因此，本試驗采用固態(tài)發(fā)酵工藝，通過對發(fā)酵前后飼料菌群結(jié)構(gòu)的檢測，并結(jié)合蛋雞飼養(yǎng)試驗，研究不同添加水平的發(fā)酵飼料對蛋雞小腸組織形態(tài)、消化酶活性和屏障功能相關(guān)基因表達的影響，為發(fā)酵飼料在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選取360只健康、體況和產(chǎn)蛋性能基本一致的22周齡京粉6號蛋雞，隨機分為4個組，每組用不同比例的發(fā)酵飼料替代基礎(chǔ)飼糧中的未發(fā)酵飼料原料，替代水平分別為0(對照組)、4%、6%和8%，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)15只雞。試驗期29周，其中預(yù)試期4周，正試期25周。飼養(yǎng)試驗在陜西省銅川區(qū)春滿園蛋雞無抗養(yǎng)殖示范場進行。雞舍條件為：4層階梯式A字型雞籠，每3只雞飼養(yǎng)于同一籠內(nèi)。將相同組、不同重復(fù)的雞分散排列于雞舍的不同空間。雞舍通風(fēng)良好，溫度控制在15～22 ℃，相對濕度控制在30%。保證雞群自由采食、飲水，每日刮糞板清糞，光照時長為16 h。每日08:00、11:00和16:00進行人工喂料，隨時檢查雞群健康情況，及時挑出死淘雞只并做好記錄。常規(guī)免疫、消毒。

1.2 飼糧制備

1.2.1 發(fā)酵工藝

發(fā)酵所用菌粉購自山東某生物科技有限公司，其中含有2×109CFU/g芽孢桿菌、3×109CFU/g乳酸菌和5×108CFU/g酵母。在進行發(fā)酵飼料前按說明書要求，將復(fù)合益生菌菌粉以1∶40(質(zhì)量體積比)的比例溶于37 ℃溫水中，攪拌均勻，即得稀釋混合菌液。發(fā)酵流程參考Shi等[12]，根據(jù)試驗雞場內(nèi)實際情況做適當(dāng)調(diào)整。將稀釋混合菌液加入到發(fā)酵底料(玉米60%、豆粕20%和麩皮20%)中充分混勻，調(diào)節(jié)飼料水分含量為30%。發(fā)酵罐中37 ℃好氧發(fā)酵24 h，然后將飼料轉(zhuǎn)移到自封袋中，室溫厭氧發(fā)酵5 d即可。另將37 ℃溫水以30%比例加入發(fā)酵底料，充分混勻后厭氧放置5 d，作為對照。

1.2.2 飼糧配制

發(fā)酵飼料每周制備1次，每周統(tǒng)計蛋雞采食量，以便對發(fā)酵飼料制備量進行調(diào)整。發(fā)酵前后飼料營養(yǎng)物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化見表1。參照NRC(1994)蛋雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合試驗雞場內(nèi)蛋雞養(yǎng)殖實際情況設(shè)計玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 發(fā)酵前后飼料營養(yǎng)物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化(風(fēng)干基礎(chǔ))

表2 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 發(fā)酵前后飼料菌群結(jié)構(gòu)

將發(fā)酵前后的飼料樣品各取3份，每份樣品50 g。將5 g左右樣品放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。將凍存的飼料樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司，采用16S rRNA高通量測序完成飼料菌群結(jié)構(gòu)的測定。

1.3.2 小腸組織形態(tài)

試驗結(jié)束時，從每個重復(fù)中隨機選取1只健康的蛋雞，每個組共6只雞，處死后打開腹腔，用鑷子將腸道小心取出，剪取小腸各段的中部2～3 cm，用裝有0.9%生理鹽水的注射器將腸道食糜輕輕沖凈，沖凈后的腸段置于含4%多聚甲醛溶液的10 mL離心管中固定過夜。將固定好的腸段經(jīng)脫水、透明、切片、展片、蘇木精-伊紅(HE)染色和封片等程序后，在光學(xué)顯微鏡下觀察。每個切片在不同視野里選取10根完整的絨毛和隱窩，分別測量各腸段絨毛高度和隱窩深度，并計算絨隱比。

1.3.3 小腸食糜消化酶活性

分別在35周齡和試驗結(jié)束(50周齡)時，從每個重復(fù)中隨機選取1只健康的蛋雞，處死后取出腸道，將十二指腸、空腸和回腸前段的食糜擠到做好標(biāo)記的凍存管中，液氮速凍。取10 mg食糜樣本加100 μL生理鹽水勻漿，2 500 r/min離心10 min取上清液，使用試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司)并參照說明書進行胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性測定。

1.3.4 小腸黏膜屏障功能相關(guān)基因mRNA相對表達量

試驗結(jié)束時，從每個重復(fù)中隨機選取1只健康的蛋雞，屠宰后取空腸前段2～3 cm，用無菌剪將腸段縱向剖開后，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗掉腸黏膜上附著的腸道內(nèi)容物，將載玻片輕輕刮取干凈的黏膜迅速裝入凍存管，液氮速凍。采用Trizol法提取小腸黏膜總RNA，分別用瓊脂糖凝膠電泳和微型分光光度計檢測所提取的RNA質(zhì)量和濃度，檢測合格后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行Real-Time PCR反應(yīng)，檢測閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden protein-1，ZO-1)、黏蛋白2(mucin 2，MUC2)和閉合蛋白(occludin，OCLN)的mRNA相對表達量。PCR引物序列見表3。

表3 PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

發(fā)酵前后飼料菌群結(jié)構(gòu)試驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，運用t檢驗法進行差異顯著性分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，0.05

飼養(yǎng)試驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件one-way ANOVA模塊進行方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前后飼料菌群結(jié)構(gòu)變化

2.1.1 發(fā)酵前后飼料菌群α多樣性分析

通過對發(fā)酵前后飼料進行16s rRNA高通量測序，共得到370 942條高質(zhì)量序列，平均每個樣本的序列數(shù)為61 824條。由表4可知，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后飼料菌群的Shannon、Simpson、Chao1和ACE指數(shù)均出現(xiàn)了不同程度的下降，其中Shannon和Simpson指數(shù)的降低達到顯著水平(P<0.05)，這說明復(fù)合益生菌發(fā)酵降低了飼料菌群的豐富度和多樣性。

表4 發(fā)酵前后飼料菌群α多樣性分析

2.1.2 發(fā)酵前后飼料菌群在門水平上的分布

發(fā)酵前后飼料菌群在門水平上的分布如圖1所示，以相對豐度≥0.05%為閾值，在發(fā)酵前飼料中共檢測出6個門，其中的優(yōu)勢菌門為藍藻菌門(Cyanobacteria)，相對豐度為91.92%，存在少量的變形菌門(Proteobacteria，相對豐度為5.23%)和厚壁菌門(Firmicutes，相對豐度為2.22%)。然而，在發(fā)酵后飼料中只檢測出了4個門，厚壁菌門的相對豐度提高至82.56%(P<0.05)，演變?yōu)閮?yōu)勢菌門；藍藻菌門的相對豐度降至16.86%(P<0.05)，其他各門水平細菌的相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

Others：其他；Euryarchaeota：廣古菌門；Chloroflexi：綠彎菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Unidentified_Bacteria：未鑒別的細菌；Actinobacteria：放線菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Cyanobacteria：藍藻菌門。

2.1.3 發(fā)酵前后飼料菌群在屬水平上的分布

發(fā)酵前后飼料菌群在屬水平上的分布如圖2所示，在發(fā)酵前飼料中的第一優(yōu)勢菌屬是未鑒別的藍藻細菌(unidentified_Cyanobacteria)，其相對豐度高達91.92%；其次為泛生菌屬(Pantoea)，相對豐度為4.67%。益生菌發(fā)酵使飼料菌群在屬水平上的分布發(fā)生了明顯的改變，魏斯氏菌屬(Weissella)成為了第一優(yōu)勢菌屬，相對豐度提高至80.93%(P<0.05)；未鑒別的藍藻細菌為第二優(yōu)勢菌屬，但其相對豐度相比發(fā)酵前降低了75.06%(P<0.05)；此外，發(fā)酵后飼料中泛生菌屬的相對豐度降低至0.13%(P>0.05)。

Others：其他；Lactobacillus：乳桿菌屬；Unidentified_Erysipelotrichaceae：未鑒別的丹毒絲菌科；Klebsiella：克雷白氏桿菌屬；Pediococcus：片球菌屬；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；Blautia：布勞特氏菌屬；Enterococcus：腸球菌屬；Pantoea：泛生菌屬；Weissella：魏斯氏菌屬；Unidentified_Cyanobacteria：未鑒別的藍藻細菌；Anaerosporobacter：厭氧孢桿菌屬；Xanthomonas：黃單胞菌屬；Methylobacterium：甲基桿菌屬；Acidovorax：食酸菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Peptoniphilus：嗜胨菌屬；Massilia：馬賽菌屬；Unidentified_Rickettsiales：未鑒別的立克次氏體目；Streptomyces：鏈霉菌屬；Unidentified_Ruminococcaceae：未鑒別的瘤胃球菌科；Unidentified_Rhizobiaceae：未鑒別的根瘤菌科；Faecalibacterium：糞桿菌屬；Lactococcus：乳酸球菌屬；Curtobacterium：短小桿菌屬；Serratia：沙雷氏菌屬；Unidentified_Clostridiales：未鑒別的梭菌目；Sphingobacterium：鞘氨醇桿菌屬；Stenotrophomonas：寡養(yǎng)單胞菌屬；Bacillus：芽孢桿菌屬；Ochrobactrum：蒼白桿菌屬；Acinetobacter：不動桿菌屬；Terrisporobacter：土孢桿菌屬；Fusobacterium：梭桿菌屬。

2.2 發(fā)酵飼料對蛋雞小腸組織形態(tài)的影響

發(fā)酵飼料對蛋雞小腸組織形態(tài)的影響見表5。與對照組相比，6%和8%發(fā)酵飼料添加組蛋雞十二指腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著提高(P<0.05)；各發(fā)酵飼料添加組空腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著提高(P<0.05)，其中以6%發(fā)酵飼料添加組效果最優(yōu)；各發(fā)酵飼料添加組回腸絨毛高度、隱窩深度和絨隱比均無顯著差異(P>0.05)。

表5 發(fā)酵飼料對蛋雞小腸組織形態(tài)的影響

續(xù)表5項目 Items發(fā)酵飼料添加水平Fermented feed supplemental levels/%0468SEMP值 P-value空腸 Jejunum絨毛高度 VH/μm1 487.501 510.681 446.531 457.8618.200.601隱窩深度 CD/μm226.38a204.05b162.70c189.33b4.14<0.001絨隱比 VH/CD6.78c7.87b9.18a8.23ab0.19<0.001回腸 Ileum絨毛高度 VH/μm939.15913.91918.08937.1510.450.774隱窩深度 CD/μm138.17130.86133.93138.701.700.318絨隱比 VH/CD6.947.086.967.100.110.942

2.3 發(fā)酵飼料對蛋雞小腸食糜消化酶活性的影響

發(fā)酵飼料對蛋雞35和50周齡小腸食糜消化酶活性的影響分別見表6和表7。35周齡時，與對照組相比，飼糧中添加發(fā)酵飼料可以顯著提高蛋雞十二指腸食糜中淀粉酶以及空腸食糜中胰蛋白酶和脂肪酶活性(P<0.05)，且3個添加組間差異不顯著(P>0.05)；6%和8%發(fā)酵飼料添加組十二指腸脂肪酶活性顯著高于對照組和4%發(fā)酵飼料添加組(P<0.05)。50周齡時，與對照組相比，飼糧中添加發(fā)酵飼料對3個腸段食糜中胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均無顯著影響(P>0.05)。

表6 發(fā)酵飼料對35周齡蛋雞小腸食糜消化酶活性的影響

2.4 發(fā)酵飼料對蛋雞空腸黏膜屏障功能相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

發(fā)酵飼料對蛋雞空腸黏膜屏障功能相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響如圖3所示。與對照組相比，8%發(fā)酵飼料添加組蛋雞空腸黏膜MUC2 mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)；6%和8%發(fā)酵飼料添加組空腸ZO-1 mRNA相對表達量有提高趨勢，但差異未達到統(tǒng)計學(xué)顯著水平(0.050.05)。

3 討 論

3.1 發(fā)酵前后飼料菌群結(jié)構(gòu)變化

本試驗采用16s rRNA高通量測序技術(shù)，研究發(fā)酵前后飼料菌群多樣性和結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，經(jīng)過復(fù)合益生菌發(fā)酵5 d后，飼料菌群的豐富度和多樣性與發(fā)酵前相比顯著降低。這主要是因為第2階段的厭氧發(fā)酵和低pH環(huán)境抑制了許多微生物的生長。通過對菌群在門水平上的分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后飼料中的優(yōu)勢菌門由發(fā)酵前的藍藻菌門演變?yōu)楹癖诰T。厚壁菌門屬于革蘭氏陽性菌，包括支原體、產(chǎn)芽孢和非產(chǎn)芽孢菌群，且很多厚壁菌門的細菌都對纖維素、蛋白質(zhì)和淀粉等大分子化合物具有良好的降解作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后飼料中厚壁菌門細菌的相對豐度顯著上升[14]，與本試驗結(jié)果一致。從屬水平上分析菌群可見，魏斯氏菌屬的相對豐度在發(fā)酵后大幅度升高，成為優(yōu)勢菌屬。王格等[15]研究也得到了類似的結(jié)果。魏斯氏菌屬于乳酸菌，可表達β-葡糖苷酶，從而促進纖維素的降解[16]。此外，在未發(fā)酵飼料中檢測到大量未鑒別的藍藻細菌，且在發(fā)酵后也是飼料中的第二優(yōu)勢菌群，這可能是因為用于加入到發(fā)酵底物中的水未經(jīng)消毒滅菌。大腸桿菌(Escherichia)和沙門氏菌(Salmonella)等致病菌在本試驗的發(fā)酵后飼料中沒有檢測出，表明該發(fā)酵飼料安全無毒，可用于畜禽養(yǎng)殖。

3.2 發(fā)酵飼料對蛋雞小腸組織形態(tài)的影響

蛋雞小腸絨毛高度、隱窩深度和絨隱比是評價消化吸收功能的重要指標(biāo)[17]。小腸絨毛與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)運有關(guān)，其中絨毛高度越高，說明腸黏膜表面積越大，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[18]；隱窩深度從一定程度上反映腸黏膜上皮細胞的生成速率；絨隱比則與腸上皮細胞的新陳代謝有關(guān)。小腸絨毛縮短和隱窩加深可能會影響?zhàn)B分吸收，使動物生產(chǎn)性能下降[19]。Missotten等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂發(fā)酵飼料的肉雞腸道絨毛高度和絨隱比顯著提高，隱窩深度顯著降低。Xie等[21]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂發(fā)酵飼料能顯著改善雪峰烏骨雞的空腸黏膜形態(tài)。Li等[22]在飼喂發(fā)酵豆粕的肉雞十二指腸和空腸中也得到了類似的結(jié)果。本試驗結(jié)果表明，飼喂發(fā)酵飼料對蛋雞十二指腸和空腸形態(tài)有顯著改善作用，與前人研究結(jié)果一致。發(fā)酵飼料對腸道形態(tài)的改善作用可能歸因于其對腸道菌群平衡的調(diào)節(jié)和微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，包括有機酸、氨基酸和小肽等，從而誘導(dǎo)腸細胞分化和增殖[23-24]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，豆粕中的胰蛋白酶抑制劑含量與小腸絨毛高度之間存在負相關(guān)[25]，結(jié)合發(fā)酵前后飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化，推測發(fā)酵飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的減少也是腸道形態(tài)改善的原因之一。

3.3 發(fā)酵飼料對蛋雞小腸食糜消化酶活性的影響

消化酶是飼料消化吸收的主要媒介，其中胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶作為三大營養(yǎng)物質(zhì)的對應(yīng)消化酶，其活性與機體對養(yǎng)分的消化利用率密切相關(guān)。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料能顯著提高蛋雞35周齡十二指腸和空腸的消化酶活性，而對試驗后期(50周齡)各腸段的消化酶活性無顯著影響。林麗花等[26]使用發(fā)酵豆粕飼喂黃羽肉雞發(fā)現(xiàn)，十二指腸中的2種消化酶活性較對照組顯著提高[26]；阮棟等[27]使用添加4%發(fā)酵混合飼料的飼糧飼喂蛋鴨，觀察到空腸脂肪酶和糜蛋白酶活性顯著提高，這都與本試驗部分結(jié)果基本一致。結(jié)合小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)部分相關(guān)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料對小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和消化酶活性的影響主要集中于十二指腸和空腸。Hu等[28]研究表明，小腸絨毛高度的提高能增強消化酶活性，因此本試驗中，發(fā)酵飼料對消化酶活性的提升或許與小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的改善有關(guān)。此外，發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的外源酶可以補充內(nèi)源酶的分泌[29]，這也同時增強了腸道消化酶活性。有研究報道，在飼糧中添加益生菌能顯著提高蛋雞小腸黏膜消化酶活性[30]，可見發(fā)酵后飼料中益生菌數(shù)量的提高也是消化酶活性增強的原因之一。而發(fā)酵前飼料中所含的大量胰蛋白酶抑制劑也會影響消化道胰蛋白酶活性，這進一步擴大了對照組與發(fā)酵飼料添加組之間的差異。本研究團隊同時進行了發(fā)酵飼料對蛋雞生產(chǎn)性能影響的研究，結(jié)果表明，飼糧添加6%發(fā)酵飼料能夠顯著提高蛋雞的產(chǎn)蛋率和平均蛋重[31]。綜上所述，發(fā)酵飼料可通過改善腸道形態(tài)，增強消化酶的活性，從而促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，達到提高蛋雞生產(chǎn)性能的目的。

3.4 發(fā)酵飼料對蛋雞小腸黏膜屏障功能相關(guān)基因表達的影響

OCLN和ZO-1是形成腸道細胞外屏障的特有蛋白質(zhì)[31]，這種屏障被稱為緊密連接，它構(gòu)成了抵御腸道中病原體入侵的物理屏障，緊密連接蛋白的相對表達量可用于評價腸道通透性[32-33]；MUC2是腸道黏膜主要的黏蛋白，其能為宿主細菌提供營養(yǎng)和附著位點，并有助于特定腸道菌群的物種選擇[34]。本試驗中，飼糧添加8%發(fā)酵飼料對蛋雞空腸黏膜MUC2 mRNA相對表達量有顯著上調(diào)作用，而對空腸ZO-1和OCLNmRNA相對表達量未見顯著影響，表明發(fā)酵飼料對腸道屏障功能的改善主要側(cè)重于上調(diào)MUC2的表達。目前關(guān)于發(fā)酵飼料對蛋雞腸道屏障功能相關(guān)基因表達的研究較少。張俊[11]使用益生菌發(fā)酵飼料及其滅菌飼料飼喂肉雞，結(jié)果表明，二者都能上調(diào)肉雞回腸緊密連接蛋白的基因表達量，說明發(fā)酵過程中產(chǎn)生的微生物及其代謝產(chǎn)物對腸道屏障的改善也具有重要作用。發(fā)酵產(chǎn)物包括益生菌[35]和有機酸[36]等已被證實可顯著提高家禽腸道屏障功能相關(guān)基因表達量，但其作用機制有待深入研究。

4 結(jié) 論

① 發(fā)酵后飼料中的菌群多樣性和豐富度下降，絕對優(yōu)勢菌群發(fā)生改變。

② 使用發(fā)酵玉米-豆粕飼料飼喂蛋雞，能夠改善蛋雞的十二指腸和空腸組織形態(tài)，提高小腸消化酶活性，上調(diào)空腸MUC2基因表達，增強蛋雞腸道健康。

③ 綜合分析，建議蛋雞養(yǎng)殖中發(fā)酵玉米-豆粕飼料的添加水平為6%。