多肽添加水平對刺參生長性能、免疫及腸道功能基因表達的影響

李 曉 王 穎* 姜曉東 李紅艷 紀 蕾 劉天紅 孫元芹 劉洪軍

(1.山東省海洋科學(xué)研究院，青島266104；2.青島市水產(chǎn)生物品質(zhì)評價與利用工程研究中心，青島266104；3.山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，青島266104)

刺參(Apostichopusjaponicus)是典型的溫帶物種[1]，屬于棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱(Holothuroidea)、仿刺參屬(Apostichopus)。刺參因其自身的營養(yǎng)價值、保健功能和藥用功效，市場需求量不斷增加，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，近年來已成為我國單種水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)值最高的經(jīng)濟品種之一[2]。規(guī)?；B(yǎng)殖一般采用配合飼料投喂刺參[3]。蛋白質(zhì)作為刺參配合飼料的重要成分，能顯著提高刺參的特定生長率(SGR)[4]，直接影響刺參的生長性能和飼料成本。目前，刺參飼料的蛋白質(zhì)來源以魚粉為主。多肽作為蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物，由2個及以上氨基酸分子(通常10～100個)脫水縮合而成，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)原料，已被證實能促進歐洲鱸魚[5]、凡納濱對蝦[6]、大菱鲆[7]等水生動物的生長，同時還可提高凡納濱對蝦等的非特異性免疫和抗病能力[6]，但添加到刺參飼料中的報道較少。

前期研究通過營養(yǎng)和免疫水平上證實了多肽能有效提高刺參的特定生長率，增強自身的非特異性免疫[8]，但關(guān)于多肽激發(fā)機體生長及影響免疫系統(tǒng)的機制尚不清楚。近年來，分子生物學(xué)手段快速發(fā)展，使得其成為探究多肽對刺參生長和免疫機理影響的一種有效途徑。目前已對刺參的生長性狀進行了數(shù)量性狀位點(QTL)分析，定位了與體長、體寬、體質(zhì)量、體壁質(zhì)量和出肉率等相關(guān)的21個QTL[9]；構(gòu)建了刺參再生時腸道和體壁的大規(guī)?；虮磉_譜[10]；利用刺參遺傳圖譜，分析了刺參夏眠發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組[11]。尤其是分析了不同月齡刺參的組織中腱生蛋白、膠原蛋白α2、整合素αV和整合素βL基因的分布及表達量[2]，克隆了刺參核因子-κB(NF-κB)信號通路的3個基因:p105、p50、rel[12]，還對比了不同添加物對刺參腸道免疫基因p105、p50、rel和lysmRNA表達的影響[13]。

腸道作為刺參體腔內(nèi)最主要的器官，占據(jù)了體腔絕大部分空間。刺參一般以海洋沉積物中的有機物作為營養(yǎng)物質(zhì)，腸道是其內(nèi)外環(huán)境物質(zhì)交換的渠道，用于消化食物和吸收營養(yǎng)，另外還可保護刺參免遭病原入侵[14]，備受免疫學(xué)研究關(guān)注[15-16]。Dalmo等[17]研究認為飼料中添加免疫增強劑能夠提高腸道免疫反應(yīng)，提升水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的抗病力，進而保護水產(chǎn)動物免受致病原的入侵。但是有關(guān)刺參腸道免疫調(diào)控的規(guī)律及其原理仍處于未知。鑒于此，本研究探討了多肽對刺參腸道中生長類基因——腱生蛋白、膠原蛋白α2、整合素αV和整合素βL，以及細胞免疫基因——p105、p50、rel和體液免疫基因——lys相對表達量的影響，旨在探索多肽對刺參生長性能的影響以及其免疫調(diào)控的規(guī)律，進而為刺參養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支持和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用刺參[體重為(35.40±1.58) g]購自青島昊睿源水產(chǎn)苗種養(yǎng)殖有限公司；鳀魚購自威海恒欣源水產(chǎn)有限公司；堿性蛋白酶購自南寧龐博生物工程有限公司；馬尾藻采自山東榮成俚島潮間帶(2020年6月)，烘干，粉碎，過80目篩備用；海泥采自即墨鰲山衛(wèi)。

多肽制備方法：鳀魚清洗切塊，0.6 mol/L NaHCO3脫脂10 h后，堿性蛋白酶1.5%(w/v)(料液比1∶10)，保持pH 8.0，在50 ℃酶解6 h。酶解結(jié)束后，100 ℃滅酶15 min，冷卻后調(diào)節(jié)pH至中性，8 000 r/min離心15 min，濃縮上清液，經(jīng)噴霧干燥后，制得小分子質(zhì)量多肽的混合物，即為本試驗用多肽。多肽的有效含量為70%，平均分子質(zhì)量為424 u，其中>3 000 u占比0.19%，3 000～2 000 u占比0.81%，2 000～1 000 u占比6.45%，1 000～500 u占比21.24%，500～180 u占比50.74%，<180 u占比20.58%。表1為制備多肽中含量較高的前10條肽段。

表1 多肽的主要肽段序列

1.2 試驗設(shè)計

挑選300頭刺參在暫養(yǎng)池中馴化7 d以適應(yīng)環(huán)境，之后將其隨機分為5組(分別為D1、D2、D3、D4、D5組)，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20頭。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表2。各原料按照配比混勻后，添加3倍質(zhì)量的海泥，加入20%的水，加工制成顆粒飼料(直徑0.4 mm，長10 mm),烘干備用。試驗周期60 d。

表2 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

整個試驗在室內(nèi)自然光照條件下進行，期間保持充氧，養(yǎng)殖水體160 L，水溫保持在(15.0±0.5) ℃，鹽度28～30, pH 7.8～8.2。于每天的09:00投餌1次，投餌量為刺參體重的2%～3%，每10 d調(diào)整1次投餌量。每日投餌20 h后，采用虹吸法將糞便和殘餌吸出備用，同時更換養(yǎng)殖用水，換水量為養(yǎng)殖水體的1/3。每10 d全部更換養(yǎng)殖用水，并徹底清洗水箱，以保證水質(zhì)清潔。收集得到的殘餌和糞便于60 ℃烘干保存。

1.4 樣品采集及指標測定

1.4.1 生長性能指標

暫養(yǎng)結(jié)束后，正式試驗開始前，隨機抽取10頭刺參，作為初始樣品；養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，刺參饑餓48 h，隨機從各水箱內(nèi)抽取10頭刺參，作為終末樣品。

濕重測定：稱重時用撈網(wǎng)瀝凈刺參水分，之后將刺參放置在干濾紙上30 s后，稱重。為減小操作誤差，測定過程均由固定人員操作。

干重測定：將已測定濕重的刺參65 ℃下烘干8 h后，稱重。

刺參的SGR、攝食率(FR)計算公式[18]如下：

SGR(%/d)=[(ln終末干重-
ln初始干重)/投喂時間]×100；
FR(%)=餌料干重/[投喂時間×
(終末干重+初始干重)/2]。

1.4.2 免疫指標及抗氧化指標

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，將每個重復(fù)的6只刺參轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿中。在刺參腹部做1 cm的切口，采用無菌注射器從切口處收集體腔液，并將每組的體液樣品徹底混合。4 ℃、2 000×g離心30 min，取上清液-80 ℃下儲存，用于檢測刺參的免疫及抗氧化指標[19]。

選取酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)4個指標，利用酶活性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)進行測定，測定方法參照試劑盒說明書。

1.4.3 基因相對表達量

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，從每個水箱中分別隨機抽取5頭刺參，解剖，將同一組刺參的中腸組織混合作為1個樣品，液氮速凍，-80 ℃保存采用RNA isoPlus(TaKaRa)提取刺參中腸腸道組織的總RNA，總RNA的完整性和純度用凝膠電泳檢測。按照PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)操作說明合成cDNA第一鏈。

采用SYBR Green方法利用熒光定量PCR儀對生長基因(腱生蛋白、膠原蛋白α2、整合素αV、整合素βL)及免疫基因(p105、p50、rel、lys)的相對表達量進行檢測，內(nèi)參基因分別為細胞色素B和β-肌動蛋白(β-actin)，基因引物序列見表3。定量PCR的體系包括：上、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，第一鏈cDNA 1 μL，2×SYBR Premix Ex TaqⅡ 5 μL和經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的超純水(DEPC水)3 μL。采用95 ℃持續(xù)30 s 1個循環(huán)；95 ℃持續(xù)5 s，退火溫度60 ℃持續(xù)30 s(40個循環(huán))，60～95 ℃持續(xù)10 min。繪制熔解曲線用于檢驗每個PCR反應(yīng)只有1個PCR產(chǎn)物，結(jié)果采用2-ΔΔCt法，計算目的基因相對表達量。

表3 內(nèi)參和目的基因引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重檢驗法(Duncan氏)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)最終表示為平均值±標準誤。

2 結(jié) 果

2.1 多肽添加水平對刺參生長性能的影響

由表4可知，刺參的SGR隨著多肽添加水平的增加在不同組間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，D4組的刺參SGR顯著高于其他組(P<0.05)。D4組的刺參終末濕重最高，但與D3組和D5組的結(jié)果差異不顯著(P>0.05)。D4組的刺參終末干重最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。刺參的FR組間差異不顯著(P>0.05)。

表4 多肽添加水平對刺參生長性能的影響

2.2 多肽添加水平對刺參免疫及抗氧化指標的影響

由表5可知，刺參體內(nèi)T-AOC及SOD、ACP、AKP活性隨著多肽添加水平的增加而升高。ACP和AKP活性最高出現(xiàn)在D5組，且D2、D3、D4和D5組中的酶活性顯著高于D1組(P<0.05)。SOD活性、T-AOC最高出現(xiàn)在D5組，D2與D1組間差異不顯著(P>0.05)。

表5 多肽添加水平對刺參免疫及抗氧化指標的影響

2.3 多肽添加水平對刺參腸道生長相關(guān)基因表達的影響

由圖1可知，4種基因在刺參腸道組織的表達呈現(xiàn)整體上調(diào)的趨勢，基本都是在D4組時達到表達高峰，隨后降低。在D3、D4、D5組腱生膠原蛋白基因相對表達量均顯著高于D1組(P<0.05)，分別提高了9.21%、16.88%、11.40%(圖1-A)；膠原蛋白α2基因相對表達量在D2、D3、D4、D5組均顯著高于D1組(P<0.05)，分別提高了2.76%、10.21%、19.16%、5.66%(圖1-B)；D3、D4、D5組整合素αV基因相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05)，分別提高了15.32%、17.65%和14.51%(圖1-C)；D3、D4、D5組整合素βL基因相對表達量均顯著高于D1組(P<0.05)，分別提高了15.42%、16.71%和4.44%(圖1-D)。

相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，相鄰字母表示差異顯著(P<0.05)，相間字母表示差異極其顯著(P<0.01)。下同圖。

2.4 多肽添加水平對刺參腸道免疫相關(guān)基因表達的影響

由圖2可知，刺參腸道組織內(nèi)p105基因表達水平呈現(xiàn)升高趨勢，D2、D3、D4、D5組均顯著高于對照組(P<0.05)，分別提高了2.14%、5.22%、5.99%、8.98%，D3和D4組差異不顯著(P>0.05)(圖2-B)；p50基因相對表達量呈現(xiàn)升高趨勢，D4、D5組均顯著高于D1組(P<0.05)，分別提高了2.68%和6.34%，D1、D2和D3組差異不顯著(P>0.05)(圖2-C)；lys基因表相對表達量呈現(xiàn)升高趨勢，D2、D3、D4、D5組均顯著高于D1組(P<0.05)，分別提高了8.09%、12.82%、13.71%和4.44%，D3、D4和D5組間差異不顯著(P>0.05)(圖2-D)。

圖2 多肽添加水平對刺參腸道免疫相關(guān)基因表達的影響

3 討 論

3.1 多肽片段的特征分析

試驗制備得到的多肽有效含量為70%，平均分子質(zhì)量為424 u。多肽中含量較高的前10條肽段中，賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)及亮氨酸(Leu)在肽段序列末端重復(fù)出現(xiàn)。這與Li等[20]的研究結(jié)果相似，Li等[20]發(fā)現(xiàn)在鱈魚來源的多肽片段中，Lys重復(fù)出現(xiàn)在肽段序列末端，同時，對大鼠腸黏膜具有免疫功能的多肽序列幾乎都含有疏水性氨基酸，且大部分都作為肽鏈的N端出現(xiàn)。這與Tzehoval等[21]研究一致，具有高免疫活性多肽的N-末端均為疏水性氨基酸。本研究制備的多肽對促進刺參生長及免疫有一定的功效，可能也與其肽段組成及序列有關(guān)。多肽的分子質(zhì)量分布能影響歐洲黑鱸(Dicentrarchuslabrax)[22]及海鯛(Sparusaurata)[23]等的生長性能和品質(zhì)，飼料中的多肽被進一步水解成游離氨基酸吸收，或者以完整形式被直接吸收，低分子質(zhì)量的多肽更有利于這些魚類的生長。

3.2 多肽對刺參生長性能的影響

盡管目前已有海洋多肽對水生動物的生長、發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等有促進作用的報道[5-7,23]，但多肽應(yīng)用于刺參養(yǎng)殖的研究較少。本研究試驗期間沒有刺參死亡，各組刺參的體重均出現(xiàn)顯著增長，表明試驗飼料有利于刺參的存活與生長。適量的多肽有效地提高了刺參的特定生長率，而超過適宜添加量后，刺參的SGR會呈現(xiàn)下降趨勢。這與很多其他必需營養(yǎng)元素類似，如蛋白質(zhì)[24]和碳水化合物[19]。多肽的吸收一般有2種途徑：有些多肽無需降解，可被直接吸收；有些則需要被胰蛋白酶和腸肽酶水解后才能被吸收。被吸收的多肽進入腸黏膜運輸后，可直接參與生理活動、代謝調(diào)節(jié)，并促進生長[25]。體質(zhì)量在24.51 g左右的刺參在投喂不同水平多肽后，各組間FR存在顯著差異[8]，本研究采用的刺參初始體質(zhì)量在35.40 g左右，雖然適當(dāng)添加多肽能一定程度上降低刺參的FR，但是各組間FR差異不顯著, 可能與兩者所采用的刺參個體大小不同有關(guān)。本研究表明，飼料中添加適當(dāng)?shù)亩嚯?10%～15%)能有效提高刺參的生長性能，一定程度上降低刺參的FR。

3.3 多肽對刺參免疫及抗氧化指標的影響

體腔液中T-AOC及SOD、ACP和AKP活性隨著多肽添加水平的增加呈升高趨勢，表明酶解得到的低分子質(zhì)量多肽混合物，對部分活性氧自由基具有強力的清除作用，有利于提高刺參的抗氧化能力，同時還能增強刺參的非特異性免疫。由于刺參只具有非特異性免疫，因此體液在細胞免疫和體液免疫中具有關(guān)鍵作用[26]。體液中的這些免疫及抗氧化指標(SOD、ACP和AKP等)在刺參體液免疫中具有不可替代的作用。SOD是生物體清除活性氧、免受細胞氧化傷害的主要抗氧化酶類，在防御機體衰老和生物分子損傷等方面有著極為重要的作用[19]。ACP和AKP可以殺死侵襲性病原體，改變致病性分子表面以加速其吞噬和降解[27]。兩者在刺參抗病、免疫反應(yīng)、細胞損傷和修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用[28]。李日美等[6]發(fā)現(xiàn)在凡納濱對蝦幼體中添加10～20 g/kg的小肽可提高其生長速度，并提高其非特異性免疫和抗病能力。Wang等[26]采用注射法發(fā)現(xiàn)小肽能提高刺參SOD、ACP、AKP活性，細胞吞噬和呼吸爆發(fā)力在第4天達到最大值。多肽的抗氧化機制較為復(fù)雜，有些可以直接促進抗氧化酶的活性，有些則需要通過特殊基團與自由基結(jié)合，利用還原作用達到直接消除自由基的目的。本研究制備的低分子質(zhì)量多肽混合物對刺參非特異性免疫有增強作用，充分說明此多肽具有高免疫活性，一定程度上與肽段的氨基酸組成及序列有關(guān)。另外，非特異性免疫的提高能一定程度上增強刺參的抗病力。

3.4 多肽對刺參腸道內(nèi)生長相關(guān)基因表達量的影響

飼料中的成分能一定程度上影響水生動物體內(nèi)的基因表達。Liu等[29-30]報道飼料中的游離氨基酸、肽和蛋白質(zhì)能夠調(diào)節(jié)肽轉(zhuǎn)運蛋白(PepT1)的表達，從而直接/間接的影響魚類的生長性能。當(dāng)大西洋鱈魚(Gadusmorhua)的飼料中含有不同比例的魚蛋白水解物或游離氨基酸時，它將改變腸道中的區(qū)域PepT1表達譜[31]。腱生蛋白、膠原蛋白α2、整合素αV和整合素βL基因在機體生命活動中能夠參與多種過程，具有廣泛的組織分布。腱生蛋白的主要作用是加強結(jié)締組織，調(diào)節(jié)細胞形態(tài)。膠原蛋白是最主要的結(jié)構(gòu)蛋白[32]，占總蛋白含量的70%左右。整合蛋白由α亞單位和β亞單位通過非共價鍵連接，能夠介導(dǎo)細胞和細胞間以及細胞和細胞外基質(zhì)間的相互識別和黏附[33]，進而聯(lián)系細胞外部與細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，這4種生長基因在刺參腸道中的總體表達量隨著多肽添加水平的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，規(guī)律與SGR基本一致。腱生蛋白基因上調(diào)，能夠提高刺參的再生能力；膠原蛋白α2基因的表達上調(diào)，會促進α2膠原蛋白的合成作用，從而提高膠原蛋白含量；通過整合素αV基因參與細胞增殖與分化，β整合素基因抑制細胞凋亡[34]，兩者結(jié)合可調(diào)控腸道再生，同時也會在免疫反應(yīng)中起到抑制劑的作用。適量的多肽能夠通過上調(diào)刺參蛋白類基因的表達，對刺參再生及體壁生長等進行調(diào)節(jié)，進而達到促進刺參生長，但對于各基因的聯(lián)動影響機制還有待進一步研究。

3.5 多肽對刺參腸道內(nèi)免疫相關(guān)基因的影響

刺參體內(nèi)的p105、p50、rel是NF-κB信號通路的重要基因。NF-κB信號通路能激活機體非特異性免疫反應(yīng)，通路中的轉(zhuǎn)錄因子可以被多種刺激物激活，進而參與誘導(dǎo)包括溶菌酶在內(nèi)的150多種目的基因的表達[35]。轉(zhuǎn)錄因子p105/p50和rel均具有N端rel同源結(jié)構(gòu)域(RHD)，可以通過該結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合，調(diào)控各種下游諸如趨化因子、細胞因子、溶菌酶和黏附因子等重要免疫因子的表達[13]。本研究結(jié)果表明多肽能顯著提高刺參腸道組織中p105和p50基因相對表達量，但對rel基因相對表達量影響不顯著，因此推測p105/p50可能屬于限制性因子，而rel則可能是一個非限制性因子，與之前陽剛等[13]研究結(jié)果一致。在刺參的NF-κB信號通路中，轉(zhuǎn)錄因子rel可以分別和p105和p50形成二聚體，而且一旦p50和rel進入核內(nèi)后可形成二聚體，調(diào)控相關(guān)基因的表達[12]。溶菌酶能夠切斷肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖間的β-1,4糖苷鍵，加速細菌溶解死亡，從而清除侵入體內(nèi)的病原菌[36]。多肽的添加顯著提高了刺參腸道內(nèi)溶菌酶基因lys的表達，表明多肽可以加強NF-κB信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控下游包括lys在內(nèi)的相關(guān)免疫基因的表達來提高腸道的免疫反應(yīng)，最終達到增強仿刺參的非特異免疫的作用。

4 結(jié) 論

本試驗研究結(jié)果表明，飼料中添加10%～15%低分子質(zhì)量的多肽可以顯著提高刺參的SGR，降低刺參對餌料的FR，同時多肽能上調(diào)腸道內(nèi)生長類基因的表達進而促進刺參生長，上調(diào)免疫類基因的表達提高刺參自身免疫力。