飼料添加懷山藥對鯉生長、腸屏障及腸道菌群的影響

李 衡 曹 慧 楊國坤,2 常緒路,2 張艷敏,2 張建新,2 胡文攀 朱振祥 李克克 孟曉林,2*

(1.河南師范大學水產(chǎn)學院，新鄉(xiāng)453007；2.河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術研究中心，新鄉(xiāng)453007；3.河南金百合生物科技股份有限公司，安陽456150)

隨著科技的進步，高密度、集約化養(yǎng)殖模式在提升經(jīng)濟效益的同時，也引發(fā)了抗生素濫用及魚病頻發(fā)等諸多問題[1]。雖然藥物在預防和治療水生動物疾病方面具有顯著效果，但長期或過量使用會破壞機體免疫力，增強病原菌耐藥性，增加機體藥物殘留[2]。2020年7月1日，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第149號令已明確禁止在飼料中添加抗生素。因此，尋找抗生素替代物已成為大家關注的焦點。

中草藥富含蛋白質(zhì)、多糖、生物堿、氨基酸、皂苷、維生素、有機酸等多種生物活性物質(zhì)，具有純天然、毒副作用小和藥食同源的優(yōu)點，可發(fā)揮增強免疫力、促進生長、抑菌殺菌、保肝利膽等作用。在現(xiàn)代魚類養(yǎng)殖中，中草藥已作為替代抗生素的新型飼料添加劑被廣泛使用[3]?！皯焉剿帯碑a(chǎn)自河南焦作，又名薯蕷(DioscoreaoppositeThunb.)，為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)植物。目前，山藥在畜禽動物中的應用研究已十分廣泛，如在斷奶仔豬、肉雞等動物上的研究發(fā)現(xiàn)，山藥籽實具有提高采食量、降低飼料系數(shù)、提高機體免疫力的功效[4-5]。在水產(chǎn)動物上的研究表明，山藥飼喂黃河鯉可顯著提高其肌肉中必需氨基酸的含量，以及血清中白蛋白和球蛋白含量[6]。此外，山藥可重構小鼠腸道菌群組成，增加短鏈脂肪酸的含量，保護腸道屏障[7]。

鯉(CyprinuscarpioL.)是我國重要的淡水經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類，根據(jù)《2020中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》報道，我國鯉養(yǎng)殖量在2019年達288.53萬t，占全國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量的9.57%[8]，但目前懷山藥在鯉免疫及腸道微生態(tài)方面的研究還鮮有報道。因此，本研究旨在探究懷山藥籽實作為飼料添加劑對鯉免疫及腸道菌群的調(diào)控機理，以初步明確其作為添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用的可行性，為山藥在水產(chǎn)領域的開發(fā)與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及試驗飼料

試驗用鯉購自新鄉(xiāng)市延津縣漁場，暫養(yǎng)于河南師范大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。以商品飼糧(購自河南某農(nóng)牧科技有限公司)暫養(yǎng)2周，選擇健康狀況良好的180尾鯉[(75.25±1.45) g]，隨機分為3組，每組3個重復。試驗進行8周，每天08:30、11:30、14:30、17:30投喂4次，記錄食物攝入和死亡數(shù)量，每2周調(diào)整1次投飼量。水質(zhì)控制指標：溶解氧含量>6 mg/L，氨態(tài)氮含量<0.01 mg/L，水溫(25±1) ℃，光照周期12L∶12D。

試驗用懷山藥籽實產(chǎn)自河南省武陟縣，經(jīng)超微粉碎過60目篩，60 ℃烘干制成懷山藥粉。采用單因素試驗設計，分別在基礎飼糧中添加0(對照組)、1%(LCY組)和2%(HCY組)的懷山藥粉。其他飼糧原材料粉碎過篩(60目)，按配方比重混勻，用飼料顆粒機制成粒徑2.5 mm的顆粒飼料，晾干后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 生長性能指標測定

每天記錄試驗魚的死亡率及投喂量，計算增重率(WGR)、特定生長率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)。

增重率(%)=100×(末體重-初體重)/初體重；
特定生長率(%/d)=100×(ln末體重-
ln初體重)/飼喂天數(shù)；
飼料系數(shù)=每個重復飼料總消耗量/
(末體重+死亡魚重-初體重)。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.3 腸道酶活性測定

每桶隨機取3尾魚，每組9尾，冰上分離出全腸于2 mL無菌無酶離心管中，液氮速凍后-80 ℃超低溫冰箱保存。樣品勻漿后，測定丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和溶菌酶(LZM)活性，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 中腸組織形態(tài)學觀察

每桶隨機取3尾魚，每尾分離出2份中腸組織樣品。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，一份使用10%福爾馬林溶液固定，用于蘇木精-伊紅(HE)染色。另一份樣品用2.5%戊二醛溶液固定，用于掃描電子顯微鏡觀察。

HE染色：固定后的中腸組織樣品，梯度乙醇脫水24 h后，用石蠟包埋切片機將蠟塊切成4 μm厚，染色后在光學顯微鏡下分別放大100、200和400倍，觀察腸道肌層厚度和腸絨毛高度。

掃描電子顯微鏡：將固定好的樣品在30%、50%、70%、80%、90%和100%的梯度乙醇中脫水15 min。隨后在叔丁醇中浸泡15 min，4 ℃下冷凍。在掃描電子顯微鏡(JEOL，日本)下觀察。

1.5 基因相對表達量測定

每桶隨機取3尾魚，每組9尾，分離中腸組織于1.5 mL無菌無酶離心管中，放入液氮速凍后-80 ℃超低溫冰箱保存。樣品提取RNA后使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa，大連)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA作為模板，18S rRNA基因作為內(nèi)參。熒光定量PCR反應體系：5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa，大連)，0.3 μL正向引物(10 μmol/L)，0.3 μL反向引物(10 μmol/L)，1.0 μL cDNA模板，3.4 μL無菌水。擴增程序為：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)，每樣品設3個平行(RocheLightCycler?480，瑞士)。熒光定量PCR引物由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列見表2，基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.6 腸道菌群測序分析

每桶選取12尾魚，酒精棉擦拭魚體表，在超凈工作臺下用滅菌的剪刀從鯉瀉泄殖孔處剪開，將取出的腸道用一次性培養(yǎng)皿盛放。用PBS洗外腸道，鑷子夾除腸系膜、脂肪等物質(zhì)后，用無菌鉗輕輕擠壓中腸，小心地取腸內(nèi)容物，2個樣品混合為1個樣品，共6個樣品，于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｄc內(nèi)容物一部分用于微生物基因組DNA提取，另一部分用于腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量測定。使用基因組DNA提取試劑盒(QIAamp，德國)提取腸內(nèi)容物樣品基因組DNA。使用NanoDrop 2000測量DNA濃度，并通過瓊脂糖電泳檢測DNA完整性。所得合格的總DNA樣品用于16S rRNA的高通量測序。用條形碼引物V338F (5’-ACTCCTACGGGAGAGGCAGCA-3’)和V806R (5’-ATGCAGGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)擴增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)。從1%瓊脂糖凝膠中提取擴增子，通過AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen, 美國)純化，并根據(jù)制造商的規(guī)程使用QuantiFluorTM-ST(Promega, 美國)進行定量。將純化的擴增子通過Illumina Miseq PE 300進行配對末端測序。

使用FLASH(Version 1.2.11)對測序得到的PE reads進行組裝，并使用QIIME(V.1.9.1)進行分析。通過使用與UPARSE(Version 7.1，http://drive5.com/uparse/)的97%相似性截止值，對可操作分類單元(OTU)進行了聚類，并使用UCHIME鑒定并去除了嵌合序列。通過RDP分類器算法(http://rdp.cme.msu.edu/)針對Silva(SSU123)16S rRNA數(shù)據(jù)庫，按照70%的置信度閾值分析每個16S rRNA基因序列的分類。根據(jù)物種注釋，標記每個樣本中對應于每個分類級別的序列數(shù)?；贠TU，進行了Shannon、Simpson等多樣性指數(shù)的分析，比較各組間腸道微生物的多樣性和豐富度，統(tǒng)計樣品的α多樣性。

1.7 腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量測定

稱取1.6中所取的新鮮腸道內(nèi)容物樣品2 g，以1.0∶2.5(w/v)的比例添加超純水并混合研磨2 min，12 000 r/min離心30 min。將上清液移入新的2 mL離心管，調(diào)上清pH至2～3，0.45 μm過濾制得樣品液。短鏈脂肪酸含量采用氣相色譜儀(Agilent Technologies 7890B，美國)測定，測定條件為：流速8 mL/min；進樣量1.0 μL；機器入口溫度保持在240 ℃。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示，用軟件SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行one-way ANOVA單因素方差分析和Duncan氏法多重比較檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。利用http://www.i-sanger.com美吉測序平臺對高通量測序結果進行生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 懷山藥對鯉生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，各試驗組增重率、特定生長率、飼料系數(shù)及存活率無顯著差異(P>0.05)。但隨著懷山藥添加量增加，增重率和特定生長率有所升高，飼料系數(shù)有一定程度的降低。

表3 懷山藥對鯉生長性能的影響

2.2 懷山藥對鯉腸道酶活性的影響

由表4可知，與對照組相比，LCY和HCY組腸道超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、溶菌酶活性均顯著升高(P<0.05)，但MDA含量在各組間無顯著差異(P>0.05)。

表4 懷山藥對鯉腸道酶活性的影響

2.3 懷山藥對鯉腸道組織形態(tài)的影響

HE切片結果顯示，與對照組相比，添加懷山藥后鯉腸微絨毛密度增大，微絨毛結構更完整，杯狀細胞數(shù)量增加(圖1-A、圖1-B)。掃描電鏡結果顯示，試驗組腸道黏膜褶皺數(shù)量與對照組相比顯著增多(P<0.05)，且在HCY組尤為明顯(圖1-C)。此外，與對照組相比，LCY組腸絨毛高度顯著增加(P<0.05)，而試驗組腸道肌層厚度與對照組相比無顯著差異(P>0.05)(圖2)。

A：HE染色100倍；B：HE染色400倍；C：腸黏膜組織掃描電鏡150倍。MD：機械損傷；MV：微絨毛；SH：分泌孔；V：腸絨毛；M：基層；G：杯狀細胞。

數(shù)據(jù)柱形標注*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.4 懷山藥對鯉腸道免疫相關基因相對表達量的影響

由圖3可知，與對照組相比，LCY組中腸道白細胞介素-10(IL-10)和緊密連接蛋白-1(ZO-1)基因相對表達量顯著升高(P<0.05)，白細胞介素-1β(IL-1β)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、Toll樣受體4(TLR4)和閉合蛋白(Occludin)基因相對表達量極顯著升高(P<0.01)。在HCY組中，僅有IL-10基因相對表達量與對照組相比顯著升高(P<0.05)，其余基因表達量與對照組相比有升高趨勢，但差異均不顯著(P>0.05)。

IL-1β:白細胞介素-1β interleukin-1β；IL-10:白細胞介素-10 interleukin-10；TNF-α:腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；TGF-β:轉(zhuǎn)化生長因子-β transforming growth factor-β；TLR4:Toll樣受體4 Toll-like receptors 4；NF-κB:核因子-κB nuclear factor kappa-B；ZO-1:緊密連接蛋白 zonulaoccludens-1；Occludin:閉合蛋白。

2.5 懷山藥對鯉腸道微生物的影響

由表5可知，覆蓋度在各組之間沒有顯著差異(P>0.05)，與對照組相比，LCY組Ace指數(shù)和Chao指數(shù)顯著升高(P<0.05)。Shannon指數(shù)代表了微生物群落的多樣性，Simpson指數(shù)代表了微生物群落的均勻度，結果表明，與對照組相比，LCY組和HCY組腸道Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)均顯著升高(P<0.05)。

表5 懷山藥對鯉腸道微生物多樣性的影響

由圖4可知，各組腸道菌群在門水平上均主要由梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)組成。其中梭桿菌門相對豐度最高，分別占總數(shù)的54.29%(對照組)、83.83%(LCY組)和86.97%(HCY組)。與對照組相比，LCY和HCY組梭桿菌門相對豐度顯著升高(P<0.05)，而變形菌門相對豐度則顯著降低(P<0.05)。此外，與對照組相比，懷山藥添加組擬桿菌門相對豐度升高，厚壁菌門相對豐度降低，厚壁菌門/擬桿菌門比值下降。

Fusobacteria：梭桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Others：其他。

由圖5-A可知，在屬水平上相對豐度較高的菌群有鯨桿菌屬(Cetobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和腸桿菌屬(Enterobacter)。與對照組相比，LCY和HCY組鯨桿菌屬相對豐度顯著升高(P<0.05)(圖5-B)，而氣單胞菌屬相對豐度顯著性降低(P<0.05)(圖5-C)。希瓦氏菌屬、腸桿菌屬相對豐度與對照組相比無顯著變化(P>0.05)(圖5-D、圖5-E)。

圖5 屬水平鯉腸道內(nèi)容物微生物群落組成(A)、鯨桿菌屬的相對豐度(B)、氣單胞菌屬相對豐度(C)、

2.6 懷山藥對鯉腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響

由圖6可知，與對照組相比，LCY組和HCY組鯉腸內(nèi)容物乙酸含量顯著升高(P<0.01)，而丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸和異戊酸的含量與對照組相比沒有顯著變化(P>0.05)。圖7顯示了各組鯉腸道總短鏈脂肪酸的含量，可以發(fā)現(xiàn)，試驗組與對照組相比均顯著升高(P<0.05)。

圖6 懷山藥對鯉腸道內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響

圖7 懷山藥對鯉腸內(nèi)容物總短鏈脂肪酸含量的影響

3 討 論

3.1 懷山藥對鯉生長性能及腸道組織形態(tài)的影響

中草藥飼料添加劑可改善動物飼料質(zhì)量，解決傳統(tǒng)抗生素飼料添加劑的藥物殘留問題[9]。鄧華富[10]在基礎飼糧中添加1%山藥粉，研究對斷奶仔豬生長性能的影響。結果表明，山藥能顯著提高斷奶仔豬的平均日增重和平均日采食量。楊仕群等[11]在山地烏骨雞飼糧中添加1%、2%和4%的山藥，顯著提高了平均日增重和飼料攝入量。陸克文等[4]研究發(fā)現(xiàn)了添加1%山藥粉可顯著提高1～21日齡和14～21日齡仔豬的平均日增重。上述研究表明，山藥作為飼料添加劑在畜禽動物生長性能方面可以起到很好的促進作用。在水產(chǎn)動物研究中，喬志剛等[6]在黃河鯉基礎飼料中加入質(zhì)量分數(shù)為2%的懷山藥，可提高黃河鯉特定生長率、增重率，但差異不顯著，這與本研究結果相似。在本研究中，飼料系數(shù)在添加懷山藥后雖然下降，但保持較高的值，分析原因可能是魚的初體重偏高，相比幼魚來說，它對營養(yǎng)物質(zhì)吸收有一定差異。水產(chǎn)動物在不同的生長階段投餌次數(shù)應不同，投餌次數(shù)過多，飼料在腸道內(nèi)的蠕動速度就越快，若超出對飼料的消化速度就會導致一定數(shù)量的飼料無法被充分消化吸收，造成飼料浪費，提高飼料系數(shù)。

腸吸收能力的增強可能是促進鯉生長的原因。腸道是機體營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收的主要場所，腸道健康依賴于正常的生理結構，而腸絨毛長度、肌層厚度則是評價腸道消化吸收能力的重要依據(jù)[12]。絨毛的長度與腸上皮細胞數(shù)量呈正相關，腸絨毛長度增加，腸上皮細胞數(shù)增多，消化吸收能力增強，生長發(fā)育加快。黏膜的上皮細胞由單層的柱狀上皮細胞組成，它們散布在許多杯狀細胞中，杯狀細胞分泌消化酶和黏液，從而保護上皮細胞并潤滑腸道。在本研究中，試驗組腸絨毛長度及完整性、肌層厚度和杯狀細胞的數(shù)量相較于對照組，有一定程度的增加，并且腸黏膜褶皺顯著增多，這表明吸收表面積增大，消化和吸收能力增強。這與前述增重率相比于對照組有升高趨勢的結果相一致，說明添加懷山藥能在一定程度上增強鯉腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進鯉生長。

3.2 懷山藥對鯉腸道酶活性和腸道免疫相關基因相對表達量的影響

抗氧化劑系統(tǒng)是脊椎動物中最重要的免疫防御系統(tǒng)[13]，酶的活性通常間接表明宿主清除活性氧(ROS)的能力。其中抗氧化酶中的氧化氫酶和超氧化物歧化酶通常被用作評估免疫潛能的功能參數(shù)[14]，其可通過清除自由基降低氧化應激，預防、阻止或減少氧化損傷，保護機體免受疾病的侵襲。在本研究中，飼料中添加山藥粉后，鯉腸道中的氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性顯著增加，這表明抗氧化能力的提升。這一結果與草魚飼料中添加條斑紫菜多糖[15]和凡納濱對蝦飼料中添加白芍多糖[16]的研究結果相吻合。溶菌酶是一種具有抗菌活性的蛋白酶，可通過降解革蘭氏陰性菌細胞壁中多糖從而產(chǎn)生抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在鯉飼料中添加多糖[17]和尼羅羅非魚飼料中添加丹參[18]會誘導溶菌酶的活性或表達量增加。在本試驗中，飼料中添加懷山藥，溶菌酶活性顯著升高，這與山藥中的山藥多糖等生物活性成分密切相關，此外可能由于活性物質(zhì)經(jīng)由腸道菌群介導，促進了腸道中溶菌酶的分泌。

在宿主防御反應中，一類抗炎癥因子能下調(diào)細胞炎性反應、維持機體內(nèi)細胞因子平衡[19]，如IL-10、TGF-β等。IL-10和TGF-β作為重要的抗炎細胞因子，響應于炎癥刺激，參與多項免疫調(diào)節(jié)，抑制細胞因子的過度釋放，具有減輕炎性損傷的作用[20]。本試驗添加山藥粉后中腸IL-10和TGF-β基因相對表達量顯著增加，與鯉添加棕櫚果實提取物的結果[21]一致。促炎性細胞因子要有IL-1β和TNF-α等。IL-1β和TNF-α是由單核巨噬細胞等免疫細胞分泌的，是引起炎癥反應，抵抗病原入侵的第1介質(zhì)[22]，在魚類早期感染和炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，可通過炎性反應提高機體抗感染能力，通常被認為是預測炎癥反應的生物標志物[23]。TNF-α在機體產(chǎn)生炎癥反應時，能促進IL-1β的分泌，并與之發(fā)生協(xié)同作用[24-25]。一些研究表明，多糖作為有效的免疫刺激劑，可以誘導TNF-α和IL-1β基因相對表達量，積極調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，從而提高魚體的免疫應答和抗病性。Watanuki等[26]報道，在鯉魚飼料中添加螺旋藻上調(diào)了IL-1β和TNF-α基因表達。Wang等[27]的研究中，熟地黃同樣能上調(diào)IL-1β和TNF-α的表達，提高鯉的免疫能力。Toll樣受體是與免疫相關的模式識別受體，是連接特異性和非特異性免疫的媒介，能通過提升對細胞因子合成與釋放而控制促發(fā)炎癥反應。其中TLR4可以識別并結合革蘭氏陰性菌脂多糖，激活核因子-κB(NF-κB)信號轉(zhuǎn)導通路，從而誘導炎性細胞因子表達[28]。越來越多的證據(jù)表明，多糖作為一種有效的免疫刺激物，直接參與巨噬細胞的活化[29]，通過TLR4/NF-κB通路促進炎性因子的產(chǎn)生(促炎因子和抗炎因子)，從而刺激免疫反應。在哺乳動物中，Li等[30]研究表明，山藥中的非淀粉多糖通過TLR4/NF-κB信號通路來激活巨噬細胞，促進IL-6和TNF-α基因相對表達量。Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)，大黃多糖(Rhubarbpolysaccharides)能激活巨噬細胞表面TLR4復合物并轉(zhuǎn)導胞外信號到胞內(nèi)，誘導NF-κBp65的表達。本研究的試驗結果表明，山藥多糖可能通過TLR4/NF-κB通路激活鯉腸上皮巨噬細胞，引起機體的免疫應答，提升能免疫力。

緊密連接蛋白是組成腸黏膜機械屏障的重要部分[32]，緊密連接蛋白Occludin與ZO-1可以形成穩(wěn)定的連接，對維系腸黏膜屏障的完整性意義重大。已有研究報道了黃芪多糖[33]和白芨多糖[34]對ZO-1和Occludin基因相對表達量的增強作用。此外，一些研究表明，酚類化合物影響這些蛋白的緊密結合能力，增強屏障完整性[35]。在本研究中，飼料中補充山藥增加了Occludin和ZO-1在腸道中基因相對表達量，說明懷山藥可提升腸道屏障保護作用，這與腸道組織形態(tài)觀察結果是一致的。

3.3 懷山藥對鯉腸道微生物和短鏈脂肪酸含量的影響

腸道菌群被稱為機體的第二器官，與機體的代謝、免疫等功能密切相關。本試驗分別從門、屬2個水平對添加懷山藥后鯉腸道菌群結構及多樣性的變化進行了分析。在門水平上，鯉腸道的優(yōu)勢群落主要由梭桿菌門、變形桿菌門和擬桿菌門組成，且超過50%的微生物類群屬于梭桿菌門，這與Van Kessel等[36]對鯉的腸道菌群研究結果一致。目前在魚類腸道樣本中檢測到的梭桿菌幾乎都屬于鯨桿菌屬，是一種常見的淡水魚腸道中廣泛分布的菌種。有研究顯示，魚類腸道中大量定植的鯨桿菌屬可產(chǎn)生維生素B12，與機體代謝密切相關[37]。在殼聚糖-銀納米復合材料(CAgNCs)添加飼喂的斑馬魚腸道中鯨桿菌屬豐度顯著升高，并促進了維生素的產(chǎn)生[38]。因此，本研究添加山藥粉后，鯉腸道菌群中鯨桿菌屬相對豐度的顯著升高可能會促進維生素B12的產(chǎn)生，供給機體營養(yǎng)需要，促進機體健康。變形菌門是包括魚類在內(nèi)的大多數(shù)物種腸道菌群的重要組成部分[39]，它包含許多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等，其與腸道的屏障作用有關，變形菌門的高豐度會導致緊密連接蛋白表達降低，從而引起腸道損傷的發(fā)生[40]。在鯉腸道中存在的變形菌大部分屬于氣單胞菌屬，是一種條件致病菌。本研究表明，與對照組相比，飼料中補充懷山藥可以顯著降低鯉腸道中氣單胞菌屬的相對豐度，說明山藥可能對減少致病性腸道菌群的數(shù)量，增強宿主的抗病能力有積極的影響。厚壁菌門和擬桿菌門可以編碼多種與糖相關的酶，在非消化多糖的利用中發(fā)揮重要作用[41]。在人類及哺乳動物研究中表明，厚壁菌門/擬桿菌門比值的降低表征著脂質(zhì)代謝的改善[42]。本研究證明，懷山藥可以通過調(diào)節(jié)厚壁菌和擬桿菌的相對豐度來減少宿主對食物中多余脂類物質(zhì)的吸收，從而防止攝入過多的能量來維持正常體重。此外，腸桿菌屬和希瓦氏菌屬被認為是引起多種疾病的主要條件性致病菌，而希瓦氏菌屬隸屬于弧菌科，是人類和水產(chǎn)動物的潛在病原。但Ray等[43]研究顯示，從印度鯉魚(Indian carp，Cyprinidae)消化道分離出的腸桿菌可以產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶，在鯉魚腸道食物消化過程中發(fā)揮積極的作用。Dailey等[44]研究發(fā)現(xiàn)希瓦氏菌屬可以產(chǎn)生利于機體腸道健康的脂肪酸，如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。本研究結果顯示，與對照組相比，添加懷山藥對鯉腸道中腸桿菌屬和希瓦氏菌屬的相對豐度無顯著影響。具體其發(fā)揮的功能還需要進一步在種的水平上開展研究。短鏈脂肪酸是腸道微生物消化膳食成分發(fā)酵后的產(chǎn)物，可降低腸道內(nèi)pH，抑制病原微生物的增殖，同時改善腸道菌群結構和腸道屏障完整性，參與免疫調(diào)節(jié)，有效預防腸道炎癥[45]。本研究中，飼料中添加懷山藥可調(diào)節(jié)鯉腸內(nèi)短鏈脂肪酸的含量，尤其是乙酸、丙酸、丁酸和總酸的含量，這可能與山藥中的富含的山藥多糖密切相關。越來越多的證據(jù)表明，多糖具有促進產(chǎn)短鏈脂肪酸細菌增殖的潛力[46]，如擬桿菌和梭桿菌。

4 結 論

綜上所述，飼料中添加懷山藥對鯉的生長性能無顯著影響，但可以顯著提升鯉的腸道屏障功能，改善鯉的腸道菌群結構，提高短鏈脂肪酸含量，有望作為潛在的鯉飼料添加劑。