雞circ_PLXNA1鑒定及其在脂肪細(xì)胞分化中的功能預(yù)測(cè)

楊 婷，王來娣，胡曉丹，袁春友，白 皓,2，王志秀，江 勇，陳國(guó)宏,2，常國(guó)斌*

（1.江蘇省動(dòng)物遺傳育種與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

環(huán)狀RNA（circRNA）是繼microRNA（miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）之后另一種新型內(nèi)源性非編碼RNA（ncRNA）。Sanger等首先在病毒中發(fā)現(xiàn)circRNA[1]。circRNA最初被認(rèn)為是錯(cuò)誤剪接產(chǎn)生的副產(chǎn)物或在mRNA合成過程中產(chǎn)生，不具有生物學(xué)功能[2]。隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)展，circRNA被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于人類、斑馬魚、小鼠、豬、雞等多種真核生物中。由于circRNA無(wú)5′端、3′端和poly A尾，可避免核糖核酸酶R（RNase R）等核酸外切酶切割，因此比線性RNA更穩(wěn)定。部分研究在人類口腔唾液中檢測(cè)到超過400個(gè)circRNAs[3]，高度穩(wěn)定。此外，circRNA還具有細(xì)胞和組織特異性及時(shí)間特異性[4]，生產(chǎn)效率一般高于線性同源mRNA，更穩(wěn)定、保守，但一般不具有翻譯功能[6]。

CircRNA可通過多種方式發(fā)揮作用，吸附miRNA（ceRNA）調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合。Xiong等發(fā)現(xiàn)circRNA0025813通過吸附miR-122調(diào)節(jié)其靶基因Cpeb1和Plp2表達(dá)參與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展[7]，Stoll等發(fā)現(xiàn)circHIPK3通過結(jié)合miR-124-3p和miR-338-3p增加Slc2a2、Akt1和Mtpn表達(dá)，增強(qiáng)胰島素分泌以及β細(xì)胞活性[8]。

脂肪組織在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和提高肉質(zhì)方面發(fā)揮重要作用，但過多異位脂肪沉積影響飼料轉(zhuǎn)化率，與疾病發(fā)生密切相關(guān)。目前家禽中circRNA研究主要集中在肌肉發(fā)育[9]，生長(zhǎng)發(fā)育[10]，繁殖性能和疾病預(yù)防[11]，在家禽脂肪細(xì)胞分化中的作用機(jī)制研究相對(duì)較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)鴨circ_PLXNA1在鴨脂肪細(xì)胞分化中起重要作用[12]。另外，本課題組前期DF-1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中也篩選到該circRNA，發(fā)現(xiàn)鴨circ_PLXNA1與雞circ_PLXNA1具有高度同源性，且鴨circ_PLXNA1在脂肪細(xì)胞分化中有重要作用。本研究選擇雞circ_PLXNA1作驗(yàn)證分析，為進(jìn)一步研究circRNA在雞脂肪細(xì)胞分化中作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以購(gòu)自美國(guó)ATCC公司DF-1細(xì)胞為試驗(yàn)材料，驗(yàn)證雞circ_PLXNA1在細(xì)胞水平中的表達(dá)。采集3只成年公雞心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、淋巴、法氏囊等組織，保存于-80℃條件下用于后期組織總RNA提取。Trizol試劑（購(gòu)自Invitrogen，美國(guó)）；2X Taq聚合酶（購(gòu)自諾唯贊生物科技公司，中國(guó)南京）；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒和FastKing一步基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑（購(gòu)自天根生化科技，中國(guó)北京）；TB Green qPCRPremix[購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，中國(guó)北京]；RNase R（購(gòu)自Epicenter公司，瑞典）；瓊脂糖（購(gòu)自Bio-Rad，美國(guó)）；PBS和DMEM（購(gòu)自Hyclone，美國(guó)）；胎牛血清（購(gòu)自GIBICO，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

基于雞PLXNA1基因序列（Gene ID:416030）和雞circ_PLXNA1接頭序列和線性序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)發(fā)散引物和收斂引物，其中發(fā)散引物也可用于定量PCR。雞circ_PLXNA1和GAPDH引物序列如表1所示。

表1 PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 Primersdesign for PCR experiments

1.2.2 DF-1細(xì)胞培養(yǎng)

DF-1細(xì)胞培養(yǎng)在添加10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中，放置在溫度為38.5℃，CO2濃度為5%，濕度為60%~70%培養(yǎng)箱中。

1.2.3 gDNA提取

當(dāng)DF-1細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，收集細(xì)胞，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA（gDNA）。

1.2.4 circ_PLXNA1驗(yàn)證

以肝臟組織cDNA為模板，使用收斂引物和發(fā)散引物通過PCR擴(kuò)增目的片段。以gDNA為模板，使用收斂引物和發(fā)散引物通過PCR擴(kuò)增目的片段。目的片段擴(kuò)增完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，相應(yīng)PCR產(chǎn)物送由擎科生物技術(shù)公司（中國(guó)北京）測(cè)序。

1.2.5 總RNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

使用TRIzol試劑（Life Technologies,Carlsbad,CA）提取總RNA，使用Nanodrop ND-1000微型分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA質(zhì)量和濃度。RNA的A260/280吸光度比值在1.8~2.1之間，A260/230大于2.0。

1.2.6 定量PCR分析

使用帶有g(shù)DNA Eraser（TaKaRa）的PrimeScript RT試劑盒合成cDNA后，用SYBR Premix ExTaqII試劑（TaKaRa，Shiga，日本）和QuantStudio 5實(shí)時(shí)PCR儀器進(jìn)行定量PCR分析。引物組使用Primer 5.0和Oligo 7設(shè)計(jì)，由擎科生物技術(shù)（中國(guó)北京）合成；作3次重復(fù)測(cè)定（表1提供引物序列）。

1.2.7 RNase R消化試驗(yàn)

將2.5μg總RNA與3 U·μg-1RNase R（Epicentre Technologies，Madison，WI）或作為對(duì)照的無(wú)酶水在37℃下孵育30 min，70℃，10 min酶滅活。重新提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，定量PCR檢測(cè)雞circ_PLXNA1和PLXNA1 mRNA表達(dá)情況。

1.2.8 核質(zhì)分離試驗(yàn)

使用NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑（Thermo Scientific）按照說明書操作步驟分別提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分，-80℃保存?zhèn)溆?。使用Trizol試劑提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分RNA，定量PCR檢測(cè)雞circ_PLXNA1和PLXNA1 mRNA在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)情況。

1.2.9 生物信息學(xué)分析

Miranda（http://cbio.mskcc.org/microrna_data/mi Randa-aug2010.tar.gz）、miRDB（http://mirdb.org/）和Target Scan Human 7.2（http://www.targetscan.org/vert_72/）3個(gè)軟件用于預(yù)測(cè)雞circ_PLXNA1靶向miRNA及其對(duì)應(yīng)靶基因，使用Cytoscape 3.7.1（https://cytoscape.org/download.html）軟件對(duì)預(yù)測(cè)到的miRNA及其對(duì)應(yīng)靶基因構(gòu)建circ_PLXNA1/miRNA/mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，最后使用在線軟件（http://enrich.shbio.com/index/ga.asp）對(duì)預(yù)測(cè)目標(biāo)基因作GO和KEGG分析。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析

熒光定量PCR數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析。使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8軟件（GraphPad Software Inc,San Diego，CA）單因素方差分析對(duì)熒光定量PCR數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析，并表示為mean±SD。P＜0.05代表顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞circ_PLXNA1鑒定和穩(wěn)定性檢測(cè)

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)鴨circ_PLXNA1在鴨脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。在DF-1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中也篩選到這個(gè)circRNA，同時(shí)鴨circ_PLXNA1與雞circ_PLXNA1具有91%同源性（見圖1），因此篩選雞circ_PLXNA1作驗(yàn)證分析?；蚪M結(jié)構(gòu)顯示雞circ_PLXNA1是一個(gè)外顯子型環(huán)狀RNA（見圖2），由來自PLXNA1基因外顯子1和外顯子2以及部分5′UTR序列組成，總長(zhǎng)為1 533 bp（見圖3A）。以cDNA為模板，對(duì)使用發(fā)散引物擴(kuò)增序列進(jìn)行sanger測(cè)序，結(jié)果表明該擴(kuò)增序列與高通量測(cè)序得到序列一致，且剪接點(diǎn)前面和剪接點(diǎn)后面序列分別是AG和GG（見圖3B）。如圖4所示，發(fā)散引物從cDNA上擴(kuò)增出目的片段而無(wú)法從gDNA上擴(kuò)增出目的片段，而收斂引物既可從cDNA上擴(kuò)增出目的片段，也可從gDNA上擴(kuò)增出目的片段（由于收斂引物是跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)，所以收斂引物在gDNA上擴(kuò)增的目的片段較長(zhǎng)，收斂引物在gDNA上擴(kuò)增的目的片段未能在瓊脂糖凝膠電泳圖上顯示）。該結(jié)果均證實(shí)雞circ_PLXNA1的存在。

圖1 雞circ_PLXNA1和鴨circ_PLXNA1序列比較Fig.1 Comparison of the sequence of duck circ_PLXNA1 and chicken circ_PLXNA1

圖2 雞circ_PLXNA1基因組結(jié)構(gòu)Fig.2 Genomic structureof chicken circ_PLXNA1

圖3 雞circ_PLXNA1模式圖及接頭序列測(cè)序峰圖Fig.3 Chicken circ_PLXNA1 pattern maps and conjugated sequence sequencing peaks

圖4 雞circ_PLXNA1瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Chicken circ_PLXNA1 agarose gel electrophoresis

2.2 雞circ_PLXNA1穩(wěn)定性檢測(cè)和亞細(xì)胞定位

采用RNase R外切核酸酶消化RNA，進(jìn)一步確定雞circ_PLXNA1穩(wěn)定性。qRT-PCR結(jié)果表明，雞circ_PLXNA1對(duì)RNase R消化抗性較高，而相關(guān)線性轉(zhuǎn)錄物（PLXNA1 mRNA）則顯著降解（見圖5），證明雞circ_PLXNA1具有穩(wěn)定環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

圖5 雞circ_PLXNA1在RNase R處理組與對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量比較Fig.5 Comparison of the relative expression of chicken circ_PLXNA1 in RNase R-treated and control group

對(duì)DF-1細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分離后，提取相應(yīng)核和質(zhì)RNA，通過定量PCR檢測(cè)雞circ_PLXNA1和PLXNA1 mRNA在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)情況。定量PCR結(jié)果分析表明，雞circ_PLXNA1主要定位于細(xì)胞質(zhì)中（見圖6）。

圖6 雞circ_PLXNA1的核質(zhì)分離Fig.6 Subcellular localization of chicken circ_PLXNA1

2.3 雞circ_PLXNA1在雞不同組織中表達(dá)水平

從雞心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、淋巴、法氏囊等組織中提取RNA，采用定量PCR檢測(cè)不同組織中雞circ_PLXNA1和PLXNA1 mRNA表達(dá)。定量PCR分析結(jié)果表明，雞circ_PLXNA1在心臟和肝臟中表達(dá)水平較高，其次是淋巴，脾臟中較少，在其他組織中幾乎無(wú)表達(dá)；PLXNA1 mRNA在所有組織中均表達(dá)，且表達(dá)水平較高（見圖7）。

圖7 雞circ_PLXNA1在雞不同組織中相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Expression of chicken circ_PLXNA1 in different tissuesof chicken

2.4 雞circ_PLXNA1可能間接參與脂肪細(xì)胞分化

為進(jìn)一步探索雞circ_PLXNA1潛在功能，使用Miranda軟件預(yù)測(cè)可靶向circ_PLXNA1的miRNA和mRNA。結(jié)果顯示共預(yù)測(cè)296個(gè)miRNA，其中14個(gè)miRNA形成自由能大于30的復(fù)合結(jié)構(gòu)，本試驗(yàn)選取前10個(gè)自由能較高miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。使用miRDB和TargetScan軟件預(yù)測(cè)靶基因，總計(jì)預(yù)測(cè)到有549個(gè)基因可靶向前面提到的10個(gè)miRNA。Cytoscape軟件用于構(gòu)建雞circ_PLXNA1-miRNAmRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（見圖8），結(jié)果表明circ_PLXNA1可能通過預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生廣泛影響。

圖8 雞circ_PLXNA1的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（circ_PLXNA1-miRNA-mRNA)Fig.8 ceRNA(circ_PLXNA1-miRNA-mRNA)network diagram of chicken circ_PLXNA1

對(duì)預(yù)測(cè)到的549個(gè)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析以預(yù)測(cè)其功能。GO分析主要從分子功能（MF）、細(xì)胞成分（CC）和生物過程（BP）3個(gè)方面分析基因功能（見圖9），雞circ_PLXNA1靶基因功能主要是轉(zhuǎn)錄因子活性（Transcription factor activity）、序列特異性DNA結(jié)合（Sequence-specific DNA binding）、蛋白激酶活性（Protein kinase activity）、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性（Phosphotransferase activity）、醇族體（Alcohol group as acceptor）、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物（Transcription factor complex）、細(xì)胞前沿（Cell leading edge）、表皮發(fā)育（Epidermis development）、骨髓細(xì)胞分化（Myeloid cell differentiation）等。

圖9 549個(gè)靶標(biāo)基因GO分析結(jié)果Fig.9 GO analysisresult of the549 target genes

KEGG富集分析表明，雞circ_PLXNA1靶基因主要富集在Adherens連接（Adherens junction）、ErbB信號(hào)通路（ErbBsignaling pathway）、Tight連接（Tight junction）、泛素介導(dǎo)的蛋白水解（Ubiquitin mediated proteolysis）、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控（Regulation of actin cytoskeleton）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、Hedgehog信號(hào) 通路（Hedgehog signalingpathway）等（見圖10）。

圖10 549個(gè)靶標(biāo)基因的KEGG結(jié)果Fig.10 KEGG analysisof the 549 target genes

3 討論

目前家禽circRNA研究主要集中在肌肉發(fā)育和繁殖性能等方面，脂肪細(xì)胞分化方向研究相對(duì)較少。郭行雅研究發(fā)現(xiàn)小鼠circRNA-0046367通過吸附miR-34a消除對(duì)PPARα表達(dá)的抑制，降低脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)，減輕肝臟脂肪變性[13]。張貞貞研究發(fā)現(xiàn)miR-103是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞重要miRNA，circARF3可通過海綿吸附miR-103促進(jìn)線粒體自噬調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，抑制脂肪炎癥[14]。Jiang等研究發(fā)現(xiàn)在牛脂肪細(xì)胞中，能夠靶向let-7c的circ-FUT10調(diào)節(jié)PPARGC1B表達(dá)從而促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖并抑制脂肪細(xì)胞分化[15]。Zhang等首次在牦牛脂肪細(xì)胞分化過程中鑒定circRNA表達(dá)模式，共檢測(cè)到7 203個(gè)候選circRNA，為牦牛脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因研究提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[16]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)ciRS-133與胃癌患者白色脂肪組織（WAT）褐變有關(guān)，來自胃癌細(xì)胞的外泌體將ciRS-133遞送到前體脂肪細(xì)胞中，通過激活PRDM16和抑制miR-133促進(jìn)前脂肪細(xì)胞向棕色樣細(xì)胞分化[17]。因此推測(cè)circRNA可能在雞脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)鴨circ_PLXNA1在鴨脂肪細(xì)胞分化中起作用，在DF-1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中也篩選到此circRNA。本研究中選擇與鴨circ_PLXNA1具有91%同源性的雞circ_PLXNA1驗(yàn)證其在雞脂肪細(xì)胞分化中作用。通過對(duì)雞circ_PLXNA1全長(zhǎng)序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，并與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，雞circ_PLXNA1由PLXNA1基因的5′UTR部分序列、外顯子1以及外顯子2反向剪接而成，其中剪接點(diǎn)前面和剪接點(diǎn)后面序列分別是AG和GG，符合環(huán)狀RNA剪接規(guī)律[18]。本試驗(yàn)通過對(duì)雞circ_PLXNA1反向剪接位點(diǎn)處序列的PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證，且結(jié)合RNase R核酸外切酶消化處理試驗(yàn)，證明雞circ_PLXNA1比線性PLXNA1更耐RNase R消化，是一個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本，與前人研究結(jié)果一致[10]。組織表達(dá)譜定量結(jié)果表明雞circ_PLXNA1在雞部分組織中含量豐富，其他研究也發(fā)現(xiàn)此結(jié)論[19]。此外，在雞不同組織中，環(huán)狀RNA表達(dá)方式較多，這與哺乳動(dòng)物相同[20]。RNase R核酸外切酶消化處理試驗(yàn)、組織表達(dá)譜和亞細(xì)胞定位等試驗(yàn)證明雞circ_PLXNA1為穩(wěn)定、高豐度環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本，且主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。

研究表明，circRNAs可作為一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）與miRNAs結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。CircRNA-Cdr1as在體外抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，在體內(nèi)減緩腫瘤生長(zhǎng)。此外，circRNA-Cdr1as可直接與miR-135a結(jié)合并抑制其在膀胱癌中活性[21]。Liu等研究發(fā)現(xiàn)沉默circRNA_100367可抑制KYSE-150R細(xì)胞增殖和遷移，并降低KYSE-150R細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白（Wnt通路中的重要分子）表達(dá)，CircRNA_100367通過miR-217/Wnt3通路增強(qiáng)KYSE-150R細(xì)胞的放射抗性[22]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_28313敲低在體外顯著抑制RANKL+CSF1誘導(dǎo)的骨髓單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞內(nèi)破骨細(xì)胞分化，同時(shí)在體內(nèi)抑制卵巢切除（OVX）小鼠的骨吸收，circRNA_28313通過ceRNA機(jī)制解除miR-195a介導(dǎo)對(duì)CSF1的抑制，調(diào)節(jié)骨髓單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞中破骨細(xì)胞分化[23]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_101237吸附miR-490-3p增強(qiáng)MAPK1表達(dá)，顯著促進(jìn)NSCLC細(xì)胞系增殖、遷移和侵襲[24]。本研究通過Miranda預(yù)測(cè)到296個(gè)miRNA，選取前10個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。此外，使用miRDB和TargetScan預(yù)測(cè)靶基因，預(yù)測(cè)到549個(gè)能夠靶向miRNA基因，預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)表明雞circRNA_PLXNA1影響更為廣泛。

GO和KEGG可較好注釋基因功能。GO和KEGG富集分析功能發(fā)現(xiàn)雞circRNA_PLXNA1預(yù)測(cè)的靶基因富集ErbB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路以及Hedgehog信號(hào)通路。李媛等發(fā)現(xiàn)豬肌內(nèi)脂質(zhì)差異circRNA的靶基因主要富集于MAPK通路、細(xì)胞因子受體相互作用等通路[25]，與本研究結(jié)果一致。Lee等發(fā)現(xiàn)sinigrin（2-丙烯基硫代葡萄糖苷）通過AMPK、MAPK和ACC激活具有抗脂肪生成作用，表明sinigrin通過AMPK和MAPK信號(hào)通路抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞早期脂肪生成[26]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)GDF5可以改善胰島素敏感性和預(yù)防代謝綜合征，皮下白色脂肪組織中的適應(yīng)性產(chǎn)熱可介導(dǎo)GDF5在小鼠中的肥胖抵抗效應(yīng)，并導(dǎo)致部分p38 MAPK信號(hào)通路激活，說明GDF5可通過p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)白色脂肪組織產(chǎn)熱[27]。在Hedgehog信號(hào)通路中，主要脂肪酶Brummer（Bmm）作用于Smoothened（Smo）下游，促進(jìn)脂肪分解，從而促進(jìn)三酰甘油（TAG）分解，Hedgehog信號(hào)通路激活導(dǎo)致脂質(zhì)積累減少[28]。在家蠶幼蟲模型中，在接受特定Hedgehog信號(hào)通路拮抗劑環(huán)巴胺處理的家蠶中觀察到脂肪細(xì)胞分化增強(qiáng)和脂肪細(xì)胞尺寸增加，表明Hedgehog信號(hào)通路抑制脂肪形成[29]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)抑制Hedgehog信號(hào)通路活性促進(jìn)白色脂肪組織褐變，而其激活則減弱去甲腎上腺素誘導(dǎo)褐變[30]。雞circ_PLXNA1和預(yù)測(cè)的靶基因也富集許多與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)通路，表明雞circ_PLXNA1可能通過調(diào)控靶基因表達(dá)間接參與雞脂肪細(xì)胞分化。

4 結(jié)論

本研究在細(xì)胞水平鑒定和驗(yàn)證雞circ_PLXNA1，結(jié)果顯示雞circ_PLXNA1是主要在心臟和肝臟中表達(dá)且定位在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本?；谙嚓P(guān)試驗(yàn)并結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，推測(cè)雞circ_PLXNA1可能通過調(diào)控靶基因間接參與脂肪細(xì)胞分化。本研究為進(jìn)一步探究circ_PLXNA1對(duì)雞脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控及更深層次了解circRNA在雞脂肪細(xì)胞分化過程中的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)。