枇杷葉提取物通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路減輕脂多糖誘導的肺細胞損傷

陳寶磊，高映春，吳磊

作者單位：遼陽市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科，遼寧 遼陽111000

急性肺損傷是一種感染、創(chuàng)傷等重癥疾病誘發(fā)的肺部炎癥及通透性增加綜合征，其主要病理特征為肺泡毛細血管損傷、肺水腫、肺不張等。目前急性肺損傷發(fā)病機制尚未闡明，發(fā)病率逐年上升。脂多糖（LPS）引起的急性肺損傷是導致病人死亡的重要原因之一，LPS 屬于革蘭陰性桿菌細胞外膜成分之一，因而如何抑制LPS 誘導的肺損傷是提高治療效果的重要環(huán)節(jié)［1］。許多天然植物提取物具有抗炎、抗氧化等作用，并可用于抗肺損傷，例如，桑白皮水提取物、百合固金湯、黃原腐酚可減輕LPS誘導的急性損傷［2-4］。枇杷屬于薔薇科植物，三萜酸類等是其主要活性成分，研究表明枇杷葉提取物具有抗炎、抗氧化等作用［5］。但關于其對急性肺損傷的治療效果及可能作用機制尚未闡明。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路在多種疾病發(fā)生過程中發(fā)揮調(diào)控作用，信號通路活化后可減輕LPS誘導的急性肺損傷［6］。因此，本研究于2019年6月至2020 年7 月采用LPS 誘導的A549 細胞建立肺損傷模型，探討枇杷葉提取物對LPS誘導的A549細胞增殖、凋亡及氧化應激的影響，探究其對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549 購自美國ATCC 細胞庫；PI3K/Akt 信號通路抑制劑LY294002 購自美國Selleck Chemicals 公司；枇杷葉購自亳州市紳楓堂藥業(yè)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；噻唑藍（MTT）試劑購自上海信帆生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗人磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）抗體購自美國Abcam 公司；兔抗人B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）抗體購自美國CST 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。HM-SY96 酶標儀購自山東食安生物科技有限公司；FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 枇杷葉提取物［7］：稱取50 g 枇杷葉，研磨成粉狀，加入70%乙醇溶解，55 ℃超聲波提取1 h（料液比1∶10），過濾后重復提取濾渣1 次，合并兩次濾液，應用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器抽取真空減壓回收，精密稱取提取物適量，加入二甲基亞砜溶液中溶解，制備濃度為10 g/L的母液，根據(jù)實驗需求稀釋濃度為1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L的溶液。

A549 細胞置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后分別加入含有濃度為10 g/L LPS 的培養(yǎng)液干預24 h［8］，記為LPS 組。同時將正常培養(yǎng)的細胞作為對照組。分別加入含有不同濃度（1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L）的枇杷葉提取物與含有濃度為10 g/L LPS 的培養(yǎng)液干預24 h，分別記為LPS+枇杷葉-L組、LPS+枇杷葉-M組、LPS+枇杷葉-H 組。后續(xù)實驗中添加PI3K/Akt 信號通路抑制劑LY294002 處理細胞，分別加入含濃度為40μmol/L LY294002［9］、4 mg/L 枇杷葉提取物與10 g/L LPS 的培養(yǎng)液干預24 h，記為LPS+枇杷葉-H+LY294002組。

1.2.2 MTT 檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期A549 細胞接種于96 孔板（5×103個/孔），按照“1.2.1”分組處理后，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT 試劑（20微升/孔），于37 ℃、體積分數(shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清，加入二甲基亞砜（150 微升/孔），充分混勻后室溫振蕩孵育5 min，應用酶標儀檢測各孔吸光度。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取各組A549

細胞加入預冷PBS 洗滌后棄上清，隨后在細胞沉淀中加入500μL Binding Buffer，分別加入5μL Annex?in V-FITC 與5μL PI，充分混勻后孵育10 min，于1 h內(nèi)應用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.4 檢測SOD、LDH、丙二醛的含量 取各組

A549細胞培養(yǎng)上清液，采用2，4-二硝基苯肼顯色法檢測LDH 的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用反復凍融法裂解細胞，用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD 的含量，用硫代巴比妥酸法檢測丙二醛的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達 取各組A549 細胞加入400 μL RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度后蛋白變性，SDS-PAGE 電泳反應分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜（分離的蛋白凝膠）后進行封閉2 h（5%脫脂奶粉），孵育一抗稀釋液（1∶1 000）24 h（4 ℃）后洗滌，孵育二抗稀釋液（1∶5 000）1 h（室溫）后使用等滲緩沖鹽溶液洗滌，暗室內(nèi)曝光顯影后應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 枇杷葉提取物對LPS誘導A549細胞活性的影響以下五組吸光度比較，F(xiàn)=263.62，P<0.001。與對照組（1.38±0.06）比較，LPS 組（0.55±0.02）吸光度降低（P<0.05）；與LPS 組比較，LPS+枇杷葉-L 組（0.56±0.02）吸光度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），LPS+枇杷葉-M 組（0.86±0.03）、LPS+枇杷葉-H 組（1.18±0.05）吸光度升高（P<0.05），且LPS+枇杷葉-H組吸光度高于LPS+枇杷葉-M組（P<0.05）。

2.2 枇杷葉提取物對LPS 誘導A549 凋亡的影響與對照組比較，LPS 組凋亡率升高，Bax 蛋白水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低（均P<0.05）；與LPS 組比較，LPS+枇杷葉-M 組、LPS+枇杷葉-H 組凋亡率降低，Bax 蛋白水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高，且LPS+枇杷葉-M 組、LPS+枇杷葉-H 組各指標間比較均差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見圖1、表1。

圖1 枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549凋亡蛋白表達的影響

表1 枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549凋亡的影響/± s

表1 枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549凋亡的影響/± s

注：Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關X。①與對照組相比，P<0.05。②與LPS組相比，P<0.05。③與LPS+枇杷葉-L組相比，P<0.05。④與LPS+枇杷葉-M組相比，P<0.05。

重復次數(shù)Bax蛋白0.13±0.01 0.70±0.04①0.70±0.04 0.47±0.04②③0.24±0.02②③④192.37<0.001組別對照LPS LPS+枇杷葉-L LPS+枇杷葉-M LPS+枇杷葉-H F值P值99999凋亡率/%6.41±0.25 27.43±1.00①27.33±0.90 22.24±0.81②③14.78±0.49②③④440.50<0.001 Bcl-2蛋白0.83±0.04 0.16±0.01①0.17±0.01 0.36±0.02②③0.69±0.03②③④450.34<0.001

2.3 枇杷葉提取物對LPS誘導A549氧化應激的影響與對照組比較，LPS 組SOD 的含量降低，LDH、丙二醛的含量升高；與LPS 組比較，LPS+枇杷葉-M組、LPS+枇杷葉-H組SOD的含量升高，LDH、丙二醛的含量降低（均P<0.05），見表2。

表2 枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549氧化應激的影響/± s

表2 枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549氧化應激的影響/± s

注：SOD為超氧化物歧化酶，LDH為乳酸脫氫酶。①與對照組相比，P<0.05。②與LPS組相比，P<0.05。③與LPS+枇杷葉-L組相比，P<0.05。④與LPS+枇杷葉-M組相比，P<0.05。

組別對照LPS LPS+枇杷葉-L LPS+枇杷葉-M LPS+枇杷葉-H F值P值丙二醛/（μmol/g）121.55±3.17 424.46±6.48①424.21±7.55 277.94±6.90②③156.30±3.26②③④1 839.89<0.001重復次數(shù)99999 SOD/（U/L）81.66±5.36 14.65±1.06①14.64±1.11 36.84±2.08②③70.97±3.03②③④329.66<0.001 LDH/（U/L）242.86±6.09 875.92±15.01①874.62±13.69 641.95±9.81②③365.47±7.02②③④2 115.63<0.001

2.4 枇杷葉提取物對LPS 誘導A549 中PI3K/Akt信號通路的影響與對照組比較，LPS 組p-PI3K、p-Akt 蛋白水平降低；與LPS 組比較，LPS+枇杷葉-M組、LPS+枇杷葉-H 組p-PI3K、p-Akt 蛋白水平升高（均P<0.05），見圖2、表3。

圖2 枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路的影響

表3 枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路的影響/± s

表3 枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路的影響/± s

注：p-PI3K為磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶，p-Akt為磷酸化蛋白激酶B。①與對照組相比，P<0.05。②與LPS組相比，P<0.05。③與LPS+枇杷葉-L組相比，P<0.05。④與LPS+枇杷葉-M組相比，P<0.05。

p-Akt 0.51±0.04 0.09±0.01①0.09±0.01 0.25±0.02②③0.42±0.03②③④175.74<0.001組別對照LPS LPS+枇杷葉-L LPS+枇杷葉-M LPS+枇杷葉-H F值P值重復次數(shù)99999 p-PI3K 0.60±0.04 0.13±0.01①0.12±0.01 0.32±0.01②③0.54±0.03②③④268.50<0.001

2.5 LY294002 對枇杷葉提取物處理的LPS 誘導A549細胞活性和凋亡的作用與LPS+枇杷葉-H 組比較，LPS+枇杷葉-H+LY294002 組吸光度降低，凋亡率升高，Bax 蛋白水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低（均P<0.05），見圖3、表4。

表4 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路抑制劑LY294002可逆轉(zhuǎn)枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549活性和凋亡的作用/± s

表4 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路抑制劑LY294002可逆轉(zhuǎn)枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549活性和凋亡的作用/± s

注：Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關X。

組別LPS+枇杷葉-H LPS+枇杷葉-H+LY294002 t值P值Bax 0.24±0.02 0.63±0.04 15.10<0.001重復次數(shù)99吸光度1.18±0.05 0.65±0.03 15.74<0.001凋亡率/%14.87±0.50 24.50±0.87 16.62<0.001 Bcl-2 0.39±0.03 0.25±0.02 6.72 0.003

圖3 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路抑制劑LY294002可逆轉(zhuǎn)枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549凋亡蛋白表達的影響

2.6 LY294002 對枇杷葉提取物處理的LPS 誘導A549細胞氧化應激的影響與LPS+枇杷葉-H 組比較，LPS+枇杷葉-H+LY294002 組SOD 的含量降低，LDH、丙二醛的含量升高（均P<0.05），見表5。

表5 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路抑制劑LY294002可逆轉(zhuǎn)枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549氧化應激的影響/± s

表5 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路抑制劑LY294002可逆轉(zhuǎn)枇杷葉提取物對脂多糖（LPS）誘導的人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549氧化應激的影響/± s

注：SOD為超氧化物歧化酶，LDH為乳酸脫氫酶。

組別LPS+枇杷葉-H LPS+枇杷葉-H+LY294002 t值P值丙二醛/（μmol/g）156.90±4.08 376.09±7.28 45.49<0.001重復次數(shù)99 SOD/（U/L）71.00±3.41 23.09±1.59 22.06<0.001 LDH/（U/L）367.40±6.53 765.60±11.36 52.64<0.001

3 討論

急性肺損傷是臨床常見的一種急危重癥，中藥在治療急性肺損傷方面具有一定作用，黃酮類櫻草素可改善LPS誘導的急性肺損傷［10］。黃芪素通過誘導血紅素加氧酶-1 減輕脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷［11］。但其對急性肺損傷的作用機制尚未闡明。

枇杷葉提取物具有抗炎、抗病毒等作用，并可保護心腦血管，但關于其作用機制尚未闡明［12］。本研究結(jié)果顯示，A549 細胞經(jīng)LPS 誘導后細胞活力降低，而枇杷葉提取物可明顯提高細胞活力，且顯示劑量依賴關系，隨著枇杷葉提取物劑量增加細胞活力明顯提高，提示枇杷葉提取物可解除LPS 誘導的A549 細胞增殖抑制。Bcl-2 屬于抗凋亡蛋白，Bax 屬于促凋亡蛋白，其表達水平升高可激活線粒體途徑從而誘導細胞凋亡［13］。本研究結(jié)果顯示，LPS 誘導的A549 細胞凋亡率升高，并可促進Bax 表達及抑制Bcl-2 表達，枇杷葉提取物可明顯降低細胞凋亡率，并可抑制Bax 表達及促進Bcl-2 表達，提示枇杷葉提取物可明顯抑制LPS誘導的A549細胞凋亡，且呈劑量依賴性?；钚匝蹩烧T導支氣管上皮細胞釋放炎性因子從而誘導肺組織炎癥反應，還可造成線粒體膜損傷從而引起細胞凋亡，SOD 可清除氧自由基從而減輕機體氧化損傷，丙二醛是脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物，并可作為脂質(zhì)過氧化的指標，LDH 含量升高可引起氧化損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，LPS 誘導的A549 細胞中SOD 的含量降低，LDH、丙二醛的含量升高，而枇杷葉提取物可明顯提高SOD 的含量及降低LDH、丙二醛的含量，且枇杷葉提取物不同劑量氧化應激指標間比較差異有統(tǒng)計學意義，提示枇杷葉提取物可抑制LPS 誘導的A549 細胞氧化應激從而抑制細胞凋亡。

甘草酸通過活化PI3K/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途徑改善LPS 誘導的急性肺損傷［15］。人參皂苷Rg3 可通過激活PI3K/AKT/mTOR途徑減輕LPS 誘導的急性肺損傷［16］。PI3K/AKT 信號通路活化可抑制急性肺損傷中細胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥反應［17］。PI3K/AKT 信號通路激活劑SC79 可減輕d-Gal/LPS 誘導的肝損傷［18］。本研究結(jié)果顯示，LPS 誘導的A549 細胞中p-PI3K、p-Akt 蛋白水平降低，枇杷葉提取物可明顯提高p-PI3K、p-Akt蛋白水平，且呈劑量依賴性，提示枇杷葉提取物可能通過激活PI3K/Akt信號通路從而減輕LPS誘導的急性肺損傷。同時本研究結(jié)果顯示，添加PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002 后可明顯降低LPS 誘導A549 細胞活力，提高細胞凋亡率，并可降低SOD 的含量及提高LDH、丙二醛的含量，提示抑制PI3K/Akt 信號通路可明顯逆轉(zhuǎn)枇杷葉提取物對LPS 誘導A549細胞增殖、凋亡及氧化應激的作用。

綜上所述，枇杷葉提取物可以對LPS 誘導的A549 細胞的增殖、凋亡及氧化應激產(chǎn)生影響，而PI3K/Akt信號通路活化同樣可抑制急性肺損傷中細胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等，因此推測枇杷葉提取物可以通過PI3K/Akt 信號通路對肺損傷中細胞凋亡等進程產(chǎn)生治療作用。枇杷葉提取物可通過激活PI3K/Akt 信號通路而解除LPS 誘導的A549 細胞增殖抑制及氧化應激引起的細胞凋亡，減輕LPS 誘導的細胞損傷，為進一步揭示枇杷葉提取物治療急性肺損傷的分子機制提供依據(jù)。