外泌體微小RNA作為肺癌標志物的研究進展

劉洪霞，唐荔，尚觀勝

作者單位：1四川大學華西醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科MICU，四川 成都610041；

2四川大學華西護理學院，四川 成都610041；

3成都市第七人民醫(yī)院胸外科，四川 成都610041

目前肺癌死亡人數(shù)在全世界癌癥相關死亡病人中占據首位［1］，病理分型主要為非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大類。近年來，隨著肺癌研究的長足進展和治療手段的多樣化，肺癌病人總生存期有所上升，但總體預后相較于其他惡性腫瘤仍有一定差距。肺癌的早期診治可延長患者生存周期，改善預后，但隱匿性強、無特異性表現(xiàn)，早期診斷較為困難，發(fā)病就診時大部分已處于中晚期，治療效果不佳。生物標志物是反映惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要物質，因此監(jiān)測合理高效的標志物對早期診治惡性腫瘤、增加患者生存率具有重要意義［2-3］。

外泌體是一種雙層膜結構的小囊泡，大小在30～200 nm 之間，起源于內體。幾乎所有哺乳動物的細胞都能分泌外泌體，外泌體內容物包括蛋白質、脂類物質、mRNAs、微小RNA（microRNAs，miR）等，它們可以反映來源細胞的生物學特點［4］。在正常和病理情況下，細胞通過合成并排出外泌體參與相應靶細胞的調控，包括腫瘤的生成和進展［5］。

腫瘤來源的外泌體扮演信息傳遞的重要角色，將腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境的多種細胞成分緊密聯(lián)系在一起。一方面，外泌體可通過改造間質細胞、免疫細胞等介導腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。另一方面也可以進入血液和淋巴循環(huán)中到達其他器官，參與腫瘤的侵襲和遠處轉移。近年來，越來越多的研究表明腫瘤外泌體中的microRNAs是介導外泌體功能的關鍵分子［6-8］。本研究介紹外泌體的生成和作用，并重點綜述外泌體microRNAs在肺癌診斷中的最新研究進展。

1 外泌體的生成和作用

外泌體的生成過程涉及兩次胞膜內陷以及胞內多泡體的生成。第一次胞膜內陷形成一杯狀結構，其內含有膜表面蛋白和細胞外環(huán)境中的可溶性蛋白、脂類物質、代謝產物和胞外液體等，進一步形成早期內體［9］，早期內體成熟為晚期內體并最終產生多泡體。多泡體進行第二次胞膜內陷，這一過程完成后可以生成多個管腔內囊泡。通常情況下，多泡體有兩個結局，一是被降解，需要溶酶體或者自噬體的參與；二是成為外泌體，通過與胞膜融合，進而釋放管腔內囊泡而完成［10-11］。在人體的多種體液中均可檢測到外泌體的存在，如唾液、血液、尿液、乳汁、腦脊液和胸腔積液等。細胞的類型、生長環(huán)境、細胞狀態(tài)等都會影響外泌體的生成。

外泌體的主要作用是信息傳遞。靶細胞可通過大泡飲、網格蛋白依賴、受體配體結合等方式將外泌體攝入［12-13］。外泌體釋放內容物引起靶細胞表型和分子機制方面的改變，從而參與調控多種生物學過程，如新生血管形成、體液和細胞免疫反應、組織再生，以及腫瘤的產生和進展。腫瘤細胞釋放的外泌體可被血管細胞攝取，導致血管生成相關的多個基因表達上調，增加腫瘤內血管數(shù)量，促進腫瘤體積增大［14］。Hoshino 等［15］研究發(fā)現(xiàn)部分器官的特異性細胞可攝取來源于腫瘤的外泌體，為腫瘤轉移創(chuàng)造適宜的微環(huán)境。

從生成過程可看出外泌體大小不一，其內含有的蛋白、脂類物質和RNAs 種類也不同，因此人們觀察到的靶細胞反應是外泌體這一混合群體的共同作用。隨著單個外泌體檢測技術的發(fā)展，對其研究會更為精確。如香港科技大學團隊開發(fā)了基于液滴的單個外泌體酶聯(lián)免疫計數(shù)技術，可以精確定量腫瘤病人血清中的特異性外泌體，有望用于腫瘤早期診斷［16］。

2 外泌體中microRNAs參與肺癌發(fā)生發(fā)展

肺癌細胞來源外泌體可在腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境組分之間傳遞信息，參與肺癌發(fā)生發(fā)展的多個方面。

（1）作用血管內皮細胞，增加新生血管數(shù)量。在低氧條件下，肺癌細胞產生的外泌體數(shù)量增加，miR-23a 分子表達顯著升高，直接抑制靶分子脯氨酸羥化酶（PHD）1 和PHD2，引起內皮細胞中缺氧誘導因子（HIF）-1α 富集，進而促進肺癌組織血管化。miR-23a 還可作用于緊密連接蛋白ZO-1，調節(jié)血管通透性［17］。Liu 等［18］通過體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)惡性轉化的人支氣管上皮細胞可將富含miR-21 的外泌體轉移至血管內皮細胞，增加新生血管數(shù)量，此研究發(fā)現(xiàn)外泌體可促進新生血管形成，為惡性腫瘤的發(fā)展與侵襲創(chuàng)造有利條件。

（2）作用肺癌細胞，促進腫瘤生長、轉移和耐藥。研究發(fā)現(xiàn)肺癌外泌體miR-96 的表達與腫瘤分期和侵襲呈正性相關［19］。肺癌外泌體能夠促進細胞生長和遷移，如向細胞內轉染miR-96抑制劑則可顯著抑制腫瘤生長。He 等［20］經高通量測序分析發(fā)現(xiàn)來源于高侵襲性肺癌細胞的外泌體中miR499a呈高表達。miR499a可作用于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路，促進腫瘤細胞生長和遷移。Qin 等［21］體外建立了順鉑耐藥的肺癌細胞系，對其外泌體進行microRNAs表達譜芯片分析。在耐藥細胞釋放的外泌體中，有11 個microRNAs 的含量顯著增加，有31 個含量顯著降低，其中下降最為明顯者為miR-100-5p（下降達75%）。在小鼠腫瘤內注射miR-100-5p，使用順鉑治療35 d后，小鼠腫瘤體積顯著增大，顯示外泌體中miR-100-5p 的缺失可增加細胞對順鉑的耐受性，在促進腫瘤細胞生長、轉移及耐藥過程中具有重要作用。

（3）作用免疫細胞，影響免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)低氧條件下人類非小細胞肺癌細胞株IGR-Heu分泌的外泌體能教化自然殺傷細胞（NK），使NK 細胞腫瘤殺傷作用減弱［22］。這一過程中miR-23a 可作為免疫抑制因子，降低CD107a 分子表達，當抑制miR-23a 時，CD107a 分子表達受限，腫瘤外泌體對NK 細胞的抑制作用消失，顯示外泌體與腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制機制密切相關。

這些研究表明腫瘤細胞可以通過釋放外泌體與其他細胞通信，改造細胞表型或分子特征，形成適宜生長的微環(huán)境。microRNAs 作為重要的轉錄后調節(jié)方式，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個過程［23］。

3 外泌體中microRNAs在肺癌診斷中的作用

外泌體microRNAs 可從多種體液中分離提取，在液體診斷方面具有較好的應用前景，是目前多種腫瘤和免疫相關疾病診斷標志物的研究熱點。在肺癌方面，Rabinowits 等［24］最早于2009 年比較了27例肺癌病人和9 例對照病人血清外泌體中12 種mi?croRNAs 的表達情況，microRNAs 在肺癌病人血清中高表達，對照組基本檢測不到，提示microRNAs可作為肺癌標志物。2013年，Cazzoli等［25］對10例肺腺癌、10 例肺肉芽腫和10 例健康吸煙者外泌體中742種microRNAs 進行檢測，并使用軟件建模，挑選出4種可用于篩查肺腺癌和肺肉芽腫的microRNAs組合（miR-378a、miR-379、miR-139-5p 和miR-200-5p），經分析靈敏度為97.5%，特異度為72.0%。采用6 種microRNAs 組合（miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100和miR-154-3p）進一步診斷肺腺癌和肺肉芽腫，結果靈敏度為96%，特異度為60%。Cazzoli 等［25］表示此研究與低密度CT 掃描相比假陽性率顯著降低，但仍需進一步評估以確認此模型對更大樣本群的預測能力。2017 年，溫州醫(yī)科大學Jin等［26］對46例一期非小細胞肺癌病人和42例健康志愿者的血漿外泌體進行miRNA 測序分析，并在60例獨立臨床樣本中進行驗證，發(fā)現(xiàn)肺腺癌和鱗癌特異性高度相關的microRNAs。2019年南京大學研究人員采用深度測序法比較10 例對順鉑有反應和10例藥物抵抗者的microRNAs表達，其中80種microRNAs 的含量增加或者降低都在2 倍以上，6 種差異最大：miR-425-3p，miR-1273h 和miR-4755-5 表達升高，miR-9-5p，miR-146a-5p 和miR-215-5p 表達降低［27］。miR-425-3p 通過靶向AKT1 上調自噬水平，miR-425-3p 高表達可作為順鉑低反應性和無進展生存期的生物標志物［27］。與健康人相比，非小細胞肺癌病人在疾病早期和進展期中，血清中miR-126 水平升高，提示其可以作為生物標志物以篩查非小細胞肺癌［28］。研究還發(fā)現(xiàn)進展期的非小細胞肺癌患者血清中miR-146a-5p 的表達水平可用于預測腫瘤復發(fā)，miR-146a-5p表達水平低的病人腫瘤復發(fā)率高，可能與miR-146a-5p 可以增強肺癌細胞對順鉑的敏感性有關［29］。Wu 等［19］用定量PCR 法分析56 例肺癌病人和56 例對照組病人肺組織和血清中miR-96的表達水平，發(fā)現(xiàn)肺癌病人miR-96均為高表達，且表達水平與腫瘤分期呈正相關態(tài)勢，提示miR-96高表達可作為肺癌標志物。

支氣管肺泡灌洗液中也可分離出外泌體。韓國科學家從13 例肺腺癌病人和15 例肺間質病人支氣管肺泡灌洗液中分離出外泌體，采用商用探針試劑盒對外泌體中6 種microRNAs 進行檢測（miR-7，miR-21，miR-126，Let-7a，miR-17，和miR-19）并用定量PCR 驗證，結果發(fā)現(xiàn)肺腺癌病人灌洗液中miR-126 和Let-7a 水平顯著升高；進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-126 在肺腺癌灌洗液中高表達，顯示其可作為一種早期肺腺癌診斷標志物［30］。Wang 等［31］采用深度測序法對肺腺癌、結核及其他良性肺部病變產生的胸腔積液外泌體進行檢測，共發(fā)現(xiàn)171個miRNAs表達量差異有統(tǒng)計學意義，其中miR-205-5p，miR-483-5p，miR-375，miR-200c-3p，miR-429，miR-200b-3p，miR-200a-3p，miR-203a-3p，miR-141-3p 在肺腺癌胸腔積液中高表達。

上述研究均表明血清、支氣管肺泡灌洗液或胸腔積液中的microRNAs 可以作為肺癌的分子標志物。

4 展望

肺癌的不良預后與多種因素有關，一方面是目前缺乏行之有效的治療策略，另一方面大部分病人就診時已處于晚期。外泌體中的microRNA 作為基于人體體液的生物標志物，在腫瘤診斷方面具有巨大的潛力，對其深入探討已成為近期腫瘤研究的熱點之一。

外泌體的雙層脂膜結構使其可以長時間保存，從而保證其內容物microRNAs 的完整性，進一步擴展了microRNAs的研究領域。肺癌細胞分泌的外泌體可反映其母細胞的生物學特性，能夠提供與腫瘤相關的特異性microRNAs 表達譜。目前microRNAs作為肺癌診斷標志物的研究有兩項挑戰(zhàn)，一是如何簡單快速的從血液或支氣管肺泡灌洗液中分離出外泌體并提取microRNAs用于后續(xù)高通量或者定量PCR 檢測，另一個是如何找到特異有效的microR?NAs 組合作為早期肺癌診斷的標志物，特別是有基礎疾病如糖尿病、高血壓的病人。解決這些問題需依賴大規(guī)模肺癌病人血清或肺泡灌洗液等標本和更為精確的microRNAs定量檢測。

雖然面臨各種挑戰(zhàn)，但隨著外泌體研究技術的不斷發(fā)展，特別是單個外泌體流式分析技術的出現(xiàn)，未來microRNAs 有望成為簡便特異可靠的肺癌診斷方法。