并殖吸蟲實驗室檢測方法研究進展

楊榮笙，汪天平

安徽省寄生蟲病防治研究所，安徽 合肥 230601

并殖吸蟲病（paragonimiasis）是因食入并殖吸蟲感染期囊蚴而引起的急、慢性寄生蟲病，成蟲主要寄生于人或哺乳動物的肺內(nèi)，俗稱肺吸蟲?。╨ung fluke disease），它是一種重要的自然疫源性人獸共患病。目前，已報道的并殖吸蟲有50多種[1]，其中，廣泛分布于亞洲且具有致病性的蟲種主要有衛(wèi)氏并殖吸蟲（P. westermani）、斯氏并殖吸蟲（P.skrjabini）、異盤并殖吸蟲（P.heterotremus）和宮崎并殖吸蟲（P.miyazakii）。并殖吸蟲病呈世界性流行，全球約有2 300 萬并殖吸蟲感染者[2]。我國是并殖吸蟲病重度流行區(qū)，27 個省份均有過病例報道[1]。并殖吸蟲病臨床癥狀往往缺乏特異性，極易誤診與漏診[3]，因此準(zhǔn)確、及時地檢測并殖吸蟲尤為重要。目前，常用的并殖吸蟲實驗室檢測主要有病原學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)方法，本文就并殖吸蟲的實驗室檢測方法研究進展綜述如下。

1 病原學(xué)方法

在感染者糞便或痰液中查出并殖吸蟲蟲卵即可確診并殖吸蟲病[1,4]。并殖吸蟲寄生在宿主的肺部，可因病變破損經(jīng)咳嗽隨痰液帶出蟲卵，或因吞咽痰液隨糞便排出蟲卵。痰檢蟲卵多采用NaOH消化離心沉淀法，糞檢蟲卵常用生理鹽水直接涂片法、自然沉淀法和Kato-Katz 法，但對感染度較低或異位寄生的患者，上述方法敏感度較低[5-7]，對蟲卵的主觀判斷也要求實驗人員具有一定的專業(yè)知識及經(jīng)驗。Slesak 等[8]采用Ziehl-Neelsen 染色法檢測慢性咳嗽患者痰液中并殖吸蟲蟲卵，敏感性為76.9%。Ziehl-Neelsen 染色法可使并殖吸蟲蟲卵在藍色背景下呈黃色至棕色，便于鑒定，經(jīng)濟安全[9]，是較為理想的診斷方法。

2 免疫學(xué)方法

免疫應(yīng)答是機體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要手段。感染并殖吸蟲后宿主體內(nèi)可檢測到特異性抗原或抗體[10]，無論是蟲體產(chǎn)生的抗原或是機體免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體均有很大的診斷價值。隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷進步，并殖吸蟲免疫學(xué)診斷或檢測的效率也在不斷提高，在臨床與科研工作中被廣泛應(yīng)用。

2.1 皮內(nèi)試驗 皮內(nèi)試驗（intradermal test,IDT）是用特異性抗原進行皮內(nèi)注射，根據(jù)皮膚反應(yīng)判斷人體內(nèi)有無相應(yīng)抗體。Song 等[11]采用IDT 法檢測并殖吸蟲抗體，測得陽性率為26.35%（248/941），再對其中128 名IDT 陽性者的痰液進行并殖吸蟲蟲卵檢測，僅 4 例發(fā)現(xiàn)蟲卵。Zhang 等[12]對三峽庫區(qū) 724 名受試者進行并殖吸蟲IDT 和酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），陽性率分別為14.36%和7.46%，ELISA 檢測陽性者IDT檢測均為陽性。IDT法操作簡便快速，靈敏度高，無需特殊儀器，常用于并殖吸蟲病早期篩查。但該檢測方法假陽性率較高，不適于療效評估，且會對受試者皮膚造成一定損害[13-15]。IDT 檢測結(jié)果需結(jié)合其他方法綜合判定。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA 是將特異性抗原包被于固相載體，與待測抗體及酶標(biāo)抗抗體反應(yīng)，顯色后可測得感染者體內(nèi)相應(yīng)抗體含量。目前，已利用并殖吸蟲的成蟲抗原和排泄分泌抗原建立相應(yīng)的ELISA 檢測方法，特異性與靈敏度較高，但仍存在一定的交叉反應(yīng)[16-17]。在ELISA 基礎(chǔ)上建立的Dot-ELISA（Dot-enzyme-linked immunosorbent assay）檢測技術(shù)操作更為簡便快速、抗原用量更少。用并殖吸蟲幼蟲排泄分泌（excretory-secretory，ES）抗原作為診斷抗原的Dot-ELISA敏感性可達100%，且與其他寄生蟲無交叉反應(yīng)[18]。隨著基因重組技術(shù)的逐步發(fā)展，并殖吸蟲重組主要蟲卵抗原[19]、斯氏并殖吸蟲重組半胱氨酸蛋白酶（paragonimus skrjabinicysteine protease，PsCP）[20]建立的ELISA檢測技術(shù)也取得了較好效果。ELISA 法操作較為簡單，敏感性與特異性較高，常用于臨床檢驗，但IgG水平檢測結(jié)果無法區(qū)分近期和既往感染情況。

2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法（western blot, WB） WB的基本原理為將經(jīng)過PAGE分離的并殖吸蟲蛋白質(zhì)組分轉(zhuǎn)移到固相載體上，與相應(yīng)抗體及抗抗體特異性結(jié)合，陽性反應(yīng)可出現(xiàn)肉眼可見的條帶，從而檢測出目的蛋白。Ahn 等[21]用免疫印跡法分別檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲11 種不同半胱氨酸蛋白酶（paragonimus westermanicysteine proteases，PwCPs），敏感性為38.4%～84.5%，特異性為87.2%～100.0%。同樣有實驗表明，肌紅蛋白在免疫印跡法檢測并殖吸蟲中也表現(xiàn)出了極高的診斷價值[22]。Fischer等[23]建立了可識別出分子量為34 kDa 和21/23 kDa 診斷蛋白的并殖吸蟲抗原IgG蛋白印跡法，靈敏度高，并可動態(tài)監(jiān)測到經(jīng)吡喹酮治療成功的患者血清抗體減弱的趨勢。WB 法廣泛應(yīng)用于蛋白水平表達的檢測，常應(yīng)用于科研試驗中，操作較為耗時，對技術(shù)人員與實驗室要求較高。

2.4 免疫層析試驗（immunochromatographic test,ICT） ICT的基本原理為待測抗原或抗體通過與層析材料中的反應(yīng)試劑特異性結(jié)合，陽性反應(yīng)可在層析條上的特定區(qū)域出現(xiàn)肉眼可見的檢出線。Wang等[24]采用純化的兔抗人IgG 與膠體金偶聯(lián)，檢測并殖吸蟲感染者血清抗體，以并殖吸蟲ES抗原包被硝基纖維素膜作為捕獲線，重組葡萄球菌蛋白A 制備控制線，試驗敏感性和特異性可達94.4%和94.1%。Sadaow 等[25]利用并殖吸蟲ES 抗原開發(fā)的快速檢測并殖吸蟲免疫層析試劑盒，敏感性和特異性達97.9%和87.6%。ICT 法操作簡單、快速，不需要特殊設(shè)備或訓(xùn)練有素的操作人員，結(jié)果讀取簡單，適用于基層篩查與臨床的“床邊檢驗”，但該法仍存在一定的交叉反應(yīng)[25]。

2.5 斑點金免疫滲濾試驗（dot immunogold filtration assay, DIGFA） DIGFA 是將并殖吸蟲特異性抗原呈點狀加在固相載體上，與待測抗體及金標(biāo)抗抗體特異性結(jié)合后，陽性反應(yīng)可呈紅色斑點狀。馬安等[26]利用并殖吸蟲成蟲粗提液抗原建立檢測并殖吸蟲特異性IgG4 方法，敏感性為100.0%，特異性為95.2%，交叉反應(yīng)低，對患者的療效評估有診斷價值。DIGFA 法在并殖吸蟲流行區(qū)的現(xiàn)場應(yīng)用上，特異性和敏感性較高，與常規(guī)ELISA 平行對照檢測結(jié)果具有較好的一致性[27-28]。DIGFA 法無需實驗儀器，操作非常簡單，肉眼可判斷結(jié)果，適合現(xiàn)場應(yīng)用。但該法易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，臨床應(yīng)用較少[29]。

2.6 免疫組化技術(shù)（immunohistochemistry techniqu,IHC） 免疫組化技術(shù)的基本原理為利用抗原抗體反應(yīng)與組織化學(xué)的呈色反應(yīng)相結(jié)合，在組織細胞原位標(biāo)記特異性抗體，對相應(yīng)抗原進行定位、定性和定量檢測。Curtis 等[22]利用免疫組織學(xué)定位技術(shù)鑒別出可能寄生于人體的并殖吸蟲分泌或定位于寄生蟲-宿主界面的蛋白質(zhì)，如重組半胱氨酸蛋白酶和肌紅蛋白。實驗顯示并殖吸蟲病患者對重組并殖吸蟲副肌球蛋白有抗體反應(yīng)[30]。免疫組化技術(shù)特異性強、敏感性高，從細胞水平檢測并殖吸蟲抗原。但非特異性染色問題需要注意，結(jié)果判定的主觀性較強，技術(shù)程序較為復(fù)雜。

3 分子生物學(xué)方法

20世紀(jì)70年代以來，分子生物學(xué)檢測技術(shù)在并殖吸蟲感染的診斷中發(fā)揮了巨大的作用，標(biāo)本蟲期以及保存方法的不同均不會影響分子遺傳的研究結(jié)果[31-33]。

3.1 DNA 序列分析 DNA 序列分析是根據(jù)識別基因堿基序列鑒定所測物種。并殖吸蟲的核基因ITS2（ribosomal second internal transcribed spacer）、線粒體基因CO1（partial mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1）、NADH 脫氫酶亞基ND1（nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 1）和逆轉(zhuǎn)錄子Rn1（retrotransposon 1）等基因序列均被證實可有效應(yīng)用于并殖吸蟲檢測[34-38]，CO1 比ITS2更適合于區(qū)分亞種關(guān)系[39]。Rosa等[40]對不同并殖吸蟲的基因組進行了測序、組裝、注釋和比較，為并殖吸蟲的研究提供了寶貴資源。傳統(tǒng)的DNA 序列分析需基于PCR 檢測技術(shù)，對擴增產(chǎn)物凝膠電泳后進行測序。新型的由4 種酶催化的DNA 焦磷酸測序技術(shù)則無需電泳，操作更為簡便快速。Tantrawatpan等[41]利用DNA 焦磷酸測序技術(shù)成功測定并殖吸蟲ITS2基因序列。

3.2 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR） 并殖吸蟲ITS2和CO1序列常被用作PCR 擴增引物設(shè)計的靶基因。Chang 等[42]對1 例并殖吸蟲病患者痰中的蟲卵進行PCR 擴增測序，得到并殖吸蟲完整核糖體DNAITS2 基因序列從而確診。趙昕等[43]根據(jù)衛(wèi)氏并殖吸蟲ITS2 序列設(shè)計的PCR 引物特異性強，靈敏度達100 pg/μL。PCR 法操作簡便，商品化試劑盒較多，在實驗室與臨床應(yīng)用廣泛[44-46]，但本法需要特定的儀器設(shè)備，反應(yīng)過程中需注意非特異性擴增。

3.3 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR） RT-qPCR在PCR的基礎(chǔ)上利用檢測熒光信號在反應(yīng)體系中的變化達到實時監(jiān)測整個反應(yīng)過程的目的，檢測結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)曲線圖呈現(xiàn)。趙昕等[43]用一套針對衛(wèi)氏并殖吸蟲ITS2 序列的引物成功在不同并殖吸蟲中鑒別出衛(wèi)氏并殖吸蟲，靈敏度可達0.1 pg/μL，高于PCR 法三個數(shù)量級。Tantrawatpan 等[47]將實時熒光共振能量轉(zhuǎn)移PCR 和熔化曲線分析相結(jié)合，用一套引物和針對28SrDNA區(qū)域的熒光標(biāo)記雜交探針建立了異盤并殖吸蟲特異性檢測新方法，靈敏度為每100 mg 糞便中檢出1個并殖吸蟲蟲卵。RT-qPCR 法使分子生物學(xué)檢測技術(shù)邁入了反應(yīng)過程可視化階段，給定量研究帶來了極大便利，但此法成本較高，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制較為重要。

3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP） LAMP 法 是 21 世紀(jì) 初發(fā)明的一種僅用水浴鍋即可現(xiàn)場快速擴增核酸的高通量檢測方法。Chen 等[48]建立了針對ITS2 基因的LAMP 技術(shù)，可有效檢測不同樣本中的衛(wèi)氏并殖吸蟲，靈敏度為1×10-8ng/μL，比常規(guī)PCR法敏感100倍。Zhuo 等[49]利用衛(wèi)氏并殖吸蟲Rn1 序列設(shè)計引物，在LAMP 的基礎(chǔ)上建立了并殖吸蟲LAMP-LFD（橫向流動探針）快速檢測方法，靈敏度為2.7 fg/L，同比PCR 法靈敏度為27 fg/L。LAMP 法高效快速，操作較為簡單，較其他分子學(xué)診斷技術(shù)相比，不需要特殊儀器，適合現(xiàn)場應(yīng)用，但不適于長鏈DNA 的擴增。

4 結(jié) 語

并殖吸蟲實驗室檢測方法的研究與建立一直在不斷發(fā)展和進步。病原學(xué)檢查雖然費時費力、檢出率不高，但在現(xiàn)場應(yīng)用中仍不可或缺；免疫學(xué)檢查IgG抗體雖無法評判療效，但抗原、抗體的正確選擇仍可給感染早期、輕度、寄生部位隱蔽的并殖吸蟲患者提供檢測參考；分子生物學(xué)檢查雖對實驗環(huán)境和人員要求較高，但其精準(zhǔn)的檢測能力從基因?qū)用嫔铣尸F(xiàn)了并殖吸蟲的生物多態(tài)性，為其確診提供了依據(jù)，是未來診斷發(fā)展的方向?？傮w來看，開發(fā)先進的、標(biāo)準(zhǔn)化的以及敏感性高、特異性強的實驗室檢測方法，是今后的研究方向[50]。目前，需要因時因地制宜，綜合選擇不同的并殖吸蟲實驗室檢測方法，以提高檢測能力[51]。