侵襲性NK細(xì)胞白血病的實(shí)驗(yàn)室特征及診療進(jìn)展

劉梅 張瑞 毛亞菲 高占璽 史敏

侵襲性NK細(xì)胞白血病(ANKL)是一種少見類型的惡性淋巴細(xì)胞增殖性疾病[1-3]，于1986年首次報(bào)道[4]，屬于系統(tǒng)性NK細(xì)胞腫瘤，臨床過程中普遍以惡性NK細(xì)胞浸潤(rùn)和侵襲性為特點(diǎn)。NK細(xì)胞顯著的形態(tài)為大顆粒細(xì)胞(LGL)，占淋巴樣細(xì)胞的1/3。ANKL通常存在于東亞地區(qū)，在亞洲人群中發(fā)病率較高，主要見于青年至中年成人，中位發(fā)病年齡為30～40歲，男女比例未見明顯異常[5,6]。ANKL病程短，病情進(jìn)展迅速，主要侵犯的部位為骨髓、外周血、肝臟、脾臟和淋巴結(jié)等，皮膚受累罕見。約25% 的患者伴類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，有些合并脾大、中性粒細(xì)胞減少 ，與 Felty’s綜合征非常相似。有時(shí)患者可合并純紅細(xì)胞再生障礙性貧血(PRCA)、骨髓增生異常綜合征、神經(jīng)性疾病、實(shí)體腫瘤、內(nèi)分泌疾病及意義未明的巨球蛋白血癥等。少部分患者可反復(fù)出現(xiàn)多種自身免疫性血細(xì)胞減少。臨床特征主要包括數(shù)周或數(shù)月發(fā)熱、乏力、盜汗、食欲減退、體重減輕、黃疸等全身癥狀，通常合并噬血細(xì)胞增多癥(HPS)、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)等，最終導(dǎo)致多器官臟器功能衰竭。ANKL的診斷方法發(fā)展緩慢，這在很大程度上是由于疾病的罕見程度以及臨床和病理表現(xiàn)的復(fù)雜性。另一方面缺乏ANKL特定的免疫表型或分子生物學(xué)特征。大多數(shù)早期研究借以流式細(xì)胞術(shù)和常規(guī)核型分析等輔助手段，為ANKL的診斷提供一套系統(tǒng)的診斷方法。雖然這些技術(shù)手段很強(qiáng)大，但并沒有發(fā)現(xiàn)特定的生物標(biāo)志物，尤其是對(duì)于NK細(xì)胞腫瘤。近年來，DNA和RNA水平的高通量基因組分析極大地促進(jìn)了我們對(duì)ANKL的認(rèn)識(shí)，并為潛在的靶向治療提供了新的依據(jù)[7]。大量研究表明，ANKL與Epstein-Barr病毒(EBV)密切相關(guān)[8,9]，只有10%的ANKL病例EBV陰性[10]，治療過程中對(duì)多種化療方案反應(yīng)不佳，中位生存期一般短于1年[11,12]。本文結(jié)合近年ANKL的診療進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)述。

1 ANKL的病因與發(fā)病機(jī)制

ANKL是一種與逆轉(zhuǎn)錄EBV感染密切關(guān)聯(lián)的成熟NK細(xì)胞增殖性疾病。有學(xué)者研究認(rèn)為，定量監(jiān)測(cè)EBV含量可以有效衡量患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷以及評(píng)估中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的情況，經(jīng)有效的方案治療或者造血干細(xì)胞移植后，患者體內(nèi)檢測(cè)EBV含量會(huì)明顯下降[13,14]。雖然ANKL與EBV感染有確定的聯(lián)系，但EBV陰性的ANKL也得到了廣泛認(rèn)識(shí)[15-17]。與EBV陽性ANKL相比，EBV陰性病例多發(fā)于老年患者中，并且在亞洲和非亞洲人群中的發(fā)病率相等。EBV陽性與EBV陰性的ANKL在形態(tài)學(xué)或免疫表型上沒有差異[15]。在部分ANKL病例中，EBV的缺失可能會(huì)導(dǎo)致診斷延誤，從而造成不良的臨床后果。在評(píng)估ANKL的潛在病例時(shí)，不應(yīng)將EBV陰性狀態(tài)作為排除診斷的標(biāo)準(zhǔn)。

近年來，高通量研究的進(jìn)展使人們對(duì)發(fā)病機(jī)制有了深刻的認(rèn)識(shí)。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的研究，已經(jīng)闡明了ANKL 的分子改變，并且鑒定了幾種信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的功能障礙。ANKL的分子異?？煞譃槿箢悾篔AK/STAT通路激活、表觀遺傳失調(diào)、TP53和DNA修復(fù)受損[7]。這些高通量數(shù)據(jù)也提供了潛在的治療靶點(diǎn)，有望改善ANKL患者的治療和預(yù)后。有臨床研究對(duì)大量ANKL患者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，基因組測(cè)序、細(xì)胞因子譜檢測(cè)等多組學(xué)綜合分析，并通過功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了ANKL重要的分子生物學(xué)特征是異常激活了Janus激酶(JAK)/轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)-轉(zhuǎn)錄因子(MYC)-生物合成軸，ANKL患者中NK細(xì)胞呈現(xiàn)顯著的STAT3磷酸化激活，使c-MYC高表達(dá)，STAT3通路激活顯著增高炎性因子IL-10水平，所以激活STAT3磷酸化和高表達(dá)c-MYC對(duì)于ANKL細(xì)胞的生存增殖起著關(guān)鍵作用，STAT3通路信號(hào)調(diào)節(jié)c-MYC轉(zhuǎn)錄程序，同時(shí)STAT3通路信號(hào)激活和c-MYC轉(zhuǎn)錄也是維持ANKL核苷酸代謝和糖酵解途徑中所必需的，所以ANKL基因的改變和激活I(lǐng)L-10下游的主要靶點(diǎn)是JAK/STAT-MYC-生物合成通路。Huang等[18]研究表明，STAT3信號(hào)可以通過產(chǎn)生過量IL-10或通過其他未知的機(jī)制被激活，而不受基因突變的影響。這一觀察得到了免疫組織化學(xué)分析的支持，免疫組織化學(xué)分析表明，與對(duì)照組相比，在JAK/STAT野生型和突變的NAKL病例中，其骨髓中的腫瘤細(xì)胞中磷酸化STAT3(p-STAT3；指示激活)顯著增加。在表觀遺傳學(xué)方面，Huang等[18]發(fā)現(xiàn)了包括TET2(28%)、CREBBP(21%)和MLL2(21%)在內(nèi)的表觀遺傳修飾相關(guān)基因的突變。相比之下，在結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤，鼻型(ENKTL)[19]中常見的DDX3X和BOCR在ANKL中突變較少，同時(shí)還存在TET2、CREBBP和GFI1突變[20]。另外，Huang等[18]在34%的ANKL病例中發(fā)現(xiàn)了TP53突變。Dufva等[21]在14名患者中發(fā)現(xiàn)1例TP53突變。Hussein等[7]的研究中6例患者中發(fā)現(xiàn)有3例TP53突變。

Gao等[22]研究發(fā)現(xiàn)，ANKL的突變啟動(dòng)因子是轉(zhuǎn)錄活化因子5(STAT5)-N642H，同時(shí)ANKL患者中還存在一個(gè)常見指標(biāo)，HACE1CpG-177位點(diǎn)超甲基化，而且這些患者EBV均為陽性。 Nicolae等[23]研究顯示EBV陰性的患者體內(nèi)也存在STAT3的突變以及不同程度轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的激活，這種突變提示與源自NK/T大顆粒淋巴細(xì)胞白血病(LGL)中NK細(xì)胞的LGL類似。EBV陰性的患者經(jīng)有效方案治療后可以緩解，也有少數(shù)患者在較短時(shí)間內(nèi)會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)現(xiàn)象[10,23]，然而，也有學(xué)者報(bào)道EBV陰性的患者可以有較長(zhǎng)的生存期[24]，Ko等[10]證明EB病毒陰性的ANKL預(yù)后較EB病毒陽性的ANKL患者預(yù)后好，二者的中位生存時(shí)間分別為11.5個(gè)月和21.5個(gè)月，但例數(shù)有限，分別為2例和14例。

ANKL病程終末期通常會(huì)出現(xiàn)全血細(xì)胞減少，高三酰甘油血癥，低纖維蛋白血癥，血清鐵蛋白增高，NK細(xì)胞活性降低，符合診斷其噬血細(xì)胞綜合征(HPS)進(jìn)而發(fā)生彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)。噬血細(xì)胞綜合征(HPS)的主要原因是其感染EBV的腫瘤細(xì)胞上調(diào)表達(dá)了腫瘤壞死因子(TNF)，TNF再與干擾素(INF)及其他細(xì)胞因子共同作用激活了巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。還發(fā)現(xiàn)ANKL的患者中具有高血清水平的CXCR1,CCR5和可溶性Fas配體，啟動(dòng)了趨化因子系統(tǒng)在其細(xì)胞浸潤(rùn)中的作用。

2 ANKL的診斷及實(shí)驗(yàn)室特征

2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)分類[25]標(biāo)準(zhǔn)在淋巴組織腫瘤分類中將結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤、慢性NK細(xì)胞淋巴增殖性疾病(CLPD-NK)及ANKL一起劃分為成熟NK細(xì)胞腫瘤。目前對(duì)ANKL的診斷國內(nèi)外尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，骨髓中NK細(xì)胞的異常大顆粒淋巴細(xì)胞比例沒有明確的規(guī)定，但其較公認(rèn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)?；谌齻€(gè)因素：實(shí)驗(yàn)室特征(細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫表型)，侵犯部位和臨床特征[11,26]。

若外周血人工分類或骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查中異常腫瘤NK細(xì)胞含量極低且異型性明顯，流式細(xì)胞學(xué)檢查難以確診時(shí)，有研究學(xué)者Gao 等[26]對(duì)浸潤(rùn)實(shí)體器官的ANKL患者提出應(yīng)當(dāng)及時(shí)對(duì)受累實(shí)體組織器官如淋巴結(jié)、肝、脾進(jìn)行病理活檢，這對(duì)明確診斷也有重要意義。隨著ANKL的進(jìn)展，骨髓中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。在一項(xiàng)研究中，隨著疾病的進(jìn)展進(jìn)行評(píng)估時(shí)，異常NK細(xì)胞的檢測(cè)率從86.8%增加到97.4%[29]。因此，最好從血液、骨髓或其他組織部位獲取多個(gè)標(biāo)本，在未檢測(cè)到陽性且臨床懷疑患者患有ANKL等腫瘤時(shí)進(jìn)行連續(xù)的流式細(xì)胞學(xué)分析。

所以為了明確ANKL的診斷，強(qiáng)調(diào)要對(duì)臨床表現(xiàn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫表型、骨髓病理活檢、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等多項(xiàng)檢查進(jìn)行綜合分析。

3 ANKL的鑒別診斷

ANKL需要和結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤、慢性NK細(xì)胞淋巴增殖性腫瘤(CLPD-NK)、大顆粒T淋巴細(xì)胞白血病(T-LGLL)進(jìn)行鑒別。

3.1 結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤 根據(jù)原發(fā)部位的來源不同，分為鼻區(qū)和非鼻區(qū)兩種亞型，由于二者的細(xì)胞形態(tài)和免疫表型相同，在2008年WHO分類標(biāo)準(zhǔn)中被命名為同一種疾病，即結(jié)外(鼻型)NK/T細(xì)胞淋巴瘤(ENKL)。形態(tài)學(xué)和免疫表型與ANKL有重疊。二者均與EBV相關(guān)，在東亞人群中發(fā)病率增加，并且顯示缺乏T細(xì)胞受體基因重排。然而，臨床表現(xiàn)存在一定差異：(1)ANKL(約40歲)的年齡中位數(shù)小于ENKL(約50歲)。(2)鼻型(NKTCL)通常首發(fā)癥狀是局部的，如鼻衄、鼻腔潰爛及腫物等，病變相對(duì)局限，但在進(jìn)展期會(huì)播散至其他器官；非鼻型NKCL 其原發(fā)病變部位通常是皮膚、消化道、 肺、腦、腎上腺、乳腺、睪丸及軟組織，較少浸潤(rùn)骨髓。(3)無論治療如何，ANKL預(yù)后都非常差，而ENKL的局部病變可能對(duì)化療或放療有關(guān)聯(lián)[30]。罕見的ENKL患者可能發(fā)展為侵襲性，播散性疾病，并且可能與ANKL無法區(qū)分[30]。目前關(guān)于ANKL和ENKL是否實(shí)際代表同一疾病的不同階段，也存在爭(zhēng)議。然而專家共識(shí)將ANKL作為一種獨(dú)特的疾病實(shí)體?；蚪M雜交比較也發(fā)現(xiàn)ANKL和ENKL之間有顯著性差異：前者發(fā)現(xiàn)7p，17p和1q增加，且頻率顯著，而ENKL缺乏這些發(fā)現(xiàn)，并且常常表現(xiàn)出6q丟失[31]。

3.2 慢性NK細(xì)胞淋巴增殖性腫瘤(CLPD-NK) 大多數(shù)患者沒有癥狀，無發(fā)熱，無肝、脾及淋巴結(jié)腫大，不明原因的外周血成熟NK細(xì)胞增多(>2×109/L)，持續(xù)>6個(gè)月。發(fā)病的中位年齡為60歲，且人種之間沒有差異，呈惰性的臨床過程。通常EBV檢測(cè)為陰性。在外周血和骨髓中，常有異常NK細(xì)胞浸潤(rùn)，與T-LGL細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)相同，但通常CLPD-NK的免疫表型：(1)CD56弱陽性或者陰性，胞質(zhì)CD3陽性，表面CD3陰性，顆粒酶B及M陽性；(2)可以出現(xiàn)抗原表達(dá)的減弱或者缺失(CD2、CD7、CD57、CD161)及CD5、CD8的異常表達(dá)；(3)NK細(xì)胞的ki-67表達(dá)水平低[6]；(4)殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)不對(duì)稱表達(dá)。CLPD-NK預(yù)后多良好，極少數(shù)有惡化，如若之前有慢性活動(dòng)性EBV感染史、蚊蟲叮咬過敏史或局部種痘水皰史等等EBV感染的NK細(xì)胞的患者病情易于加重及轉(zhuǎn)化，這些患者應(yīng)該密切隨訪觀察。

4 ANKL的治療

ANKL的預(yù)后非常不利，中位生存期為兩個(gè)月。ANKL的最佳初始化療方案尚未確定。目前對(duì)ANKL進(jìn)行的前瞻性臨床試驗(yàn)極少，現(xiàn)在對(duì)治療的認(rèn)識(shí)大都是基于化療方法和臨床結(jié)果的小型臨床研究。由于NK細(xì)胞腫瘤細(xì)胞高表達(dá)多藥耐藥基因MDR1編碼的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白(糖蛋白P)，對(duì)于采用傳統(tǒng)化療方案左旋門冬酰胺酶聯(lián)合(CHOP)反應(yīng)療效不佳，而選擇不受糖蛋白P影響的甲氨蝶呤及左旋門冬酰胺酶(L-ASP)，并具有抗NK細(xì)胞腫瘤活性的作用已被證實(shí)，Yamaguchi等[32]應(yīng)用左旋門冬酰胺酶、甲氨蝶呤、地塞米松、異環(huán)磷酰胺及依托泊苷組成了SMILE方案治療異常NK腫瘤細(xì)胞，目前臨床試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ期療效較好。然而基于SMILE方案會(huì)引起血常規(guī)全血細(xì)胞減少，造成嚴(yán)重的骨髓抑制等不良反應(yīng)，所以該方案不推薦用于初治的ANKL患者[33]。而初治ANKL患者建議糖皮質(zhì)激素聯(lián)合左旋門冬酰胺酶治療，待病情好轉(zhuǎn)后再給予SMILE方案減量治療。然而，其總體預(yù)后仍然很差。在化療(包括左旋門冬酰胺酶)后達(dá)到完全緩解(CR)的患者很少在沒有進(jìn)一步治療的情況下存活超過一年[7]。

為了改善患者預(yù)后，Ishida等[11]研究發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞移植比化療能有效的延長(zhǎng)ANKL患者總生存期但由于病例數(shù)極少，隨訪時(shí)間短，此治療方案是否為ANKL最佳的治療方法尚待大樣本病例研究證實(shí)。最近，國際血液與骨髓移植研究中心對(duì)進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植的21例ANKL患者進(jìn)行了療效評(píng)價(jià)，大多數(shù)患者在進(jìn)行移植前接受了含L-天冬酰胺酶的化療，結(jié)果顯示其2年無進(jìn)展生存期和總體生存期分別為20%和24%[34]，該研究表明，異基因造血干細(xì)胞移植可以持久地控制部分在移植前達(dá)到CR的ANKL患者。有研究指出臍帶血是一種很好的替代干細(xì)胞來源[35]。但是從長(zhǎng)期隨訪來看，76%的患者發(fā)生死亡，其主要死因?yàn)锳NKL。曾有一項(xiàng)包含13例以結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤和侵襲性NK細(xì)胞白血病為特征的全國性前瞻性臨床研究，證明接受移植的患者預(yù)后較好[36]。因此，在特定的ANKL患者進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植可能有助于延長(zhǎng)某些患者的生存期，但是成功率的報(bào)道相當(dāng)有限。

治療方案選擇L-天冬酰胺酶(L-ASP)方案為基礎(chǔ)的SMILE方案，后期有條件再配合造血干細(xì)胞移植，是ANKL推薦治療方案?；熤屑尤隠-天冬酰胺酶的化學(xué)療法已顯示出改善效果[11]。L-天冬酰胺酶處理有助于提高存活率，對(duì)于各種含L-天冬酰胺酶的方案，如SMILE(地塞米松，甲氨蝶呤，異環(huán)磷酰胺，依托泊苷和L-天冬酰胺酶)，AspaMetDex(L-天冬酰胺酶，甲氨蝶呤和地塞米松)或VIDL(依托泊苷，異環(huán)磷酰胺，地塞米松和L-天冬酰胺酶)，目前還沒有研究比較這些治療方案的效果。

對(duì)正常NK細(xì)胞以及來自NK細(xì)胞腫瘤的細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序和藥物敏感性分析，可以更好地評(píng)估NK細(xì)胞對(duì)靶向治療的易感性。 bcl2抑制劑在臨床環(huán)境中有潛在的治療適用性，Dufva等[21]報(bào)告了其他有效藥物如熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑、Polo樣激酶(PLK)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑以及組蛋白去乙?；敢种苿?，同時(shí)也表明NK細(xì)胞對(duì)JAK和HSP90抑制的敏感性主要是由于抑制了IL-2誘導(dǎo)的JAK/STAT激活。對(duì)患者來源的異種移植物進(jìn)行體外藥物篩選的特異性靶向治療很有希望為ANKL患者的治療提供另一種思路。另外有研究提出ANKL的幾個(gè)預(yù)后因素：如患者年齡，血清乳糖脫氫酶水平和血清總膽紅素水平[39]來評(píng)估患者預(yù)后狀況，但都沒有得到驗(yàn)證。

綜上所述，ANKL 是一種罕見的致命性惡性腫瘤，臨床癥狀復(fù)雜且缺乏特異性細(xì)胞遺傳學(xué)和克隆性標(biāo)記。盡管ANKL患者的預(yù)后不佳，隨著時(shí)間的推移，我們對(duì)ANKL的認(rèn)識(shí)進(jìn)展緩慢，但骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的早期發(fā)現(xiàn)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室其他檢查及臨床資料綜合分析，以及分子生物學(xué)方面取得的實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，有助于本病早期診斷,積極控制并發(fā)癥，防止疾病進(jìn)一步惡化，制定有效的治療方案可以提高患者的生存期，應(yīng)引起廣大醫(yī)師和實(shí)驗(yàn)室工作人員的重視。隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)NK細(xì)胞白血病量身定做的治療相關(guān)的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)以及對(duì)ANKL發(fā)病機(jī)制致癌通路如JAK/STAT的深入探究，為今后研究開發(fā)并尋找新的有效防治藥物提供了新思路。