淺談基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)在體外藥物肝毒性評(píng)價(jià)中的研究進(jìn)展

張陽(yáng) 阮海文 邵文桂 竇德虎 王靜 張雪峰

關(guān)鍵詞：質(zhì)譜技術(shù);代謝組學(xué);體外藥物肝毒性;細(xì)胞模型

【中圖分類號(hào)】 O657.63 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A ? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2021）02--02

藥物毒性（drug hepatotoxicity，本文簡(jiǎn)稱DH）評(píng)價(jià)在藥物研發(fā)過(guò)程中屬于一個(gè)關(guān)鍵性的環(huán)節(jié)，藥物毒性反應(yīng)中，肝臟為其靶器官，常見(jiàn)于外源性物質(zhì)與相關(guān)代謝物中，對(duì)肝臟的損傷較大，可至功能障礙與紊亂[1]。從對(duì)臨床藥物試驗(yàn)失敗和撤回警告的原因中分析，得知藥物誘導(dǎo)性肝損傷的危害最大。有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，受藥物誘導(dǎo)性肝損傷影響，藥物早期研發(fā)便終止的比例約有14%左右[2]。因此，必須重視DH的評(píng)價(jià)工作，及早發(fā)現(xiàn)具有相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的藥物，促進(jìn)藥物研發(fā)的成功性。

藥物暴露對(duì)細(xì)胞的功能結(jié)構(gòu)均有著一定影響，甚至還會(huì)使得細(xì)胞代謝時(shí)的內(nèi)源性代謝物失衡，細(xì)胞便會(huì)響應(yīng)毒物或其他刺激，加劇毒性反應(yīng)的發(fā)生。從而可知，直接反應(yīng)藥物毒性還可選擇細(xì)胞代謝表型變化作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。在代謝組學(xué)之下，對(duì)生物樣品分子的質(zhì)量進(jìn)行了有效分析，發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量低于1000u時(shí)，便可完成毒性損傷情況的反應(yīng)，對(duì)生物標(biāo)志物和毒性機(jī)制的發(fā)現(xiàn)均有推測(cè)意義。細(xì)胞代謝組學(xué)自身的優(yōu)勢(shì)極為顯著，價(jià)格低廉，且易把控，有著良好的重復(fù)性，在DH體外評(píng)價(jià)中得到了廣泛應(yīng)用。而質(zhì)譜技術(shù)也有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，經(jīng)1次檢測(cè)便可得到代謝物的諸多信息，例如峰強(qiáng)度/面積、精確質(zhì)荷比、特征離子、同位素分布等等[3]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用后，還將彰顯出良好的靈敏度、分離度，且其重現(xiàn)性也較為明顯，對(duì)代謝組的定量分析極為有著積極作用，數(shù)據(jù)庫(kù)還能鑒定相關(guān)代謝物，在代謝組學(xué)研究中具有顯著的應(yīng)用價(jià)值[4]。質(zhì)譜成像又為新一代的分子影像技術(shù)，可在相關(guān)的生物樣品中提取諸多的內(nèi)外源代謝物和藥物信息。在質(zhì)譜技術(shù)之下，能夠反應(yīng)藥物刺激后出現(xiàn)的時(shí)空改變，在DH研究中具有良好的可行性，應(yīng)用價(jià)值高?，F(xiàn)本文將基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)予以分析，力求為體外DH評(píng)價(jià)提供相關(guān)參考，提升藥物研發(fā)質(zhì)量。

1 DH評(píng)價(jià)細(xì)胞模型

要想做好體外DH的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)，必須找到適宜的肝細(xì)胞類型，并選擇具有針對(duì)性的方法培養(yǎng)?，F(xiàn)將列舉常見(jiàn)的細(xì)胞類型，并總結(jié)其優(yōu)點(diǎn)與問(wèn)題。

1.1 DH評(píng)價(jià)的典型細(xì)胞類型

（1）原代肝細(xì)胞。該細(xì)胞主要來(lái)源于肝臟，屬其分離物，其中含有較高的轉(zhuǎn)運(yùn)體與藥物代謝酶，屬于DH細(xì)胞模型與外源性化合物代謝一種“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]。同時(shí)，在代謝酶的抑制和誘導(dǎo)中也有著一定價(jià)值，并且還能實(shí)現(xiàn)化合物的篩選。不過(guò)，常態(tài)化的二維單層培養(yǎng)模式時(shí)間較長(zhǎng)，肝細(xì)胞特異功能會(huì)在時(shí)間的延長(zhǎng)下不斷降低，功能維持時(shí)間僅在24-72小時(shí)左右。

（2）干細(xì)胞樣細(xì)胞。在干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究的不斷深入下，干細(xì)胞衍生肝細(xì)胞系逐漸走進(jìn)臨床，并在肝細(xì)胞模型中得到了大面積使用。該細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)，并可衍生干細(xì)胞，在肝毒性研究中應(yīng)用較廣。不過(guò)，現(xiàn)在臨床還未找到可直接分化為完全成熟肝細(xì)胞的干細(xì)胞，見(jiàn)其僅具有相應(yīng)的干細(xì)胞特征，進(jìn)行干細(xì)胞的誘導(dǎo)重建期間易發(fā)生分化異質(zhì)性與遺傳改變，和成熟人體肝細(xì)胞表型存在一定相似之處，但相似比例較為有限[6]。

（3）永生化肝細(xì)胞系。該細(xì)胞系的獲取方法主要有兩種，其一為經(jīng)原代肝細(xì)胞基因改造而成;其二便是在突變肝腫瘤中分離所得。永生化肝細(xì)胞系優(yōu)勢(shì)較為顯著，增值能力強(qiáng)，且具有無(wú)限性的特點(diǎn)，培養(yǎng)成本也較低?，F(xiàn)階段，臨床在研究肝腫瘤細(xì)胞系時(shí)常將HepG2與HepaRG兩種細(xì)胞作為主要細(xì)胞，分析原因，主要在于其細(xì)胞的穩(wěn)定性強(qiáng)，同時(shí)獲取容易，且具有無(wú)限增殖的能力[7]。另外，上述2種細(xì)胞皆具有較高的CYP450活性。不過(guò)，該細(xì)胞也存在一定的不足，由于其基因型較為單一，只可代表單個(gè)供體，在特異性人群中的適用性不高，在肝功能標(biāo)志物表達(dá)中則體現(xiàn)為較低水平。

1.2 細(xì)胞模型培養(yǎng)方式

相比體內(nèi)的肝組織，二維方式培養(yǎng)的肝細(xì)胞無(wú)通訊和空間的異質(zhì)性，并且也無(wú)細(xì)胞外基質(zhì)，無(wú)法進(jìn)行肝臟功能與其結(jié)構(gòu)的維持，穩(wěn)定性不足，在藥物毒性測(cè)試中的適用性不佳。而三維細(xì)胞模型同人體肝組織較為相似，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞表型相關(guān)性的改善，同時(shí)還可將模型生存能力得以延長(zhǎng)[8]。經(jīng)培養(yǎng)所得的三維結(jié)構(gòu)，會(huì)模擬藥物的滲透過(guò)程對(duì)DH評(píng)價(jià)有著積極作用，準(zhǔn)確度也較高。

目前，在研究的不斷深入下，也出現(xiàn)了新型的培養(yǎng)方式，如肝芯片、肝細(xì)胞球等，對(duì)抑制性微環(huán)境中的細(xì)胞模型有著積極作用。在過(guò)去的研究中，一般會(huì)選擇瓊脂糖進(jìn)行96孔板凝固凹形表面細(xì)胞球的培養(yǎng)，但當(dāng)下的3D打印技術(shù)發(fā)展較為成熟，瓊脂糖凹形微孔陣列模型的構(gòu)建將變得更加精準(zhǔn)，在3D肝細(xì)胞球形模型下，可使細(xì)胞表達(dá)出成熟的肝細(xì)胞標(biāo)志物，故藥物自身的敏感性將變得更高[9]。器官芯片也屬體外3D細(xì)胞模型，在制造微芯片后，能夠構(gòu)建出微流控細(xì)胞模型，可模擬器官和相關(guān)組織的生理環(huán)境。在此技術(shù)下，各種類型的細(xì)胞均能以空間方式一起培養(yǎng)，并不斷模擬出機(jī)體細(xì)胞中的微環(huán)境，價(jià)值顯著。

2基于質(zhì)譜技術(shù)的細(xì)胞代謝組學(xué)分析

2.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

（1）制備樣品。相比尿液、血漿等生物樣品的代謝組學(xué)研究，細(xì)胞樣品的前期處理十分復(fù)雜，包括細(xì)胞的采集、淬滅、破碎、提取等諸多環(huán)節(jié)[10]。因此，必須找到高效且科學(xué)的細(xì)胞樣本前期處理對(duì)策，確保細(xì)胞代謝物的穩(wěn)定和真實(shí)，奠定細(xì)胞代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ)。在李麗美等人[11]的研究中，在細(xì)胞樣品的前期處理中，加入了LC-MS技術(shù)，并進(jìn)行每一處理環(huán)節(jié)的優(yōu)化和改良，找到了最佳的樣本前期處理辦法，將細(xì)胞用PBS清洗2次后，再以零下40度的甲醇（60%）進(jìn)行細(xì)胞代謝淬滅（時(shí)間把控在5分鐘內(nèi)），隨后再以甲醇（80%）進(jìn)行細(xì)胞代謝物的提取。另外，該研究中還發(fā)現(xiàn)，收集批次與液氮凍存時(shí)間的差異，也會(huì)影響細(xì)胞代謝物，因此，在相關(guān)研究開(kāi)展過(guò)程中，盡量選擇同批次且培養(yǎng)條件相同的細(xì)胞樣本，以降低誤差。

（2）技術(shù)與方法。在代謝組學(xué)樣品分析過(guò)程中，色譜與質(zhì)譜技術(shù)是應(yīng)用頻率最高的。相比液相色譜，氣相色譜能夠減少基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)還可降低洗脫化合物離子抑制影響，色譜分離的重復(fù)性與分辨率也更佳，在低分子質(zhì)量揮發(fā)性化合物中有著顯著價(jià)值。而液相色譜技術(shù)能夠與極性代謝物相容，同時(shí)也被看作代謝組學(xué)分離的一種工具。一般情況下，LC-MS可經(jīng)親水作用色譜柱與反向柱進(jìn)行代謝物的極性分析。如若單一分離技術(shù)無(wú)法檢測(cè)時(shí)，可采取兩種分離機(jī)制的色譜進(jìn)行分離，對(duì)樣品分析的覆蓋范圍和分辨率均有明顯提升作用。

（3）采集數(shù)據(jù)。在進(jìn)行數(shù)據(jù)采集過(guò)程中，有靶向與非靶向分析兩種方法。非靶向代謝組學(xué)可實(shí)現(xiàn)樣品代謝物的全面分析，對(duì)新型生物標(biāo)志物有發(fā)現(xiàn)作用，不過(guò)處理時(shí)的工作量較大，效率不高。而靶向代謝組學(xué)則主要涉及已知代謝物組的測(cè)試。此外，也有研究提出把向與非靶向結(jié)合應(yīng)用的方法，在非靶向下可分析出代謝物的信息和離子特征，提升數(shù)據(jù)處理的準(zhǔn)確性與特異性，確保已知和未知代謝物均能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，重復(fù)性較高，且有著較寬的線性范圍，處理過(guò)程也相對(duì)簡(jiǎn)便。

（4）處理分析。使用代謝組學(xué)分析時(shí)會(huì)有大量數(shù)據(jù)產(chǎn)生，因此，必須做好相應(yīng)的分析與處理。首先，應(yīng)過(guò)濾噪聲，提取峰，解卷積峰，時(shí)間保留對(duì)齊等操作，確保原始數(shù)據(jù)能夠轉(zhuǎn)換，使得每一樣本中的離子、強(qiáng)度矩陣、峰面積等均可被檢出。隨后，再進(jìn)行數(shù)據(jù)的多元處理，結(jié)合代謝譜做到樣本聚類。另外，還可使用新型的統(tǒng)計(jì)方法與計(jì)算方法，將模型進(jìn)行優(yōu)化，例如，隨機(jī)森林、自組織映射，支持向量機(jī)等，得到貢獻(xiàn)值較大的差異變量。

2.2 基于質(zhì)譜成像技術(shù)體外細(xì)胞模型

在質(zhì)譜成像技術(shù)中，空間分辨代謝組學(xué)能夠?qū)⒋x物進(jìn)行有效保留，確保異質(zhì)性生物的空間位置信息能夠及時(shí)反饋，并擴(kuò)展至二維或三維層面中，完成生物代謝的研究。現(xiàn)階段，質(zhì)譜成像技術(shù)中的基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜、二次離子質(zhì)譜、解吸電噴霧電離質(zhì)譜等的使用頻率均較高。

基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜的分辨率通常處于50-100μm，最高能夠至微米狀態(tài)，對(duì)寬質(zhì)量范圍也有著良好的分析性，尤其在體積較小的生物組織樣本質(zhì)譜成像中的優(yōu)勢(shì)最為明顯[12]。針對(duì)多細(xì)胞腫瘤球（1μm直徑）內(nèi)的西妥昔單抗與哌立福新等藥物的代謝、滲透也有表征作用。

二次離子質(zhì)譜可展現(xiàn)出亞微米、納米等級(jí)別的空間圖片，分辨率較高，對(duì)單細(xì)胞、亞細(xì)胞質(zhì)譜研究均十分有益。相關(guān)研究便對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了有效分析，發(fā)現(xiàn)其在單細(xì)胞和相關(guān)代謝物中均具有可視化效果，不過(guò)以高能離子束轟擊樣本，便會(huì)有諸多的碎片離子產(chǎn)生，因此在使用該技術(shù)時(shí)，無(wú)法進(jìn)行內(nèi)源性代謝物的有效檢測(cè)，同時(shí)分子質(zhì)量超過(guò)1000u的化合物也不適用，靈敏度不高。

解吸電噴霧電離質(zhì)譜具有敞開(kāi)式特征，操作十分便捷，在分析樣本的過(guò)程中也不會(huì)依靠噴涂基質(zhì)，即使物質(zhì)的質(zhì)量區(qū)較低，也可獲得良好的檢測(cè)結(jié)果，可覆蓋較寬范圍內(nèi)的代謝物，且靈敏度高。有研究便進(jìn)行了該項(xiàng)技術(shù)的使用和研究，發(fā)現(xiàn)其可將內(nèi)源性分子空間分布可視化，缺氧微環(huán)境與腫瘤異質(zhì)性區(qū)域均可被表征，可知曉多細(xì)胞腫瘤球的中心壞死位與外周增殖范圍[13]。不過(guò)，該項(xiàng)技術(shù)的空間分辨率不高，僅處于100μm上下，因此在表征體外的3D細(xì)胞球時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一定的代謝差異，局限性明顯。

3總結(jié)展望

使用人源細(xì)胞進(jìn)行DH評(píng)價(jià)存在較多的優(yōu)勢(shì)之處，有著良好的可控性，且重復(fù)性高、時(shí)間短，并且還能降低動(dòng)物成本。肝細(xì)胞自身的選擇與培養(yǎng)方式在DH評(píng)價(jià)中具有顯著的作用價(jià)值，在3D細(xì)胞培養(yǎng)模型下，對(duì)其性能有提升作用，同時(shí)還可保證肝臟特異功能，使毒副反應(yīng)預(yù)測(cè)的結(jié)果更加準(zhǔn)確。僅憑單一的細(xì)胞模型無(wú)法實(shí)現(xiàn)體內(nèi)肝細(xì)胞狀況的有效分析，因此還需進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)模型的持續(xù)研究。

基于質(zhì)譜細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)與許多生物學(xué)技術(shù)均能實(shí)現(xiàn)有效融合，同時(shí)還可彌補(bǔ)其中的不足之處，在毒理學(xué)機(jī)制評(píng)價(jià)、生物標(biāo)志物評(píng)價(jià)中均具有顯著的應(yīng)用成效?，F(xiàn)階段，分析技術(shù)依舊面臨著諸多的機(jī)遇和挑戰(zhàn)，不足之處也十分明顯。而二維液相色譜分離技術(shù)能夠彌補(bǔ)1次分析中的覆蓋度與分辨率，同時(shí)還可促進(jìn)代謝物靈敏度的提升，效率也較高。當(dāng)質(zhì)譜成像技術(shù)出現(xiàn)后，又能實(shí)現(xiàn)藥物滲透、代謝等的反映，對(duì)細(xì)胞代謝組時(shí)空改變均有明顯益處，在可視化之下完成藥物、代謝物與細(xì)胞代謝的分析，價(jià)值顯著，同時(shí)也能幫助臨床理解藥物毒性與其機(jī)制。

把細(xì)胞代謝組學(xué)中得出的DH生物標(biāo)志物用在臨床中，同時(shí)進(jìn)行藥物安全性評(píng)價(jià)，雖然已經(jīng)取得了一定應(yīng)用成效，但其實(shí)際的安全性與效果也依舊還需持續(xù)研究和證實(shí)。若把計(jì)算機(jī)與代謝組學(xué)聯(lián)系起來(lái)，并進(jìn)行相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，將實(shí)現(xiàn)代謝信息的有效發(fā)現(xiàn)與使用，把毒性相關(guān)代謝變化與藥物結(jié)合后，還可幫助更好的預(yù)測(cè)DH風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合細(xì)胞模型與代謝組學(xué)后，對(duì)臨床DH的預(yù)測(cè)極為有益，目前已經(jīng)在中藥和化學(xué)藥DH中取得了一定成效，基于3D細(xì)胞模型，研制出體內(nèi)微環(huán)境的DH系統(tǒng)，將促進(jìn)生物藥物毒理學(xué)的發(fā)展，可為其提供新的方向和思路。

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