溶血磷脂酸對小鼠離體心臟缺血/再灌注損傷及TRPV1表達的影響

羅趙飛，吳 超，金世云，張 野，何淑芳

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)安徽普通高校重點實驗室，安徽 合肥 230601)

心臟缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)，常見于心肌梗死、心肺復(fù)蘇、冠脈介入治療、體外循環(huán)下心血管大手術(shù)等，長期缺血心肌在恢復(fù)血流灌注的同時，可能導(dǎo)致心肌損傷進一步加重，發(fā)生再灌注心律失常、心臟功能障礙，甚至心力衰竭[1-2]。盡管目前已有大量基礎(chǔ)與臨床研究探討缺血后心肌的保護策略與機制，但心肌IRI的分子機制仍未完全明確。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是細胞膜磷脂代謝的中間產(chǎn)物，也可由活化的血小板釋放產(chǎn)生，可在組織損傷或壞死過程中大量釋放[3]。已有研究表明，動脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征、心肌梗死等患者血漿和局部心肌組織中LPA水平顯著升高[4-6]，提示LPA與心肌缺血后損傷密切相關(guān)。然而，LPA在心肌IRI中發(fā)揮何種作用，目前尚不清楚。

Langendorff 裝置采用主動脈逆行灌注，灌流時主動脈中逆向灌流液可關(guān)閉主動脈瓣，逆行灌流含氧的 K-H 液，由冠狀動脈灌流心肌，灌流液經(jīng)冠狀靜脈竇從右心房、肺動脈和腔靜脈斷端流出。利用主動脈逆向插管技術(shù)灌流動物離體心臟的實驗，一直是對心臟功能進行生理、藥理學(xué)研究的重要手段，本方法排除了神經(jīng)和體液的控制，可直接觀察藥物或其他干預(yù)措施對心臟功能和冠脈流量的影響[7]。本研究利用Langendorff裝置進行離體心臟主動脈逆行灌注，通過停止灌流和恢復(fù)灌流含氧K-H液，模擬心臟的缺血/再灌注過程[8]，探討LPA對離體心臟缺血/再灌注損傷的影響。

1 材料

1.1 實驗動物♂ C57BL/6小鼠，SPF級，10周左右，體質(zhì)量(20～25)g，購買于蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司，許可證號：SYXK(蘇)2019-007。小鼠分籠飼養(yǎng)，可自由飲水及攝食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在(21～25)℃。

1.2 藥物與試劑溶血磷脂酸(LPA)(批號：857130，Sigma公司，美國)，HA130(批號：28770，MCE，中國)，氯化三苯基四氮唑(TTC)(批號：BCCD7384，Sigma公司，美國)，LPA ELISA檢測試劑盒(批號：OKCD02274，AVIVA SYSTEMS BIOLOGY)，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號：20210309，南京建成生物工程研究所，中國)。TRPV1批號：(455-8JD-08，NeuroMab，美國)，Phospho-TRPV1(批號：3119CA25，Thermo Fisher scientific，美國)，Bcl-2(批號：GR249198-85，abcam，美國),Bax(批號：11，Cell Signaling Technology，美國)。

1.3 實驗設(shè)備離體心臟Langendorff灌流系統(tǒng)，Power Lab信號采集系統(tǒng)(AD公司，澳大利亞)，全自動酶標儀設(shè)備及技術(shù)(Tecan M1000，瑞士)；Western blot電泳、轉(zhuǎn)膜設(shè)備(Bio-Rad，美國)及自動凝膠成像系統(tǒng)(上海天能)，體式顯微鏡(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，動物保溫系統(tǒng)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.4 K-H液的配制氯化鈉(NaCl，120 mmol·L-1)、氯化鉀(KCl，4.5 mmol·L-1)、氯化鈣(CaCl2，1.25 mmol·L-1)、氯化鎂(MgCl2.6H2O，1.2 mmol·L-1)、磷酸二氫鉀(KH2PO4，1.2 mmol·L-1)、碳酸氫鈉(NaHCO3，20 mmol·L-1)、無水葡萄糖(C6H12O6，10 mmol·L-1)。配制時氯化鈣及葡萄糖分別單獨用純水溶解，其他溶質(zhì)用純水充分溶解后，將氯化鈣溶液逐滴加入，葡萄糖溶液在臨用前配置并加入，配置好的溶液經(jīng)微孔濾膜過濾后使用，并預(yù)留100 mL放入4 ℃冰箱備用，使用前要將K-H液預(yù)充氧10 min。

1.5 離體心臟的制備及缺血/再灌注損傷模型的建立分離心臟前10 min，腹腔注射肝素 10 IU·g-1，稍后腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1，迅速斷頭處死，取出心臟，置于冰水混合K-H液中，在顯微鏡下進行主動脈插管，插管成功后立即懸掛于Langendorff灌注架上，逆行灌注K-H液，K-H液用95% O2和5% CO2混合氣進行預(yù)充平衡10 min，維持K-H液pH值7.35～7.45，灌注壓力為10.64 kPa，溫度37 ℃。操作完成后，待心臟穩(wěn)定后繼續(xù)灌注10 min，然后停止灌注30 min，再灌注60 min，即成功建立離體心臟缺血/再灌注損傷模型。

1.6 實驗分組將C57小鼠隨機分為4組，每組6只。Sham組心臟持續(xù)灌注100 min；IR組心臟穩(wěn)定10 min，然后停止灌注 30 min，再灌注60 min；IR+LPA組在缺血前和再灌注時分別給予含10 μmol·L-1外源性LPA的K-H液進行灌注10 min；HA130組麻醉前10 min腹腔注射1 μmol·L-1·g-1，然后進行IR。

1.7 心肌梗死體積測定每組各6只小鼠再灌注結(jié)束后取下心臟，放入-80 ℃冰箱凍20 min，將心臟取出置于小鼠心臟模具中，迅速切片，厚度為1 mm，每個心臟切5～6片，置于1%TTC溶液中，37 ℃(pH值7.4)孵育15 min后，放入4%多聚甲醛中浸泡固定12 h，然后進行掃描。ImageJ軟件計算全心體積與梗死區(qū)體積之比。

1.8 冠脈流出液中LDH濃度測定每個心臟分別留取基線(T0)、停止灌注即刻(T1)、再灌注即刻(T2)、再灌注10 min(T3)、再灌注30 min (T4)、再灌注60 min(T5)6個時間點的冠脈流出液0.5 mL，使用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒測量冠脈流出液中LDH水平。

1.9 血清及冠脈流出液中LPA濃度測定于再灌注即刻留取冠脈流出液0.5 mL置于-80 ℃保存，ELISA法測定冠脈流出液中LPA濃度；腹腔注射HA130后眼球取血0.5 mL，置離心機中12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液置于-80 ℃保存，ELISA法測定血清LPA濃度。

1.10 Western blot每組3只小鼠在再灌注結(jié)束后，取下心臟，預(yù)冷PBS沖洗。將心臟剪碎，使用勻漿機將心臟打成勻漿，加入裂解液后冰上裂解。充分裂解1 h后將勻漿液12 000 r·min-1的速度離心30 min，取上清液置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。BCA蛋白定量試劑盒測定570 nm處OD值進行蛋白定量。取適量上清液按1 ∶4加入上樣緩沖液，100 ℃加熱15 min。待冷卻后對蛋白質(zhì)進行12%SDS-PAGE凝膠電泳濃縮膠80 V,30 min，分離膠120 V,80 min。隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上200 mA恒流,120 min。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h。加入TRPV1(1 ∶1 000)、pTRPV1(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)一抗4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10 min，二抗采用山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)或山羊抗小鼠IgG(1 ∶10 000)室溫孵育60 min，TBST洗滌4次，每次10 min，采用化學(xué)發(fā)光法ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImageJ軟件計算蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死體積與Sham組相比，IR組心肌組織梗死體積增加(P<0.05,Fig 1)；與IR組相比，加入外源性LPA后心肌組織梗死體積增大(P<0.05,Fig 1)；與IR組相比，給與LPA合成抑制劑HA130后，心肌組織心肌梗死體積減小(P<0.05,Fig 1)，表明LPA可能參與心肌缺血再灌注損傷。

Fig 1 Infarct Volume in each group n=6)

2.2 缺血/再灌注損傷后梗死體積與冠脈流出液中LPA水平成線性相關(guān)與Sham組相比，IR 組冠脈流出液中的LPA含量增加(P<0.05,Fig 2)，且與梗死體積呈線性相關(guān)，提示心臟缺血/再灌注損傷可誘導(dǎo)LPA釋放增加；給與LPA合成抑制劑HA130后測量血清和冠脈流出液中LPA，均未測得結(jié)果，低于試劑盒檢測范圍(數(shù)據(jù)未顯示)，說明HA130可以有效的抑制LPA的合成。

Fig 2 Level of LPA in coronary effluent after ischemia-reperfusion injury n=6)

2.3 各組不同時間點冠脈流出液中LDH與Sham組相比，IR組再灌注各個時間點冠脈流出液中LDH水平升高(P<0.05,Fig 3)；與IR組相比，加入外源性LPA后再灌注各個時間點冠脈流出液中LPA水平繼續(xù)上升(P<0.05,Fig 3)；與IR組相比，給與LPA合成抑制劑HA130后再灌注后各個時間點冠脈流出液中LDH水平降低，表明LPA能夠加重心肌缺血/再灌注損傷，抑制缺血和再灌注過程中的LPA釋放能夠減輕心肌缺血/再灌注損傷。

Fig 3 Level of LDH in coronary effluent at different time points n=6)

2.4 各組小鼠心臟pTRPV1/TRPV1、Bcl-2/Bax蛋白表達與Sham組相比，IR組心肌組織pTRPV1及TRPV1蛋白表達量增加，凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05,Fig 4)；與IR組相比，LPA組心肌組織pTRPV1及TRPV1蛋白表達均明顯增加，Bcl-2/Bax比值進一步降低(P<0.05,Fig 4)；與IR組相比，HA130組心肌組織pTRPV1及TRPV1蛋白水平降低，Bcl-2/Bax比值增加(P<0.05,Fig 4)，表明LPA可影響缺血/再灌注過程中心臟TRPV1蛋白表達和凋亡信號。

Fig 4 The protein levels of pTRPV1,TRPV1 and Bcl-2/Bax

3 討論

心肌缺血/再灌注損傷嚴重影響患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，目前已有大量研究以IRI發(fā)生機制的不同環(huán)節(jié)為靶點，研究開發(fā)防治缺血后心肌損傷的方法，但目前臨床上仍缺乏公認有效的心肌保護策略[10]。因此，深入研究和尋找新的特異性分子靶點，保護缺血心肌免受再灌注損傷，對于促進心肌組織修復(fù)、改善心肌缺血患者預(yù)后具有重要意義。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)，缺血/再灌注損傷過程中LPA釋放顯著增加，且與心肌梗死體積呈線性相關(guān)，說明LPA可能參與心臟IRI。已有研究報道，不同類型的缺血性心臟病患者血漿中LPA水平均顯著升高[4-6]，但升高的LPA對缺血后心肌發(fā)揮何種作用，目前仍不明確。我們發(fā)現(xiàn)當加入外源性LPA 10 μmol·L-1后，心肌梗死體積增大，說明LPA可直接作用于心臟，加重缺血后心肌損傷。LPA的生成依賴于自體趨化蛋白(autotaxin,ATX)，而HA130是一種選擇性ATX抑制劑，靜脈注射HA130可以迅速降低血漿中LPA水平[11]，本研究中提前腹腔注射HA130導(dǎo)致血清和冠脈流出液中的LPA水平均低于試劑盒檢測下限(數(shù)據(jù)未顯示)，同時小鼠心肌梗死體積和LDH水平均明顯下降，說明抑制LPA的合成可以減輕缺血/再灌注損傷，發(fā)揮心肌保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后LPA水平升高可作用于心肌鈣通道或鉀通道，增加鈣離子或鉀離子內(nèi)流，從而引發(fā)心律失常[6]，在氧化應(yīng)激下LPA對心室肌細胞動作電位和鈣內(nèi)流的作用發(fā)生改變，進一步增加室性心律失常發(fā)生的風(fēng)險[12]。Nieto-Posadas等[13]發(fā)現(xiàn)LPA可結(jié)合TRPV1受體C-末端特異性位點，激活TRPV1受體引起通道開放和神經(jīng)元電流增強。TRPV1作為一種細胞應(yīng)激感受器[14]，可感受缺氧、炎癥、酸性環(huán)境、有害代謝產(chǎn)物等各種細胞外有害刺激，通道開放后大量鈣、鈉離子內(nèi)流，繼而激活下游信號通路。近年研究發(fā)現(xiàn)TRPV1在心血管系統(tǒng)中表達，如血管平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞等，在動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭、血管重塑等疾病中發(fā)揮重要作用，已成為心血管疾病防治和藥物研發(fā)的重要靶點[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)心肌IRI可增加磷酸化和非磷酸化TRPV1蛋白表達，說明TRPV1的表達量和活性均增強，而加入外源性的LPA進一步增強TRPV1信號，相反HA130則可抑制TRPV1表達與活性，表明缺血/再灌注損傷過程中釋放的LPA可能作用于TRPV1受體。凋亡蛋白Bcl-2/Bax 比值可以反映心肌細胞凋亡情況，本研究中外源性LPA可降低Bcl-2/Bax比值，而HA130可逆轉(zhuǎn)該比值的下降，進一步表明LPA可通過影響細胞凋亡參與心肌缺血再灌注損傷。

綜上所述，小鼠離體心臟缺血再灌注誘導(dǎo)LPA釋放增加，LPA水平升高可引起心肌梗死體積增加，心肌損傷加重，而抑制LPA的生成可明顯減輕心肌缺血再灌注損傷，其機制可能與調(diào)控TRPV1受體表達及凋亡信號有關(guān)。